用于調節血管發生和周細胞包裹的基于alk1拮抗劑的方法和組合物的制作方法【專利摘要】本發明涉及用于調節血管發生和周細胞包裹的基于ALK1拮抗劑的方法和組合物。在一些方面，本公開內容涉及以下見解，即包含激活蛋白樣激酶I(ALK1)多肽細胞外區域之配體結合部分的多肽可用于抑制體內(特別是在患有血管發生相關疾病的哺乳動物中)血管發生。此外，本公開內容證實ALK1的抑制劑可用于提高血管化組織(包括腫瘤和視網膜)的周細胞包裹。本公開內容還鑒定了ALK1的配體，并證實這些配體具有促血管發生活性，同時描述了抑制受體?配體相互作用的抗體。【專利說明】用于調節血管發生和周細胞包裹的基于ALK1拮抗劑的方法和組合物[00011本申請是申請號為20580的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/US2009/002699的中國國家階段申請。[0002]相關申請[0003]根據美國35USC§119法案，本申請要求2008年5月2日提交的美國臨時申請61/050，168以及2009年1月12日提交的臨時申請61/144,131之申請日的權益，兩者內容均通過引用并入本文中。
技術領域：
[0004]本發明涉及用于調節血管發生和周細胞包裹的基于ALKl拮抗劑的方法和組合物。【
背景技術：
】[0005]血管發生是形成新血管的過程，其對于許多正常和異常的生理狀態來說是很關鍵的。在正常的生理狀況下，人和動物在特定的和局限的情況下經歷血管發生。例如，通常在創傷愈合、胚胎發育以及黃體、子宮內膜和胎盤的形成中觀察到血管發生。[0006]許多疾病中存在不期望的或調節不當的血管發生，其中異常的內皮生長可導致或參與病理過程。例如，血管發生參與許多腫瘤的生長。失調的血管發生涉及到病理過程中，例如類風濕性關節炎、視網膜病、血管瘤和銀肩病。已將存在失控之血管發生的各種病理疾病狀態歸類為血管發生相關疾病。[0007]認為受控和失控的血管發生均以類似方式的進行。毛細血管主要由內皮細胞和周細胞(pericyte)組成，其周圍是基膜(basementmembrane)。血管發生開始于由內皮細胞和白細胞釋放的酶對基膜的侵蝕。隨后，沿血管腔排列的內皮細胞從基膜穿出。血管發生因子誘導內皮細胞穿過被侵蝕的基膜迀移。迀移細胞形成從母血管伸出的"芽"，內皮細胞在此處進行有絲分裂和增殖。內皮細胞芽彼此融合從而形成毛細血管袢，產生新血管。[0008]已證實抑制血管發生的物質可有效治療多種疾病。阿瓦斯丁(Avastin)?(貝伐單抗(bevacizumab))---種結合血管內皮生長因子(VEGF)的單克隆抗體--已被證實有效治療多種癌癥。麥可凈(Macugen)?---種結合VEGF的適配體(aptamer)--已被證實有效治療新生血管性(濕性)年齡相關黃斑變性。SDF/CXCR4信號傳導途徑的拮抗劑抑制腫瘤新血管生成，并有效抗御小鼠模型中的癌癥(Guleng等，CancerRes.2005年7月1日；65(13):5864-71)。異香豆素2-(8-羥基-6-甲氧基-1-氧代-1H-2-苯并吡喃-3-基)丙酸(NM-3)作為口服生物可利用的血管發生抑制劑已完成I期臨床評估。匪-3在體外直接殺傷內皮細胞和腫瘤細胞，并有效治療小鼠中的多種人類腫瘤異種移植物（Agata等，CancerChemotherPharmacol·2005年12月；56(6):610-4)。沙利度胺（thalidomide)和相關化合物已顯示出治療癌癥的有益作用，并且盡管其分子作用機制尚不清楚，但是對血管發生的抑制似乎是抗腫瘤作用的重要組成部分(參見例如Dredge等，MicrovaseRes.2005年1月；69(1-2):56-63)^^-(1拮抗劑在治療類風濕性關節炎上的成功部分是因為對炎癥關節組織的抗血管發生作用(Feldmann等，AnnuRevImmunol.2001;19:163-96)。普遍預期抗血管發生療法對其它炎性疾病(特別是銀肩病)具有有益療效。盡管許多抗血管發生劑對血管發生具有作用（不論受影響組織為何），然而另一些血管發生劑可能傾向于具有組織特異性作用。[0009]周細胞是組成血管的細胞類型之一，與其一起組成血管的還有內皮細胞和平滑肌細胞。中樞神經系統中周細胞與內皮細胞的比值最高，并且認為周細胞在血腦屏障中起重要作用。糖尿病性視網膜病以視網膜微血管的周細胞缺失為標志，而且認為這種周細胞缺失對疾病進展起重要的病理生理作用。[0010]期望擁有用于抑制血管發生和用于提高血管化組織中周細胞包裹的另一些組合物和方法。這些包括可普遍地或者在某些組織中和/或疾病狀態下抑制血管不利生長的方法和組合物。【
發明內容】[0011]-方面，本公開內容提供對激活蛋白樣激酶I(activin-likekinaseI，ALK1)介導之調節系統的表征，以及該系統在體內血管化組織的血管發生和調節周細胞包裹中的作用。在某些方面，本公開內容提供了ALK-I配體的拮抗劑以及這些拮抗劑作為抗血管發生劑或者提高周細胞包裹的用途。另外，本公開內容提供了ALK-I自身的拮抗劑，以及這樣的拮抗劑作為抗血管發生劑的用途。如本文所述，ALKl是⑶F5配體群(包括⑶F6和⑶F7)的受體，也是BMP9配體群(包括BMP10)的受體。本公開內容證實了由ALKl和上述配體介導的信號傳導參與體內血管發生，以及抑制該調節系統具有強效的抗血管發生作用。此外，本公開內容證實了抑制ALKl調節系統導致血管化組織中提高的周細胞包裹。因此，在某些方面，本公開內容提供了用于抑制血管發生的ALKl調節系統的拮抗劑，包括所述受體或者一種或多種配體的拮抗劑。在某些方面，本公開內容提供了ALKl配體的拮抗劑，其用于治療癌癥(特別是多發性骨髓瘤、黑素瘤、肺癌、胰腺癌(特別是胰腺內分泌組織腫瘤）、乳腺癌(例如，原發性乳腺癌或轉移性乳腺癌;雌激素受體陽性(ER+)或雌激素受體陰性(ER-)))、類風濕性關節炎、眼部病理性血管發生相關疾病以及與血管化組織中周細胞缺失相關的疾病(如糖尿病性視網膜病）。[0012]在某些方面，本公開內容提供了用于抑制血管發生的包含ALKl細胞外結構域之配體結合部分的多肽（"ALK1ECD多肽"）。不希望受任何特定作用機制的約束，預期這樣的多肽通過結合ALKl配體并抑制這些配體與ALKl以及其它受體相互作用的能力而起作用。在一些實施方案中，ALKlECD多肽包含與人ALKl序列（SEQIDNO:1)之22-118位氨基酸所示序列的同一性至少為70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列。ALKlECD多肽可作為小的單體蛋白或以二聚化形式(例如，表達為融合蛋白）來使用，特別是用于局部施用到組織(例如眼）中。還可將ALKlE⑶與另一多肽部分融合以提供改進的性質(例如提高的半衰期或者更易于生產或純化）。與免疫球蛋白的Fc部分融合或者與聚氧乙烯部分（例如，聚乙二醇）連接可對全身施用（靜脈內、動脈內和腹膜內施用）時提高ALKlE⑶多肽的血清半衰期特別有用。如本文所證明地，全身性施用ALKl-Fc多肽在眼中具有強效的抗血管發生作用，還在類風濕性關節炎和多種腫瘤的小鼠模型中提供了積極作用。在一些實施方案中，ALKl-Fc融合蛋白包含具有與SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列的同一性至少為70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列的多肽，其中使用或不使用間插接頭將所述多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于1><1〇1的&結合0^5、0^7和81039，并且以大于1\1〇1勺&結合丁6邱-1。可以選擇適于生物體的Fc部分。任選地，Fc部分是人IgGl的Fc部分。在一個優選的實施方案中，所述ALKl-Fc融合蛋白包含SEQIDNO:1的22-118位氨基酸。任選地，所述ALKl-Fc融合蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。任選地，所述ALKl-Fc融合蛋白是在哺乳動物細胞系(特別是中國倉鼠卵巢（CHO)細胞系）中由SEQIDN0:4之核酸的表達所產生的蛋白質。ALKl-ECD多肽可配制為基本上不含熱原的藥物制備物。該藥物制備物可制備用于全身遞送(例如，靜脈內、動脈內或皮下遞送)或局部遞送(例如，遞送至眼）。[0013]在一些方面，本公開內容確認了開發治療用的相對均一的ALKl-Fc融合蛋白制劑的困難。如本文所述，ALKl-Fc融合蛋白傾向于聚集成更高級的多聚體。本公開內容提供了這些困難的解決方法，并因此提供了包含ALKl-Fc融合蛋白的藥物制劑，其中該制劑中至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%由二聚體ALKl-Fc融合蛋白組成。因此，在一些方面中，本公開內容提供了包含如下ALKI-Fc融合蛋白的藥物制劑，所述ALKI-Fc融合蛋白包含氨基酸序列與SEQIDNO:1的22-118位氨基酸序列具有至少97%同一性的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，且其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于IXHT7M的Kd與GDF5、GDF7和BMP9結合，以大于IX10-6的Kd與TGF0-1結合，而且其中至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的ALKl-Fc融合蛋白以二聚體形式存在。所述ALKl-Fc融合蛋白的Fc部分可以為人IgGl的Fc部分。所述ALKl-Fc融合蛋白可包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。所述ALKl-Fc融合蛋白可通過在哺乳動物細胞系(特別是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系）中表達SEQIDN0:4之核酸而產生。這種藥物制劑可配制成適于向眼部施用(特別是通過注射來實現）。所公開的藥物制劑可用于本文表述的多種治療目的，包括抑制血管發生、治療腫瘤、治療類風濕性關節炎、治療與血管發生相關的眼部疾病以及治療與血管化組織中周細胞包裹缺失相關的疾病(例如糖尿病性視網膜病）。所述ALKl-Fc藥物制劑可與抑制血管發生的另一藥劑(例如VEGF拮抗劑(如阿瓦斯丁、索拉非尼(sorafenib)和VEGF受體誘捕劑））聯用。[0014]本公開內容證實ALKl信號傳導途徑的拮抗劑提高血管化組織中的周細胞包裹。因此，本公開內容提供了促進哺乳動物血管化組織中周細胞包裹提高的方法。這樣的拮抗劑可為本文所述的任何拮抗劑(包括ALKlE⑶蛋白（例如，ALKl-Fc)、DAN蛋白）和靶向ALKl及其任何配體(包括BMP9、BMP10、GDF5、⑶F6和⑶F7)的抗體。在一些方面中，本公開內容提供了在有此需要的哺乳動物中促進血管化組織中周細胞包裹提高的方法，該方法包括向哺乳動物施用有效量的ALKlECD蛋白。所述ALKlECD蛋白可以是ALKl-Fc融合蛋白，并且所述ALKl-Fc融合蛋白可包含氨基酸序列與SEQIDNO:1的22-118位氨基酸序列具有至少90%同一性的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中ALKl-Fc融合蛋白以大于IXI(T6的Kd與TGF0-1結合。所述ALKIECD蛋白可與選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10的一種或多種ALKl配體結合。所述ALKlE⑶多肽可包含與SEQIDNO:1的34-95位氨基酸對應的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。所述ALKlECD可包含由如下核酸編碼的氨基酸序列，所述核酸在嚴格的雜交條件下與SEQIDN0:2之100-285位核苷酸雜交或者與編碼相同氨基酸序列的SEQIDN0:2之100-285位核苷酸的變體雜交。所述ALKl-Fc融合蛋白可具有SEQIDNO:3的序列。所述ALKlECD融合蛋白可通過靜脈內遞送或局部遞送至眼部。在一些方面中，本公開內容提供了在有此需要的哺乳動物中促進血管化組織中周細胞包裹提高的方法，該方法包括向哺乳動物施用有效量的如下抗體，所述抗體與由SEQIDNO:1之22-118位氨基酸組成的ALKl多肽結合并抑制選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10的至少一種ALK1配體的結合。所述抗體可以以小于5XI(T8M、小于IXHT9M或小于IX的Kd與ALKl多肽結合。所述抗體可抑制ALKl與ALKl配體的結合，其中所述ALKl配體選自BMP9和BMPlO。所述抗體可通過靜脈內或眼內遞送。WO2007/040912中所述的抗體可用于此方法中。所述ALKl信號傳導拮抗劑可與另一抑制血管發生的藥劑(如VEGF拮抗劑)一起施用。待治療的哺乳動物可患有糖尿病性視網膜病或以視網膜血管中周細胞包裹缺失為特征的其它視網膜疾病或選自以下的腫瘤:黑素瘤、肺腫瘤、多發性骨髓瘤、胰腺腫瘤（如胰腺內分泌組織腫瘤)和乳腺癌（例如，原發性乳腺癌或轉移性乳腺癌;雌激素受體陽性(ER+)或雌激素受體陰性(ER-))。[0015]在一些方面中，本公開內容提供了用于抑制哺乳動物中血管發生的方法，其通過施用本文一般性或具體描述的任何ALKlECD多肽來實現。在一個實施方案中，方法包括向哺乳動物施用有效量的ALKl-Fc融合蛋白，其中所述ALKlFc融合蛋白包含具有與SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列的同一性至少為90%的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXIO-6的Kd結合TGFI3-1。任選地，所述ALKl-Fc融合蛋白結合選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO的一種或多種ALKl配體。任選地，所述ALKl-Fc融合蛋白具有SEQIDNO:3的序列。所述ALKlE⑶多肽可以局部遞送(例如，遞送至眼）或全身遞送(例如，靜脈內、動脈內或皮下）。在一個具體實施方案中，本公開內容提供了用于抑制哺乳動物眼中血管發生的方法，其通過在遠離眼的位置向哺乳動物施用ALKl-Fc蛋白來實現，例如通過全身施用。[0016]在一些方面中，本公開內容提供了與ALKl(特別是位于細胞外結構域(SEQIDNO:1的22-118位氨基酸）中的表位)結合并抑制八1^1與選自60?5、60?6、60?7、81039和810310的至少一種ALKl配體結合的抗體。基于這些配體對ALKl的親和力，抗體可以以小于5XHT8M(任選地5XHT8~IXI(Tlti)的Kd結合。預期親和力在該范圍內的抗體抑制⑶F5、6和7中一種或多種的信號傳導，而對BMP9和10的信號傳導具有較小影響。這樣的抗體優選地抑制由選自GDF5、⑶F6和⑶F7的至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。不希望受特定機制的約束，預期這樣的抗體會通過直接抑制ALKl活性來起作用，這應當與ALKl-Fc融合蛋白的活性相對，后者預期抑制ALK1配體的活性。預期抗ALK1抗體不干擾GDF5、⑶F6、⑶F7、BMP9或BMP10經由替代性受體系統（例如BMPRla、BMPRlb和BMRII復合物）進行信號傳導的能力。然而，預期抗ALKl抗體會干擾ALKl的低親和力配體(例如TGF-β，一般認為，盡管結合相當弱但其仍經由ALK-I誘發重要的信號傳導事件)經由ALKl進行信號傳導的能力，盡管ALKlE⑶可能不結合或抑制這樣的低親和力配體。抗體可以以小于IXHT1t3M的Kd結合ALKl多肽。預期親和力在該范圍內的抗體抑制BMP9或10的信號傳導。這樣的抗體優選地抑制BMP9和BMP10與ALK1的結合。值得注意地，基于本文公開的數據，與ALKl結合相對較弱的抗體可抑制TGFP結合ALKl，而不能抑制更緊密的結合配體例如⑶F5或BMP9。本文所述的抗體優選為重組抗體，意為從利用分子生物學技術構建的核酸表達而來的抗體，例如人源化抗體或者從單鏈抗體開發而來的完全人抗體。Fv、Fab和單鏈抗體也包括在術語"重組抗體"的范疇內。抗體也可以是多克隆抗體或非重組型單克隆抗體(包括人或小鼠的形式，以及從轉基因小鼠獲得的人抗體）。抗體和ALKl-ECD多肽可配制為基本上不含熱原的藥物制備物。所述藥物制備物可制備用于全身遞送（例如，靜脈內、動脈內或皮下遞送）或局部遞送（例如，遞送至眼）。卵2007/040912中所述的抗體可用于本文所述的各方法中。[0017]在一些方面中，本公開內容提供了用于抑制哺乳動物中血管發生的方法，其通過向哺乳動物施用本文一般性或具體描述的的與ALKl多肽結合的有效量抗體來實現。可用于該目的的抗體可結合ALKl的細胞外結構域(例如，結合由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成的多肽)或ALKl的另一部分。所述抗體可結合由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成的多肽并抑制選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10中至少一種ALK1配體的結合。所述抗體可以以小于5X10-8Μ(任選地5XHT8~IXI(Tlti)的Kd結合ALKl多肽。所述抗體可抑制由選自⑶F5、⑶F6和⑶F7中至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。相對于ΒΜΡ9或10的信號傳導而言選擇性抑制⑶F5、GDF6或⑶F7所介導之信號傳導的抗體可用作⑶F5、6或7所定位的組織(主要是骨或關節）中所發生的血管發生的選擇性抑制劑。所述抗體可以以小于IXHT1t3M的Kd結合ALK1多肽。所述抗體可抑制ALK1與ALKl配體的結合，其中所述ALKl配體選自BMP9和BMP10。所述抗ALKl抗體可局部遞送(例如，遞送至眼）或全身遞送(例如，靜脈內、動脈內或皮下）。在一個具體的實施方案中，本公開內容提供了通過施用抗ALKl抗體來抑制哺乳動物眼中血管發生的方法。在另一具體實施方案中，本公開內容提供了用于治療患多發性骨髓瘤的患者的方法。在一個具體實施方案中，本公開內容提供了用于抑制如下疾病中血管發生的方法，所述疾病與多種促血管發生因子(例如，VEGF、PDGF和/或FGF)導致的病理性血管發生有關。[0018]在一些方面中，本公開內容提供了與本文公開之ALKl配體結合并抑制所述ALKl配體與ALKl結合的抗體。不希望受任何特定機制的約束，預期與ALKl配體結合的抗體具有實際上類似于ALKlECD多肽的作用，因為這兩類物質都結合所述配體，而非結合所述受體本身。在一些實施方案中，所述抗體結合選自GDF5、GDF6和GDF7的配體。所述抗體可以以小于5XKT8M的Kd結合ALKl配體。可選擇所述抗體用于抑制由ALKl配體刺激的血管發生。CAM測定是適于選擇期望抗體的測定系統。這樣的抗體優選為重組抗體，并可配制為基本不含熱原的藥物制備物。所述藥物制備物可制備用于全身遞送(例如，靜脈內、動脈內或皮下遞送)或局部遞送(例如，遞送至眼）。[0019]在一些方面，本公開內容提供了結合ALKl配體并抑制ALKl配體與ALKl結合的抗體，其中所述ALKl配體選自BMP9和BMP10。所述抗體可以以小于IX10-iqM的Kd結合ALKl配體。這樣的抗體優選為重組抗體，并可配制為基本不含熱原的藥物制備物。所述藥物制備物可制備用于全身遞送(例如，靜脈內、動脈內或皮下遞送)或局部遞送(例如，遞送至眼）。[0020]在一些方面中，本公開內容提供了抑制哺乳動物中血管發生的方法，該方法包括向哺乳動物施用與ALK1配體結合并抑制所述ALK1配體結合ALK1的有效量的抗體，其中所述ALK1配體選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10。所述抗體可抑制由選自⑶F5、GDF6和⑶F7的至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。[0021]BMP/GDF家族的成員（包括81039、810310、60?5、0^6和0^7)與1型和11型受體結合從而形成有功能的信號傳導復合物。這些受體的結合位點是不一樣的。因此，在一些實施方案中，與ALKl配體結合并抑制所述配體與ALKl結合的抗體是在該配體的I型受體結合位點處或其附近結合的抗體。[0022]在一些方面中，本公開內容提供了用于抑制哺乳動物中血管發生的方法，其通過施用本文公開的ALKl信號傳導系統的其它抑制劑來實現。這樣的抑制劑可包括降低ALKl、GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9或BMP10產生的核酸(例如，反義或RNAi構建體）。也可使用各種親和性結合試劑，例如可通過修飾而結合所選靶標的適配體、隨機肽、蛋白支架(所述支架的實例包括anticalin和FNIII結構域）；在每種情形中，選擇能夠破壞本文公開之ALKl調節系統的親和性結合試劑，其或者通過破壞ALKl-配體相互作用或者通過抑制結合后所發生的信號傳導來實現。[0023]在另一實施方案中，本公開內容描述了DAN作為ALKl調節系統之調節劑的作用。如本文所示，DAN結合GDF5配體群，但不結合BMP9配體群。因此，預計DAN抑制由GDF5、GDF6或⑶F7介導的血管發生，但不抑制由BMP9或BMPlO介導的血管發生。因此，DAN可用作在主要表達GDF5蛋白質群的骨或關節中抑制血管發生的選擇性試劑。因此，在一些實施方案中，本公開內容提供了DAN蛋白用作在骨或關節血管發生背景下的抗血管發生劑，包括類風濕性關節炎和涉及骨或關節的癌癥（例如多發性骨髓瘤和骨轉移）JAN蛋白通常結合選自GDF5、GDF6和⑶F7的一種或多種ALKl配體，而與BMP9或BMPlO的結合相對較弱。DAN蛋白可包含與對應于SEQIDNO:10之17-180位氨基酸（成熟的人DAN)或SEQIDNO:10之21-125位氨基酸(DAN的保守性半胱氨酸結（cysteineknot)結構域）的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。DAN蛋白還可由核酸編碼，所述核酸包含其互補物在嚴格雜交條件下與下列序列雜交的序列：SEQIDN0:11的153-467位核苷酸、或具有相同編碼序列的SEQIDNO:11之153-467位核苷酸的變體（"沉默"變體，例如在三聯體密碼的擺動位置(wobbleposition)包含一個或多個改變的變體），或者SEQIDNO:11的93-635位核苷酸或其沉默變體。在一些方面中，所述DAN蛋白是融合蛋白，例如Fc融合蛋白。盡管預期DAN特別有用于抑制骨和關節中的血管發生(包括位于骨或關節中的腫瘤，例如多發性骨髓瘤和骨轉移），但是它也可用于其它方面，例如位于其它部位的腫瘤，或眼中的腫瘤。[0024]在一些方面中，本公開內容提供了用于治療哺乳動物中類風濕性關節炎的方法，該方法包括向患類風濕性關節炎的哺乳動物施用有效量的選自下列的試劑:ALKlECD蛋白；結合ALKl配體并抑制ALKl配體與ALKl結合的抗體，其中所述ALKl配體選自⑶F5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10;結合ALK1多肽并抑制與選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10的至少一種ALKl配體結合的抗體，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成;DAN多肽。[0025]在一些方面中，本公開內容提供了用于治療哺乳動物中腫瘤的方法。這樣的方法可包括向患腫瘤的哺乳動物施用有效量的選自以下的試劑:ALKlE⑶蛋白（例如，ALKl-Fc);結合ALK1配體并抑制ALK1配體與ALK1結合的抗體，其中所述ALK1配體選自⑶F5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10;結合ALK1多肽并抑制與選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10的至少一種ALK1配體結合的抗體，所述ALK1多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成;DAN多肽。該方法還可包括施用抑制血管發生的另一試劑。所述腫瘤可以是與骨有關的腫瘤，例如白血病、骨髓腫瘤、多發性骨髓瘤或骨轉移，例如常常與乳腺癌或前列腺癌有關的那些。腫瘤可以是黑素瘤、肺癌腫瘤、胰腺腫瘤(如胰腺內分泌組織腫瘤)或乳腺癌(如原發性乳腺癌或轉移性乳腺癌）。乳腺癌可以是雌激素受體陽性(ER+)或雌激素受體陰性(ER-)。腫瘤還可以是利用多種促血管發生因子的腫瘤，例如對于抗VEGF療法具有抗性的腫瘤。[0026]在一些方面中，本公開內容提供了眼藥制劑。這樣的制劑可包含選自以下的試劑：ALKlECD蛋白；結合ALKl配體并抑制ALKl配體與ALKl結合的抗體，其中所述ALKl配體選自GDF5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10;結合ALKl多肽并抑制與選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO的至少一種ALKl配體結合的抗體，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成；DAN多肽。[0027]在一些方面中，本公開內容提供了用于治療血管發生相關的眼病的方法。這樣的方法可包括全身施用或者向所述眼睛施用包含有效量的選自下列之試劑的藥物制劑:ALK1ECD蛋白；結合ALKl配體并抑制ALKl配體與ALKl結合的抗體，其中所述ALKl配體選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMP10;結合ALKl多肽并抑制與選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO的至少一種ALKl配體結合的抗體，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成;DAN多肽。[0028]在每種情形中，可將本文所述的試劑與抑制血管發生的另一試劑聯用。在期望抑制腫瘤的血管發生時，可將所述試劑與具有抗癌作用的另一試劑聯用，所述另一試劑例如化療試劑或生物抗癌劑。[0029]本公開內容還提供了包含ALKl-Fc融合蛋白的眼科藥物制劑，所述融合蛋白具有與SEQIDNO:1的22-118位氨基酸所示序列同一性至少為97%、98%或99%的氨基酸序列，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白與GDF5、GDF7和BMP9以小于IXHT7M的Kd結合，與TGFiM以大于IXHT6的Kd結合。在一個實施方案中，所述融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。在一個實施方案中，所述Fc部分來自人IgGl。在一個實施方案中，所述融合蛋白通過在哺乳動物細胞系中表達SEQIDN0:4的核酸而得到。在一個實施方案中，所述細胞系是中國倉鼠卵巢細胞系。所述制劑還可包含一種或多種以下藥物：倍加他尼(pegaptanib)、雷珠單抗(ranibizumab)或糖皮質激素。在一個實施方案中，所述制劑基本不含熱原。[0030]本申請還提供了包含如下抗體的眼科藥物制劑，所述抗體結合由SEQIDN0:1的22-118位氨基酸組成的40(1多肽并抑制與選自0^5、60?6、60?7、81039和810310的至少一種ALKl配體的結合。在一個實施方案中，所述抗體抑制由選自GDF5、GDF6和GDF7的至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。在一個實施方案中，所述抗體以小于5XKT8M的Kd結合ALKl多肽。在另一實施方案中，所述抗體以小于IXHT1t3M的Kd結合ALKl多肽。在一個實施方案中，所述抗體抑制由⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9或BMPlO刺激的血管發生。所述制劑還可包含一種或多種以下藥物:倍加他尼、雷珠單抗或糖皮質激素。在一個實施方案中，所述制劑基本不含熱原。[0031]在一些方面中，本公開內容提供了包含如下抗體的眼科藥物制劑，所述抗體結合本文公開的ALKl配體并抑制所述ALKl配體與ALKl的結合。在一些實施方案中，所述抗體結合選自GDF5、⑶F6和⑶F7的配體。所述抗體可以以小于5XHT8M的Kd結合ALKl配體。可選擇所述抗體用于抑制由ALKl配體所刺激的血管發生。CAM測定是適于選擇理想抗體的測定系統。這樣的抗體優選為重組抗體。所述制劑還可包含一種或多種以下藥物:倍加他尼、雷珠單抗或糖皮質激素。在一個實施方案中，所述制劑基本不含熱原。[0032]本申請還提供了治療血管發生相關眼病的方法，該方法包括向所述眼睛施用包含ALKl-Fc融合蛋白的眼科藥物制劑，所述融合蛋白包含具有與SEQIDNO:1的22-118位氨基酸所示序列同一性至少為97%、98%或99%的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于IXHT7M的Kd與⑶F5、⑶F7和BMP9結合，以大于IX10-6的Kd與TGF0-1結合。在一個實施方案中，所述融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。在一個實施方案中，所述Fc部分來自人IgGl。在一個實施方案中，所述融合蛋白通過在哺乳動物細胞系中表達SEQIDN0:4的核酸而得到。在一個實施方案中，所述細胞系是中國倉鼠卵巢細胞系。所述制劑還可包含一種或多種以下藥物:倍加他尼、雷珠單抗或糖皮質激素。在一個實施方案中，所述制劑基本不含熱原。[0033]本申請還提供了治療血管發生相關眼病的方法，該方法包括向所述眼睛施用包含如下抗體的眼藥制劑，所述抗體結合由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成的ALKl多肽并抑制與選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMPlO的至少一種ALKl配體的結合。在一個實施方案中，所述抗體抑制由選自GDF5、⑶F6和⑶F7的至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。在一個實施方案中，所述抗體以小于5XHT8M的Kd結合ALKl多肽。在另一實施方案中，所述抗體以小于IX10-iqM的Kd結合ALKl多肽。在一個實施方案中，所述抗體抑制由⑶F5、GDF6、GDF7、BMP9或BMPlO所刺激的血管發生。所述制劑還可包含一種或多種以下藥物:倍加他尼、雷珠單抗或糖皮質激素。在一個實施方案中，所述制劑基本不含熱原。[0034]在所公開方法的一個實施方案中，所述血管發生相關疾病選自腫瘤、對于抗VEGF療法具有抗性的腫瘤、多發性骨髓瘤、已轉移至骨的腫瘤、關節或骨的炎癥、類風濕性關節炎、糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶狀體后纖維增生癥。【附圖說明】[0035]圖1顯示人激活蛋白樣激酶1一一ALKl的氨基酸序列（SEQIDNO:1)。單下劃線表示預測的細胞外結構域。雙下劃線表示細胞內結構域。信號肽和跨膜結構域未用下劃線示出。[0036]圖2顯示人ALKlcDNA的核酸序列（SEQIDN0:2)。編碼序列用下劃線表示。編碼細胞外結構域的部分用雙下劃線表示。[0037]圖3顯示人ALKl的細胞外結構域與Fc結構域融合的實例（SEQIDNOdhhALKl-Fc蛋白包含C端與接頭(下劃線表示)和IgGlFc區域融合的人ALKl蛋白22-120位氨基酸。[0038]圖4顯示表達SEQIDN0:3的hALKl-Fc多肽的核酸序列。還顯示了所編碼的氨基酸序列。由于前導序列被切割，因此Asp22是所分泌蛋白的N端氨基酸。[0039]圖5顯示鼠ALK1-Fc("RAP"）和人ALK1-Fc("ACE"）在內皮細胞管形成測定中的抗血管發生作用。與陽性對照（內皮抑素）相比，在響應于內皮細胞生長添加劑(EndothelialCellGrowthSupplement，ECGF)時所有濃度的RAP和ACE使管形成水平降低得更多。[0040]圖6顯不GDF7在雞絨毛尿囊膜（chickchorioallantoicmembrane，CAM)測定中的血管發生作用。GDF7的作用與VEGF的作用相當。[0041]圖7顯示人ALKl-Fc融合蛋白在CAM測定中的抗血管發生作用。hALKl-Fc抑制由VEGF、FGF和⑶F7刺激的血管發生。[0042]圖8顯示鼠ALKl-Fc(mALKl-Fc)、hALKl-Fc、市售的抗ALKl單克隆抗體(Anti-ALKlmAb)和市售的中和性抗VEGF單克隆抗體相比較的抗血管發生作用。ALKl-Fc構建體的抗血管發生作用與抗VEGF抗體的作用相當。[0043]圖9顯示hALKl-Fc和抗VEGF抗體在體內的抗血管發生作用。利用小鼠角膜微囊袋測定(mousecornealmicropocketassay)測量，hALKl-Fc和抗VEGF抗體對眼中血管發生具有相當的作用。[0044]圖10顯不mALKl-Fc在鼠膠原誘導關節炎（collagen-inducedarthritis，CIA)的類風濕性關節炎模型中的作用。該圖顯示在膠原誘導的雄性DBA/1關節炎小鼠的42天觀察期中測定的平均群體關節炎評分。RAP-041是mALKI-Fc。阿瓦斯丁?是抗VEGF抗體貝伐單抗。[0045]圖11顯示hALKl-Fc(SEQIDN0:3)和來自R&DSystems(Minneapolis，MN)的hALKl-Fc融合蛋白在Superose1210/300GL大小排阻柱（AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)上的分離度。R&DSystems的材料含有約13%的聚集蛋白（如圖左側的峰所顯示）以及一些低分子量物質。所述SEQIDN0:3的材料中超過99%由合適分子大小的二聚體組成。[0046]圖12顯示在用PBS(圓圈）和mALKI-Fc(三角形）處理的小鼠中的表達螢光素酶之Lewis肺癌(LL/2-luc)細胞的熒光信號。將腫瘤細胞注射入尾靜脈，并在施用細胞的當天開始處理(PBS或10mg/kgmALKl-Fc，腹膜內，每周兩次）。在第22天處死瀕死的經PBS處理的小鼠。處理組和對照組各由7只動物組成(n=7)。[0047]圖13顯示在胰腺內分泌腫瘤RIPl-Tag2小鼠模型中ALKl和BMP9在不同腫瘤發展階段的表達水平。ALKl表達在血管發生活性最高的階段達到峰值，而BMP9表達在整個腫瘤發展過程中升高。[0048]圖14顯示在RIPl-Tag2小鼠中mALKl-Fc處理對腫瘤生長的作用。從10周齡或12周齡開始，用mALKl-Fc或對照Fc(在每種情況下均為每只小鼠300微克，每周兩次)處理小鼠兩周。mALKl-Fc處理完全阻滯腫瘤生長。[0049]圖15顯示經mALKl-Fc或對照Fc處理的RIPl-Tag2小鼠中腫瘤的血管密度(CD31+細胞）^ALKl-Fc處理將腫瘤的血管密度降低約50%。[0050]圖16顯示經mALKl-Fc或對照Fc處理的RIPl-Tag2小鼠腫瘤血管中的周細胞包裹(NG2+細胞與⑶31+細胞的比值）^ALKl-Fc處理將周細胞包裹升高約100%。[0051]圖17顯示，采用MDA-MB-231細胞系（一種源自ER-乳腺癌細胞的細胞系），mALKl-Fc對同位異種移植模型的作用。在30mg/kg的劑量下，mALKl-Fc對異種移植腫瘤有顯著的生長延遲作用。[0052]圖18顯示，采用MCF7細胞系（一種源自ER+乳腺癌細胞的細胞系），hALKl-Fc對同位異種移植模型的作用。在10或30mg/kg的劑量下，hALKl-Fc對異種移植腫瘤有顯著的生長延遲作用。【具體實施方式】[0053]1.綜述[0054]ALKl是針對TGF-β超家族配體的I型細胞表面受體，也被稱為ACVRLl和ACVRLK1。已提示ALKl可作為TGF-m、TGF-03和BMP-9的受體(Marchuk等，HumMolGenet.2003;Brown等，JBiolChem.2005年7月1日；280(26):25111-8)〇[0055]在小鼠中，ALK1的功能喪失突變導致發育中血管系統的多種異常（0h等，Proc.NatlAcad.Sci.USA2000，97，2626-2631;Urness等，Nat.Genet·2000，26，328-331)ο[0056]在人中，ALKl的功能喪失突變與遺傳性出血性毛細血管擴張（hereditaryhemorrhagictelangiectasia，HHT或Osler-Rendu-Weber綜合征）有關，其中患者發生動靜脈畸形，其導致從動脈直接流向（連通)靜脈(動靜脈短路(arteriovenousshunt))，而不經過中間的毛細血管網（capillarybed)。患HHT患者的典型癥狀包括復發性鼻出血、胃腸道出血、皮膚和皮膚粘膜毛細血管擴張以及肺、腦或肝血管系統的動靜脈畸形(arteriovenousmalformation，AVM)〇[0057]最近來自David等（Blood·2007年3月1日；109(5):1953-61)和Scharpfenecker等(JCellSci.2007年3月15日；120(Pt6):964-72)的出版物得出結論，BMP9和BMP10激活內皮細胞中的ALKl，并且該激活導致內皮細胞增殖和迀移的抑制。這些作用與促血管發生因子（例如VEGF)的作用剛好相反。因此這些出版物得出，BMP9和BMP10自身是抗血管發生因子，并且ALKl活化具有抗血管發生作用。相反地，本公開內容表明BMP9和BMP10的拮抗劑(而非激動劑)具有抗血管發生作用。[0058]本公開內容涉及發現包含ALKl細胞外結構域之一部分的多肽（"ALK1E⑶多肽"）可用于抑制體內血管發生，包括非VEGF依賴性的血管發生以及由多種血管發生因子(包括VEGF、FGF和TOGF)介導的血管發生。在一些方面中，本公開內容鑒定了ALKl的生理性高親和力配體，并表明ALKlE⑶多肽抑制血管發生。該數據表明，ALKlE⑶多肽可發揮抗血管發生作用，即使ALKlE⑶多肽與TGF-βΙ未表現出明顯結合。而且，ALKlE⑶多肽抑制由許多不同促血管發生因子(包括VEGF、FGF和GDF7)刺激的血管發生。因此，本公開內容描述了ALKl調節系統，其中ALKl是⑶F5配體群(包括⑶F6和⑶F7)的受體，也是BMP9配體群(包括BMP10)的受體，其與這兩組配體的親和力不同。此外，本公開內容表明由ALKl和上述配體介導的信號傳導在體內是促血管發生的，在體內抑制該調節系統具有強效的抗血管發生作用。因此，在一些方面中，本公開內容提供了用以抑制血管發生(包括VEGF依賴型血管發生和非VEGF依賴型血管發生）的ALKl調節系統的拮抗劑，包括所述受體或者一種或多種所述配體的拮抗劑。然而，應注意的是，預期針對ALKl自身的抗體具有與ALKlECD多肽不同的作用。預期針對ALKl的泛中和性抗體(pan-neutralizingantibody)(抑制所有強配體和弱配體結合的抗體)抑制這些配體經由ALKl的信號傳導，但預期不會抑制這些配體經由其它受體(例如，在⑶F5-7和BMP9-10情形中的810^1&、810^113、810^11，以及了6邱情形中的了81?1和了81?11)的信號傳導能力。另一方面，預期ALKlECD多肽抑制所有與其緊密結合的配體(對于例如實施例中顯示的構建體，包括GDF5-7和BMP9-10)，但不影響與其弱結合的配體(例如TGF-β)。所以，盡管針對ALKl的泛中和性抗體會阻斷BMP9和TGF-β經由ALKl的信號傳導，但其不會阻斷BMP9和TGF-β經由另一受體的信號傳導；盡管ALKlE⑶多肽可抑制BMP9經由所有受體的信號傳導（即使受體不是ALKl)，但預期其不抑制TGFj經由任何受體（即使是ALKl)的信號傳導。[0059]除非另有指明，本文所述蛋白質是人蛋白質。所述蛋白質的Genbank序列號如下：人GDF5，CAA56874;人GDF6，AAH43222;人GDF7，NP_878248;人BMP9，Q9UK05;人BMP10，095393;人ΟΑΝ,ΒΑΑΘΖΖΘδαΑυα序列列于圖1-5中。[0060]人DAN氨基酸序列（SEQIDN0:10)(GenbankΒΑΑ92265):[0061]MLRVLVOAVLPAMLLAAPPPINKU^LFPPKSAWCEAKWITQIVGHSGCEAKSIQMRftCLqQCFSYgVFJOTF|>$gTE5LVHCPSCMPAQSMWSIVTLECPeHEEVPRVPKLVEKILHCSCQACGKBPSHBGIiSWVQGEDGPGSQPSTHPHPHPHPHPGGQTPEPEOPPQAPHTEEEGAED[0062]成熟的DAN蛋白預期對應于17-180位氨基酸。DAN的保守性半胱氨酸結結構域對應于21-125位氨基酸(下劃線表示）。[0063]人DANcDNA序列（SEQIDN0:ll)(GenbankBC012037):[0064]gccgagcctcctggggcgcccgggcccgcgacccccgcacccagcCccgcaggaccggcgggcgcgcgcgggctctggaggccacgggcatgatgcttcgggtcctggtgggggctgtcctccctgccatgctactggctgccccaccacccatcaacaagctggcactgttcccagataagagtgcctggtgcgaagccaagaacatcacccagatcgtgggccacagcggctgtgagg[0065]ccaagtccatccagaacagggcgtgcctaggacagtgcttcagctacagcgtccccaacaccttcccacagtccacagagtccctggttcactgtgactcctgcatgccagcccagtccatgtgggagattgtgacgctggagtgcccgggccacgaggaggtgcccagggtggacaagctggtggagaagatcctgcactgtagctgccaggcctgcggcaaggagcctagtcacgaggggctgaigrcgt^cfcatgtgcagggegaggacgggccgggatcccagcccggcacceaccGtcacccccatccccacccccaccctggcgggcagacccctgagcccgagg^0ccccctgggsccccccacacagag^aagagggggctgaggactgaggcccccccaactcttcctcccctctcatccccctgtggaatgttgggtctcactctctggggaagtcaggggagaagctgaagcccccctttcrgcactagatggacttggcttcagactcggacttgaatgctgcccggttgccacggagatctgaaggggcggggttaga9ccaagctgcacaatttaatatattcaagagtggcagaggtcttcagggetctfctxfcttggggggggggtggCctcttccCgtctggcttctagagatgtgcctgtgggagggggcfcgagccattgagtgctgggggaggccatccaagatggcatgaatcgggctaaggtccctgggggtgcagatggtactgctgaggtcccgggcttagtgtgagcatcttgccagcctcaggcttgaggga^sgctgggctagaaagaccactggcagaaacaggaggctccg^ccccacaggtttccccaaggcctctcaccccacttcccatctccagggaagcgtcgccccagtggcactgaagtggccctccctcagcggaggggtttgggagtcaggcctgggcaggaccctgctgactcgtggcgcgggagctg39fa-gccaggctctccgggcctttctctggcttccttggctrtgcctggtgaggaggggaagaaggaaagggaagagtcttccaaggccagaaggagggggacaaccccccaagaccatccctgaagacgagcatccccctcctctccctgttagaaatgctagtgccccgcactgtgccccaagttctaggccccccagaaagctgtcagagccggccgccttctcccctctcccagggatgctctttgtaaatatcggatgggtgtgggagcgaggggttacctccctcgccccaaggttccagaggccctiaggcgggatgggc^cgctgaacctcgaggaactccaggacgaggaggacatgggacttgcgtggacagtcagggttcactcgggctctctctagctccccaattctgcctgcctcctccctcccagctgcacfcttaaccctagaaggtgsggacctggggggagggacagggcaggcgggcccatgaagaaagcccctcgttgcccagcactgtctgcgtctgctcttctgtgcccagggtggctgccagcccacfcgcctcctgcctggggtggcctggccctcctggctgttgcgacgcgggcttctggagcttgtcaccattggacagtctccctgatggaccctcagtcttctcatgaataaattccctcaacgccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa[0066]DAN前體的編碼序列對應于93-635位核酸。成熟DAN蛋白的編碼序列對應于141-632位核酸。DAN的保守性半胱氨酸結部分的編碼序列對應于153-467位核酸。[0067]本說明書中使用的術語在本公開內容的上下文中以及在每個術語使用的特定上下文中一般具有本領域的普通含義。某些術語在說明書中進行了論述，從而向實施者提供有關描述本文公開的組合物和方法以及如何制備和使用它們的額外指導。從術語使用的特定上下文，該術語之任何用途的范圍或含義將是顯而易見的。[0068]2.可溶性ALKl多肽[0069]天然ALKl蛋白是跨膜蛋白質，該蛋白的一部分位于細胞外(細胞外部分），一部分位于細胞內（細胞內部分）。本公開內容的多個方面包括含有ALKl細胞外結構域之一部分的多肽。[0070]在一些實施方案中，本公開內容提供了"ALK1E⑶多肽"。術語"ALK1E⑶多肽"意指由天然ALKl多肽細胞外結構域的氨基酸序列組成或者包含其的多肽(其包括或不包括任何信號序列和信號序列N端的序列），或者意指與天然ALKl多肽細胞外結構域具有至少33%同一性的氨基酸序列，任選地與天然ALKl多肽細胞外結構域具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99或100%同一性，例如SEQIDNO:1的34-95位氨基酸的半胱氨酸結區域或者半胱氨酸結加細胞外結構域之N-端和C-端的額外氨基酸(例如SEQIDN0:1的22-118位氨基酸）。同樣，ALKlECD多肽可包含由SEQIDN0:2的100-285位核苷酸或其沉默變體或者在嚴格雜交條件（一般地，這樣的條件是本領域已知的，例如可包括于65°C在50%(體積/體積）甲酰胺、5XSSC、2%(重量/體積)封閉劑、〇.I%N-十二烷基肌氨酸、0.3%SDS中過夜雜交，并例如于約65°C在5XSSC中清洗)下與其互補物雜交的核酸所編碼的多肽。此外，ALKlE⑶多肽可包含由SEQIDNO:2的64-384位核苷酸或其沉默變體或者在嚴格雜交條件(一般地，這樣的條件是本領域已知的，例如可包括于65°C在50%(體積/體積）甲酰胺、5XSSC、2%(重量/體積)封閉劑、0.1%N-十二烷基肌氨酸、〇.3%SDS中過夜雜交，并例如于65°C在5乂55(：中清洗)下與其互補物雜交的核酸所編碼的多肽。因此，術語"ALK1ECD多肽"包含ALKl多肽的分離的細胞外部分、其變體(包括含有在對應于SEQIDNO:1的22-118位氨基酸所示序列中例如不超過2、3、4、5或10個氨基酸替換、添加或缺失的變體，以及包括含有在對應于SEQIDNO:1的34-95位氨基酸所示序列中不超過2、3、4、5或10個氨基酸替換、添加或缺失的變體）、其片段和包含任何上述序列的融合蛋白；然而，在每種情形中，任何前述的ALKlECD多肽優選將保持與GDF5、GDF6、GDF7、BMP9和BMPlO中一種或多種的高親和力。術語"ALK1E⑶多肽"顯然旨在排除任何全長的天然ALKl多肽。一般地，ALKlE⑶多肽被設計為在生物學相關的溫度、pH水平和滲透壓下可溶于水性溶液。[0071]如上所述，本公開內容提供了與天然ALKl多肽共有特定程度的序列同一性或相似性的ALKlECD多肽。為了確定這兩種氨基酸序列的同一性百分比，對所述序列進行以最優比較為目的的比對(例如，為了最優比對可以在第一和第二氨基酸(或核酸)序列中一個或二者中引入空位，為比較目的可以忽略非同源序列）。然后比較對應氨基酸位置處的氨基酸殘基。當第一序列中的位置與第二序列中的對應位置均為同樣氨基酸殘基時，則所述分子在該位置是一致的（如本文所使用的"同一性"，其等同于氨基酸"同源性"）。所述兩個序列之間的同一性百分比是這兩個序列共有的相同殘基之數目的函數，其中考慮到了空位數和每個空位的長度，所述空位是為了這兩個序列最優比對的需要而引入。[0072]序列比較以及確定兩個序列之間同一性和相似性的百分比可使用數學算法來實現（ComputationalMolecularBiology，Lesk，A.M.編著，OxfordUniversityPress,NewYork?1988；Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects，Smith，D·W·，ed·，AcademicPress?NewYork，1993;ComputerAnalysisofSequenceData，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編著，HumanaPress，NewJersey，1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G·,AcademicPress，1987以及SequenceAnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStocktonPress，NewYork，1991)〇[0073]在一個實施方案中，使用Needleman和Wunsch算法（JMol.Biol·(48):444-453(1970))來確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比，該算法已并入GCG軟件包（可從//www.gcg.com獲得)的GAP程序中。在一個具體實施方案中，在GAP程序中使用以下參數:Blosum62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一實施方案中，使用GCG軟件包(Devereux，J.等，NucleicAcidsRes·12(1):387(1984))(可從//www.gcg.com獲得）中的GAP程序來確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分比。示例性參數包括使用NWSgapdna.CMP矩陣，空位權重為40、50、60、70或80，長度權重為1、2、3、4、5或6。除非另有指明，使用采用Blosum62矩陣、空位權重為10以及長度權重為3的GAP程序來確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比；如果這樣的算法不能計算期望的同一性百分比，則應選擇本文公開的合適的其它算法。[0074]在另一實施方案中，使用E.Myers和W.Miller的算法(CABI0S，4:11-17(1989))來確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分比，該算法已并入采用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、空位長度罰分為12以及空位罰分為4的ALIGN程序(2.0版）中。[0075]在另一實施方案中，可使用基于Brutlag等的算法(Comp.App.Biosci·，6:237_245(1990))的FASTDB計算機程序來確定兩個氨基酸序列之間的最佳整體比對。在序列比對中，查詢序列和目的序列均為氨基酸序列。所述全面序列比對的結果表示為同一性百分比。在一個實施方案中，使用基于Brutlag等的算法（Comp.App.Biosci.，6:237-245(1990))的FASTDB計算機程序來確定氨基酸序列同一性。在一個具體的實施方案中，所使用的計算氨基酸比對的同一"性和相似性百分比的參數包括:矩陣=PAM150，k-tupIe=2，錯配罰分=1，連接罰分（joiningpenalty)=20，隨機化群組長度=0，截斷值=1，空位罰分=5，空位大小罰分=0.05。[0076]在一些實施方案中，ALKlECD多肽包含天然ALKl蛋白（例如SEQIDNO:1的序列）的細胞外部分，優選是ALKl細胞外結構域的配體結合部分。在一些實施方案中，可溶性ALKl多肽包含與SEQIDN0:1的22-118位氨基酸所示序列具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，截短的細胞外ALKl多肽包含SEQIDNO:1細胞外部分氨基酸序列的至少30、40或50個連續氨基酸。[0077]在一些優選的實施方案中，ALKlECD多肽結合⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10中的一種或多種。任選地，所述ALKl多肽基本上不顯示與TGF-βΙ或TGF-I33的結合。可使用純化蛋白質在溶液中或在表面等離子體共振系統(例如Biacore?系統）中對結合進行評估。優選的可溶性ALKl多肽將顯示抗血管發生活性。血管發生抑制活性的生物測定包括雞絨毛尿囊膜(CAM)測定、小鼠角膜微囊袋測定、測量施用分離的或合成的蛋白質對植入腫瘤之作用的測定。CAM測定由O'Reilly等描述于"AngiogenicRegulationofMetastaticGrowth"Cell，79(2)卷，1994年10月I日，315-328頁。簡言之，將具有完整卵黃的3日齡雞胚從卵中分離并置于petri培養皿中。孵育3天后，將含有待測試蛋白質的甲基纖維素盤(methylcellulosedisc)施加至每個胚胎的CAM。孵育48小時后，觀察胚胎和CAM以確定內皮生長是否已被抑制。小鼠角膜微囊袋測定包括將含有生長因子的粒狀物(pellet)連同含有疑似內皮生長抑制劑的另一粒狀物植入小鼠的角膜中，觀察角膜中形成的毛細血管模式。其它測定描述于實施例中。[0078]ALKlE⑶多肽可通過去除ALKl多肽的細胞質尾部和跨膜區域而得到。或者，可通過缺失或通過用親水性氨基酸殘基替換構成跨膜結構域的正常疏水氨基酸殘基來使跨膜結構域失活。在上述任一情形中，形成了基本上親水的親水性模式，其降低親脂性并增進水溶性。跨膜結構域的缺失優選依靠用親水氨基酸殘基進行替換，因為這樣避免引入可能具有免疫原性的表位。[0079]ALKlE⑶多肽還可在N端包含任意的各種前導序列。在真核系統中這樣的序列會使所述肽表達以及靶向到分泌途徑。參見，例如Ernst等，美國專利No.5，082，783(1992)。或者，可以使用本源的ALKl信號序列來實現從細胞泌出。可能的前導序列包括本源的、tPa和蜜蜂蜂毒素(mellitin)前導序列（分別為SEQIDNO7-9)。對信號肽的加工可依所選前導序列、所使用細胞類型和培養條件等參數而變化，因此成熟ALKlECD多肽(包括SEQIDNO:5)的實際N端起始位點可在N端或C端方向上移動1-5個氨基酸。[0080]在一些實施方案中，本公開內容涵蓋了ALKl多肽的特定突變從而改變該肽的糖基化。可選擇這樣的突變以引入或消除一個或多個糖基化位點，例如0-連接或N-連接的糖基化位點。天冬酰胺連接的糖基化識別位點通常包含三肽序列一一天冬酰胺-X-蘇氨酸(或天冬酰胺-X-絲氨酸）（其中"X"是任意氨基酸），其被合適的細胞糖基化酶特異性識別。還可以通過將一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基添加、替換至野生型ALKl多肽序列(針對0-連接的糖基化位點）來進行改變。在糖基化識別位點的第一個或第三個氨基酸位置的一處或兩處進行多種氨基酸替換或缺失(和/或在第二個位置進行氨基酸缺失)導致經修飾三肽序列的非糖基化。在ALKl多肽上增加碳水化合物部分數目的另一方法是將糖苷通過化學方法或酶促法偶聯至ALKl多肽來實現。取決于所使用的偶聯模式，可以使糖連接至(a)精氨酸和組氨酸；（b)游離的羧基；（c)游離的巰基(例如半胱氨酸的巰基）；（d)游離的羥基(例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基）；（e)芳族殘基(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基）；或(f)谷氨酰胺的酰胺基團。這些方法描述于1987年9月11日公布的WO87/05330以及ApIin和Wriston(1981)CRCCrit.Rev.Biochem.，259-306頁中，其通過引用并入本文。可通過化學方法和/或酶促方法將ALKl多肽上存在的一個或多個碳水化合物去除。化學方法去糖基化可包括例如使ALKl多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。該處理導致除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）以外的大多數或所有糖被切割，而氨基酸序列則保持完好。化學方法去糖基化還描述于Hakimuddin等（1987)Arch·Biochem·Biophys·259:52以及Edge等（1981)AnaI.Biochem.118:131。酶促法切割ALK1多肽上的碳水化合物部分可通過使用多種內切和外切糖苷酶來實現，如Thotakura等（1987)Meth.Enzymol.138:350所描述。需要時，可根據所用表達系統的類型來調整ALKl多肽的序列，這是因為哺乳動物、酵母、昆蟲和植物細胞均可引入不同的糖基化模式，這些糖基化模式可受到所述肽的氨基酸序列的影響。一般地，用于人中的ALKl蛋白將表達在提供適當糖基化的哺乳動物細胞系中，例如HEK293或CHO細胞系，然而預計另一些哺乳動物表達細胞系、昆蟲細胞以及含有經改造之糖基化酶的酵母細胞系也可使用。[0081]本公開內容還涵蓋了獲得突變體的方法，特別是ALKl多肽的組合突變體集合以及截短突變體;組合突變體庫尤其可用于鑒定功能性變體序列。篩選這些組合文庫的目的可以是獲得例如可用作激動劑或拮抗劑的ALKl多肽變體或者具有新活性的ALK1多肽變體。以下提供了多種篩選測定，這樣的測定可用于評價變體。例如，可根據結合ALKl配體之能力、阻止ALKl配體與ALKl多肽結合或者干擾ALKl配體引起之信號傳導的能力來篩選ALKl多肽變體。ALKl多肽或其變體的活性還可以在基于細胞的或者體內測定中進行測試，尤其是實施例中公開的任何測定。[0082]可獲得源于組合的變體，其具有相對于ALKlECD多肽(其包含天然ALKl多肽的細胞外結構域)來說選擇性的或普遍提高的效力。同樣，可通過誘變來獲得血清半衰期顯著不同于對應野生型ALKlECD多肽的變體。例如，可使經改變的蛋白質對蛋白水解降解或者導致天然ALKlECD多肽破壞、清除或失活的其它過程更穩定或更不穩定。可利用這樣的變體和編碼其的基因通過調節ALKl多肽的半衰期來改變ALKlECD多肽水平。例如，短半衰期可帶來更短暫的生物學效應，并可更嚴格地控制患者體內的重組ALKlE⑶多肽水平。在Fc融合蛋白中，可在接頭(如果存在的話)和/或Fc部分形成突變以改變該蛋白質的半衰期。[0083]可通過編碼多肽文庫之基因的簡并文庫來得到組合文庫，所述多肽均包含潛在ALKl多肽序列的至少一部分。例如，可將合成寡核苷酸混合物酶促連接進基因序列，從而潛在ALKl多肽核苷酸序列的簡并集合可表達為單獨的肽，或者表達為一組較大的融合蛋白(例如，用于噬菌體展示）。[0084]可通過許多方法從簡并寡核苷酸序列得到潛在ALKlE⑶變體的文庫。可以在自動DNA合成儀中化學合成簡并基因序列，然后將合成基因連接進合適的表達載體。簡并寡核苷酸的合成在本領域是公知的（參見，例如Narang，SA(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等，(1981)RecombinantDNA，Proc.第3版ClevelandSympos.Macromolecules，ed.AGWalton，Amsterdam:Elsevier273-289頁；Itakura等，（1984)Annu·Rev·Biochem·53:323;Itakura等，（1984)Science198:1056;Ike等，（1983)NucleicAcidRes.ll:477)。這樣的技術已用于其它蛋白質的定向演化中（參見，例如Scott等，（1990)Science249:386-390;Roberts等，（1992)PNASUSA89:2429-2433;Devlin等，（1990)Science249:404-406;Cwirla等，(1990)PNASUSA87:6378-6382;以及美國專利N〇:5,223,409、5,198,346和5,096,815)。[0085]或者，可利用其它形式的誘變來得到組合文庫。例如，可通過使用例如丙氨酸掃描誘變及類似方法（Ruf等，（1994)Biochemistry33:1565_1572;Wang等，（1994)J.Biol·Chem.269:3095-3099;Balint等，（1993)Genel37:109-118;Grodberg等，（1993)Eur·J·Biochem·218:597-601;Nagashima等，（1993)J·Biol·Chem·268:2888-2892;Lowman等，（1991)Biochemistry30:10832-10838;和Cunningham等，（1989)Science244:1081-1085)、接頭掃描誘變（linkerscanningmutagenesis)(Gustin等，（1993)Virology193:653-660;Brown等，（1992)Mol·CellBiol·12:2644-2652;McKnight等，（1982)Science232:316)、飽和誘變（saturationmutagenesis)(Meyers等，（1986)Science232:613)、PCR誘變（Leung等，（1989)MethodCellMolBiol1:11-19)或隨機誘變包括化學誘變等(Miller等，（1992)AShortCourseinBacterialGenetics,CSHLPress,ColdSpringHarbor，NY;和Greener等，（1994)StrategiesinMolBiol7:32-34)來篩選而從文庫產生并分離出ALKl多肽變體。接頭掃描誘變(特別是在組合的背景下進行的）是鑒定ALKl多肽截短(生物活性)形式的誘人方法。[0086]本領域已知多種用于篩選由點突變和截短形成的組合文庫之基因產物的技術，以及就此而言已知多種用于針對具有特定性質之基因產物篩選cDNA文庫的技術。這樣的技術一般適用于快速篩選由組合誘變ALKl多肽獲得的基因文庫。篩選大基因文庫的最廣泛使用的技術通常包括:將基因文庫克隆進可復制的表達載體中；用得到的文庫載體轉化合適的細胞；以及在下述條件下表達組合基因，所述條件即在此條件下對期望活性的檢測使得分離編碼其產物被檢測之基因的載體相對容易。優選的測定包括ALKl配體結合測定和配體介導的細胞信號傳導測定。[0087]在一些實施方案中，本公開內容的ALKlE⑶多肽還可包含除了ALKl多肽中天然存在的之外的翻譯后修飾。這樣的修飾包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。結果，經修飾的ALKlE⑶多肽可包含非氨基酸組分，例如聚乙二醇、脂質、多糖或單糖以及磷酸。這樣的非氨基酸組分對ALKlE⑶多肽功能的作用可如本文針對其它ALKlE⑶多肽變體所述的那樣進行測試。當ALKlECD多肽通過對ALKl多肽初始形式進行切割在細胞中產生時，翻譯后加工對于正確折疊和/或蛋白質功能可能也是重要的。不同的細胞(例如〇10、他1^、1?)〇(、293、1138、肌!1-313或冊1(293)擁有針對這些翻譯后活性的特定細胞機器和特有機制，并且可以選擇不同的細胞以確保ALKl多肽的正確修飾和加工。[0088]在一些方面，ALKlE⑶多肽的功能性變體或經修飾形式包括含有ALKlE⑶多肽至少一部分以及一個或多個融合結構域的融合蛋白。這些融合結構域的公知實例包括但不限于多組氣fe、Glu-Glu、谷脫甘妝S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重鏈恒定區（Fe)、麥芽糖結合蛋白（MBP)或人血清白蛋白。可選擇融合結構域使其具備所需特質。例如，某些融合結構域尤其可用于通過親和層析來分離融合蛋白。為了親和純化的目的，針對親和層析使用了相關基質，例如谷胱甘肽、淀粉酶以及綴合有鎳或鈷的樹脂。許多這樣的基質可以"試劑盒"形式得到，例如可用于HIS6融合伴侶的PharmaciaGST純化系統和QIAexpresss?系統(Qiagen)。另一個實例是，可選擇融合結構域從而有利于ALKlE⑶多肽的檢測。這些檢測結構域的實例包括多種熒光蛋白（例如GFP)以及通常是短肽序列的"表位標簽"，針對其的特異性抗體是可用的。特異性單克隆抗體可用的公知表位標簽包括FLAG、流感病毒血細胞凝集素(HA)和c-myc標簽。在一些情況下，融合結構域包含蛋白酶切割位點，例如針對FactorXa或凝血酶(Thrombin)的切割位點，這使得相關蛋白酶部分地消化該融合蛋白并因而從中釋放重組蛋白。然后，所釋放的蛋白通過隨后的層析分離得以與融合結構域分離。在一些優選的實施方案中，ALKlECD多肽與在體內穩定ALKl多肽的結構域（"穩定"結構域)融合。"穩定"是指增加血清半衰期，不論是由于減少破壞、減少通過腎的清除還是其它藥代動力學效應引起。已知與免疫球蛋白的Fc部分融合會賦予多數蛋白質以理想的藥代動力學性質。同樣，與人血清白蛋白融合可賦予理想的性質。可選擇的其它類型融合結構域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)結構域和功能性結構域。[0089]作為一個具體實例，本公開內容提供了包含與Fc結構域融合之ALKl可溶性細胞外結構域的融合蛋白（例如，SEQIDN0:6)。[0090]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*[0091]任選地，Fe結構域在例如Asp-265、賴氨酸322和Asn-434殘基處具有一個或多個突變。在一些情況下，包含一個或多個所述突變(例如Asp-265突變)的突變Fe結構域與野生型Fe結構域相比具有降低的結合Fey受體的能力。在另一些情況下，包含一個或多個所述突變(例如Asn-434突變)的突變Fe結構域與野生型Fe結構域相比具有提高的結合I類MHC相關Fe受體(FcRN)的能力。[0092]應理解，融合蛋白的不同組分可以按照符合所需功能的任何方式排列。例如，ALKlECD多肽可置于外源結構域的C端，或者外源結構域可置于ALKlECD多肽的C端。ALKlECD多肽結構域和外源結構域不需要在融合蛋白中鄰接，另外的結構域或氨基酸序列可包含在各結構域的C端或N端或者所述結構域之間。[0093]本文使用的術語"免疫球蛋白Fe區域"或簡稱"Fc"應理解為是指免疫球蛋白鏈恒定區（優選免疫球蛋白重鏈恒定區）的羧基端部分或其一部分。例如，免疫球蛋白Fe區可包含：I)CH1結構域、CH2結構域和CH3結構域;2)CH1結構域和CH2結構域;3)CH1結構域和CH3結構域;4)CH2結構域和CH3結構域;或5)兩個或更多個結構域和免疫球蛋白鉸鏈區的組合。在一個優選的實施方案中，所述免疫球蛋白Fe區域包含至少免疫球蛋白鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，優選缺少CHl結構域。[0094]在一個實施方案中，所述重鏈恒定區源自的免疫球蛋白類型是IgG(Igγ)(γ亞型1、2、3或4)。可使用免疫球蛋白的其它類型=IgA(Iga)、IgD(IgS)、IgE(Ige)和IgM(Igy)。有關選擇合適的免疫球蛋白重鏈恒定區的論述詳見美國專利No.5，541，087和5，726，044。認為從某些免疫球蛋白類型和亞型選擇特定免疫球蛋白重鏈恒定區序列以實現特定的結果是在本領域技術水平之內的。編碼免疫球蛋白Fe區之DNA構建體的一部分優選包含鉸鏈結構域的至少一部分以及優選地Feγ的CH3或者IgA、IgD、IgE或IgM任一中同源結構域的至少一部分。[0095]此外，還考慮到，在本文公開的方法和組合物的實施中，替換或缺失免疫球蛋白重鏈恒定區的氨基酸可能是有用的。一個實例是在上游的CH2區域中引入氨基酸替換以構建與Fe受體親和力降低的Fe變體(Cole等（1997)J.Immunol·159:3613)。[0096]在一些實施方案中，本公開使得分離和/或純化形式的ALKlE⑶多肽可用，其從其它蛋白質和/或其它ALKlE⑶多肽種類中分離出來或者基本不含（例如，至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%地不含)其它蛋白質和/或其它ALKlECD多肽種類。[0097]在一些實施方案中，本公開內容包括編碼可溶性ALKl多肽的核酸，所述核酸包含ALKl蛋白細胞外部分的編碼序列。在另一些實施方案中，本公開內容還涉及包含這些核酸的宿主細胞。所述宿主細胞可以是任意原核和真核細胞。例如，本公開內容的多肽可以表達在細菌細胞(例如大腸桿菌）、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒表達載體）、酵母或哺乳動物細胞中。其它合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。因此，本公開內容的一些實施方案還涉及生產ALKlE⑶多肽的方法。已證實，SEQIDN0:3所示的在CHO細胞中表達的ALKl-Fc融合蛋白具有強的抗血管發生活性。[0098]可如ALKlE⑶蛋白有關描述得到和表征DAN多肽(包括野生型DAN的變體)和包含DAN蛋白的融合蛋白。[0099]3.編碼ALKl多肽的核酸[0100]在一些方面中，本公開內容提供了編碼包括本文公開的片段、功能性變體和融合蛋白在內的任何ALK1多肽(例如，ALKlE⑶多肽）的分離的和/或重組的核酸。例如，SEQIDN0:2編碼天然的人ALKl前體多肽，而SEQIDN0:4編碼與IgGlFe結構域融合的ALKl細胞外結構域的前體。所述目標核酸可以是單鏈的或雙鏈的。這樣的核酸可以是DNA或RNA分子。這些核酸可用于例如制備ALKl多肽的方法中或用作直接的治療劑(例如，在反義、RNAi或基因治療策略中）。[0101]在一些方面中，所述編碼ALKl多肽的目標核酸還應理解為包括SEQIDNO:2或4之變體的核酸。變體核苷酸序列包括由于一個或多個核苷酸替換、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因變體。[0102]在一些實施方案中，本公開內容提供了分離的或重組的核酸序列，其與SEQIDNO:2或4具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。本領域普通技術人員會理解，與SEQIDN0:2或4互補以及與SEQIDN0:2或4的變體互補的核酸序列也在本公開的范圍內。在另一些實施方案中，本公開內容的核酸序列可被分離、重組和/或與外源核苷酸序列融合，或者在DNA文庫中。[0103]在另一些實施方案中，本公開內容的核酸還包括在高度嚴格條件下與SEQIDNO:2或4所示核苷酸序列雜交的核苷酸序列、SEQIDN0:2或4的互補序列或者其片段。如上所述，本領域普通技術人員會容易地理解，促進DNA雜交的合適的嚴格條件可有不同。例如，可以于約45°C在6.OX氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中進行雜交，然后于50°C用2.OXSSC清洗。例如，所述清洗步驟中的鹽濃度可以從低嚴格的50°C、約2.0XSSC到高嚴格的50°C、約0.2XSSC之中選擇。另外，所述清洗步驟中的溫度可從低嚴格條件的室溫(約22°C)提高到高嚴格條件的約65°C。溫度和鹽均可變化，或者溫度或鹽濃度可保持恒定而其它變量發生改變。在一個實施方案中，本公開內容提供了在室溫6XSSC的低嚴格條件下雜交并隨后在室溫用2XSSC清洗的核酸。[0104]本公開內容的范圍還包括由于遺傳密碼簡并性而導致不同于SEQIDN0:2或4所示核酸的核酸。例如，許多氨基酸對應于超過一種的三聯體。對應于同一氨基酸的密碼子，或稱"同義密碼子"（例如，CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子），可導致不影響該蛋白之氨基酸序列的"沉默"突變。然而，導致目的蛋白質之氨基酸序列改變的DNA序列多態性預期會存在于哺乳動物細胞中。本領域技術人員會理解，在編碼特定蛋白質之核酸的一個或多個核苷酸(多達核苷酸的約3-5%)中的這些變化可能由于天然等位基因變化而存在于給定物種的個體中。任何以及全部這樣的核苷酸改變和得到的氨基酸多態性均在本公開內容的范圍內。[0105]在一些實施方案中，本公開內容的重組核酸可有效連接至表達構建體的一個或多個調控核苷酸序列。調控核苷酸序列一般會適合于用于表達的宿主細胞。本領域已知針對多種宿主細胞的眾多類型的合適表達載體和適當調控序列。通常，所述一種或多種調控核苷酸序列可包括但不限于：啟動子序列、前導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活子(activator)序列。本公開內容涵蓋了本領域已知的組成型或誘導型啟動子。所述啟動子可以是天然啟動子或者組合了多于一種啟動子之元件的雜合啟動子。表達構建體可以以附加體(例如質粒）的形式存在于細胞中，或者表達構建體可插入染色體中。在一個優選的實施方案中，表達載體包含選擇標記基因以允許選擇經轉化的宿主細胞。選擇標記基因是本領域周知的，并且隨所使用宿主細胞而不同。[0106]在本文公開的一些方面中，目標核酸在包含編碼ALKl多肽并與至少一種調控序列有效連接的核苷酸序列的表達載體中提供。調控序列是本領域公知的，并被選擇用于指導ALKl多肽的表達。因此，術語"調控序列"包括啟動子、增強子和其它表達調控元件。示例性的調控序列描述于Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)。例如，在與之有效連接時調控DNA序列表達的許多種表達調控序列中任意一種均可用于這些載體中以表達編碼ALKl多肽的DNA序列。這樣可用的表達調控序列包括例如SV40的早期和晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子、RSV啟動子、Iac系統、trp系統、TAC或TRC系統、表達由T7RNA聚合酶指導的T7啟動子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區域、fd外被蛋白的調控區、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子(例如Ph〇5)、酵母α-接合因子的啟動子、桿狀病毒系統的多面體啟動子以及其它已知調控原核或真核細胞或其病毒之基因表達的序列，及其多種組合。應理解，設計表達載體可取決于如下因素：待轉化之宿主細胞的選擇和/或所需表達之蛋白的類型。并且，還應考慮載體的拷貝數、調控該拷貝數的能力以及該載體編碼之任何其它蛋白（例如抗生素標記)的表達。[0107]本公開內容中涉及的重組核酸可通過將所克隆基因或其一部分連接進適于在原核細胞、真核細胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)或兩者中表達的載體中而產生。用于產生重組ALKl多肽的表達載體包括質粒和其它載體。例如，合適的載體包括用于在原核細胞(例如大腸桿菌）中表達的如下類型的質粒:PBR322來源的質粒、pEMBL來源的質粒、ρΕΧ來源的質粒、pBTac來源的質粒和pUC來源的質粒。[0108]-些哺乳動物表達載體既包含利于在細菌中擴增載體的原核序列，也包含在真核細胞中表達的一種或多種真核轉錄單元。適于轉染真核細胞的哺乳動物表達載體的實例有：pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pk〇-ne〇和pHyg來源的載體。這些載體中的一些用來自細菌質粒(例如pBR322)的序列進行修飾，以利于在原核和真核細胞中進行復制和藥物抗性篩選。或者，病毒例如牛乳頭瘤病毒(BPV-I)或EB病毒的衍生物(pHEBo、pREP來源的以及p205)可用于在真核細胞中瞬時表達蛋白。其它病毒(包括逆轉錄病毒)表達系統的實例可見于以下對基因治療遞送系統的描述。用于制備質粒和轉化宿主生物的各種方法是本領域周知的。對于其它針對原核和真核細胞的合適表達系統以及通用重組方法，參見Sambrook，Fritsch和Maniatis編著的MolecularCloningALaboratoryManual，第3版（ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)。在一些情況下，通過使用桿狀病毒表達系統來表達重組多肽可能是理想的。這樣的桿狀病毒表達系統的實例包括PVL來源的載體（例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW來源的載體(例如pAcUWl)和pBlueBac來源的載體(例如含β-gal的pBlueBacIII)。[0109]在一個優選的實施方案中，載體被設計成用于在CHO細胞中產生目的ALKl多肽，例如Pcmv-Script載體（Stratagene，LaJ。11a，Calif.)、pcDNA4載體（Invitrogen，CarIsbad，Calif·)和pCI-neo載體(Promega，Madison，Wisc.)。很明顯，可使用目的基因構建體使目的ALKl多肽在培養擴增的細胞中表達，從而例如產生用于純化的蛋白質，包括融合蛋白或變體蛋白。[0110]本公開內容還涉及轉染有包含編碼序列（例如，SEQIDNO:2或4)之重組基因的宿主細胞，所述編碼序列針對一種或多種目的ALKl多肽。所述宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。例如，本文公開的ALKl多肽可表達于細菌細胞(例如大腸桿菌）、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒表達系統）、酵母或哺乳動物細胞中。其它合適的宿主細胞是本領域技術人員已知的。[0111]因此，本公開內容還涉及產生目的ALKl多肽(包括ALKlE⑶多肽)的方法。例如，可以在合適的條件下培養轉染有編碼ALKl多肽之表達載體的宿主細胞以表達ALKl多肽。所述ALKl多肽可從含有ALKl多肽的細胞和培養基混合物中泌出并分離。或者，ALKl多肽可保留在細胞質中或膜級分中，收集、裂解細胞并分離蛋白質。細胞培養物包括宿主細胞、培養基和其它副產物。用于細胞培養的合適培養基是本領域公知的。可使用本領域已知的用于純化蛋白質的技術來從細胞培養基、宿主細胞或兩者中分離出目的ALKl多肽，所述技術包括離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳、使用特異性針對ALKl多肽之特定表位的抗體的免疫親和純化以及使用與融合到ALKl多肽之結構域結合的試劑的親和純化(例如，可使用蛋白A柱來純化ALKl-Fc融合蛋白）。在一個優選的實施方案中，所述ALKl多肽是含有利于其純化之結構域的融合蛋白。在一個優選的實施方案中，通過一系列柱層析步驟來實現純化，包括例如下述的三種或更多種:蛋白A層析、Qsepharose層析、phenylsepharose層析、大小排阻層析和陽離子交換層析。可以通過病毒過濾（viralfiltration)和緩沖液交換(bufferexchange)來完成純化。[0112]在另一實施方案中，編碼純化用前導序列(例如在重組ALKl多肽所需部分之N端的多-(His)/腸激酶切割位點序列）的融合基因可允許使用Ni2+金屬樹脂的親和層析來純化所表達的融合蛋白。然后，可通過用腸激酶處理來除去所述純化用前導序列，以提供經純化的ALKl多肽（例如，參見Hochuli等，（1987)J·Chromatography411:177以及Janknecht等，PNASUSA88:8972)。[0113]用于制備融合基因的技術是周知的。實質上，按照常規技術對編碼不同多肽序列的多種DNA片段進行連接，其使用平末端或交錯末端（stagger-end)進行連接，使用限制酶消化以提供合適的末端，需要時填補粘性末端，用堿性磷酸酶處理以避免不期望的連接，以及酶促連接。在另一實施方案中，可通過常規技術(包括自動DNA合成儀)來合成融合基因。或者，可使用錨定引物對基因片段進行PCR擴增，所述錨定引物產生了兩個連續基因片段之間的互補突出端，所述突出端可隨后退火以得到嵌合基因序列（參見，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等編著，JohnWiley&Sons:1992)〇[0114]41^1、81^9、81^10、60?5、0^6或0^7之拮抗劑的各類核酸化合物的實例包括反義核酸、RNAi構建體和催化性核酸構建體。核酸化合物可以是單鏈或雙鏈的。雙鏈化合物還可包括突出端或非互補的區域，在此處一條鏈或另一條鏈是單鏈的。單鏈化合物可包括自身互補的區域，即該化合物的雙螺旋結構區域形成所謂"發夾"或"莖環"結構。核酸化合物可包含與由全長ALKl核酸序列或配體核酸序列之至多1000、至多500、至多250、至多100或至多50、35、30、25、22、20或18個核苷酸組成的區域互補的核苷酸序列。互補區域優選為至少8個核苷酸，任選地至少10個或至少15個核苷酸，任選地在15到25個核苷酸之間。互補區域可落入靶轉錄物的內含子、編碼序列或非編碼序列內，例如編碼序列部分。一般地，核酸化合物的長度為約8至約500個核苷酸或堿基對，任選地其長度為約14至約50個核苷酸。核酸可以是DNA(特別是用作反義核酸時）、RNA或RNA:DNA雜合物。任何一條鏈可包含DNA和RNA混合物，以及不能簡單歸類為DNA或RNA的經修飾形式。同樣，雙鏈化合物可以是DNA:DNA、DNA:RNA或RNA:RNA，任何一條鏈也可包含DNA和RNA混合物以及不能簡單歸類為DNA或RNA的經修飾形式。核酸化合物可包含多種修飾中的任意種，包括對骨架(天然核酸的糖-磷酸部分，包括核苷酸間連接)或堿基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分）的一種或多種修飾。反義核酸化合物優選具有約15至約30個核苷酸的長度，并常包含一種或多種修飾以改善性質，例如在血清中、在細胞中或者在該化合物可能被遞送至的位置(例如，在經口遞送化合物情形中的胃部，對吸入型化合物來說的肺部）的穩定性。在RNAi構建體的情形中，與靶轉錄物互補的鏈一般是RNA或其修飾物。另一條鏈可以是RNA、DNA或任何其它變化形式。雙鏈或單鏈"發夾"RNAi構建體的雙鏈體部分優選具有18~40個核苷酸的長度，任選地約21~23個核苷酸長度，只要其可作為Dicer的底物即可。催化性或酶促性核酸可以是核酶或DNA酶，還可包括經修飾的形式。當在生理條件下以及在無義或有義對照很少或沒有作用的濃度下與細胞接觸時，核酸化合物可抑制靶標表達約50%、75%、90%或更多。測試核酸化合物效應的優選濃度為1、5和10微摩爾/升。還可測試核酸化合物例如針對血管發生的作用。[0115]編碼DAN多肽(包括野生型DAN之變體)的核酸以及編碼含有DAN蛋白之融合蛋白的核酸可如上有關編碼ALKlE⑶蛋白之核酸所述產生以及表征。[0116]4·抗體[0117]本公開內容的另一方面涉及與ALKl多肽細胞外部分反應的抗體，優選特異性與ALK1多肽反應的抗體。在一個優選的實施方案中，這樣的抗體可干擾ALK1與配體（例如GDF5、GDF6、⑶F7、BMP-9或BMP-10)的結合。應理解，針對ALKl配體的抗體應結合成熟的、經加工形式的相應蛋白質。本公開內容還提供了與⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP-9和/或BMP-10結合并抑制ALKl與這些配體結合的抗體。優選的抗體會在生物測定(例如CAM測定或角膜微囊袋測定，參見上文）中表現出抗血管發生活性。[0118]本文使用的術語"抗體"意在包括全部抗體，例如任何同種型（IgG、IgA、IgM、IgE等），并包括與所選抗原反應的免疫球蛋白之片段或結構域。可使用常規技術將抗體片段化，并篩選可用的和/或與目標特定表位相互作用的片段。因此，該術語包括抗體分子的經蛋白水解切割或重組制備部分的片段，并且該片段能夠選擇性地與某些蛋白質反應。這些蛋白水解和/或重組的片段之非限制性實例包括Fab、F(ab'）2、Fab'、Fv以及含有由肽接頭連接之V[L]和/或V[H]結構域的單鏈抗體(scFv)。所述scFv可共價或非共價連接以形成具有兩個或多個結合位點的抗體。術語"抗體"還包括多克隆、單克隆或者抗體和重組抗體的其它純化制備物。術語"重組抗體"是指從使用分子生物學技術構建的核酸表達的抗體或免疫球蛋白之抗原結合結構域，例如從單鏈抗體開發而來的人源化抗體或完全人抗體。單結構域和單鏈抗體也涵蓋在術語"重組抗體"的范圍內。[0119]抗體可通過本領域已知的多種方法中任一種來產生，包括向動物施用抗原，向攜帶了人免疫球蛋白基因的動物施用抗原，或者用抗原針對抗體(常常為單鏈抗體或抗體結構域)文庫進行篩選。一經檢測到抗原結合活性，則可將蛋白質的相應部分移植進其它抗體框架中，包括全長IgG框架。例如，通過使用源自ALKl多肽或ALKl配體的免疫原，可利用標準方案（參見，例如Harlow和Lane編著的Antibodies:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress:1988))來制備抗蛋白/抗肽的抗血清或單克隆抗體。可使用免疫原形式的肽(例如，ALKl多肽，或能夠引發抗體應答的抗原片段，或融合蛋白）來免疫哺乳動物，例如小鼠、倉鼠或兔。對蛋白質或肽賦予免疫原性的技術包括與載體綴合或其它本領域公知的技術。可在佐劑存在時施用ALKl多肽的免疫原性部分(優選細胞外部分）。可通過檢測血漿或血清中的抗體效價來監測免疫過程。可利用免疫原作為抗原使用標準ELISA或其它免疫測定來評價抗體水平。[0120]在用ALK1多肽的抗原制備物免疫動物后，可獲得抗ALK1抗血清，如果需要的話，可從該血清中分離出抗ALKl抗體。為了產生單克隆抗體，可從經免疫動物收集產抗體細胞(淋巴細胞），通過標準體細胞融合步驟與永生化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合以得到雜交瘤細胞。這樣的技術是本領域公知的，包括例如雜交瘤技術(最初由Kohler和Milstein，（1975)Nature，256:495-497開發）、人B細胞雜交瘤技術(Kozbar等，（1983)ImmunologyToday，4:72)以及產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等，（1985)MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，Inc.77-96頁）。可通過免疫化學方法來篩選雜交瘤，以產生與本公開內容之哺乳動物ALKl多肽特異性反應的抗體以及從包含所述雜交瘤細胞之培養物分離出的單克隆抗體。[0121]本文使用的術語"抗體"意在包括同樣與目標ALKl多肽之一特異性反應的其片段。可使用常規技術將抗體片段化，用來以與上述針對完整抗體同樣的方式篩選可用的片段。例如，可通過用胃蛋白酶處理得到F(ab)2片段。可處理所得的F(ab)2片段以還原二硫橋，從而得到Fab片段。本公開內容的抗體還意在包括對ALKl多肽具有親和力(其由抗體的至少一個CDR區域所賦予）的雙特異性、單鏈、嵌合以及人源化的分子。在一些優選的實施方案中，所述抗體還包含與其連接并能夠被檢出的標簽(例如，所述標簽可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子）。[0122]在一些優選的實施方案中，本公開內容的抗體是重組抗體，特別是人源化單克隆抗體或完全人重組抗體。[0123]如本領域一般所理解地，涉及抗體時使用的"與……特異性反應"意在指抗體在目標抗原(例如，ALKl多肽或ALKl配體)與其它非目標抗原之間具有足夠的選擇性，因此該抗體至少可用于檢測特定類型生物樣品中目標抗原的存在。在一些使用抗體的方法中，較高程度的結合特異性可能是理想的。例如，如果抗體在目標抗原和其它交叉反應物之間具有較高程度的選擇性，則其在一種或多種非常高豐度的非目標蛋白存在下檢測低豐度目標蛋白時可表現得更好。單克隆抗體一般可更好地(與多克隆抗體相比)有效區分期望抗原和交叉反應性多肽。另外，有效用于在一類生物樣品（例如，糞便樣品）中選擇性鑒定目標抗原的抗體可能在選擇性鑒定另一類生物樣品（例如，血液樣品）中的相同抗原時無法同樣有效。同樣，有效用于鑒定純化蛋白制備物(其不含其它生物雜質）中目標抗原的抗體可能在鑒定粗制生物樣品中的目標抗原時無法同樣有效。因此，在一些優選的實施方案中，本申請提供了已證實其對抗體使用時可能選擇之樣品類型中的目標抗原具有特異性的抗體。[0124]影響抗體-抗原相互作用特異性的一個特征是抗體對抗原的親和力。盡管實現所需特異性要在一定的親和力范圍內，但是優選抗體一般具有(解離常數)約為10-6、10-7、1〇一8、10_9或更低數值的親和力。鑒于TGFP對ALKl的明顯低的結合親和力，預期許多抗ALKl抗體會抑制TGF0結合。然而，⑶F5、6、7的配體群以約5XI(T8M的Kd結合，BMP9、10配體以約IXHT1t3M的Kd結合。因此，可選擇具有適當親和力的抗體來干擾這些配體的信號傳導活性。[0125]此外，用于篩選抗體以鑒別所需抗體的技術可影響所獲得抗體的性質。例如，用于某些治療目的的抗體優選地能夠靶向特定細胞類型。因此，為了獲得這類抗體，可能需要篩選與表達目標抗原之細胞結合的抗體(例如，通過熒光激活細胞分選來實現）。同樣，如果抗體是用于結合溶液中的抗原，可能需要測試溶液結合。多種不同的測試抗體-抗原相互作用以鑒別特別理想之抗體的技術是可用的。這樣的技術包括ELISA、表面等離子體共振結合測定（例如，Biacore結合測定，Bia-coreAB，Uppsala，Sweden)、夾心法測定（例如，IGENInternational，Inc·，Gaithersburg，Maryland的順磁珠系統）、western印跡、免疫沉淀測定和免疫組化。[0126]5.抗體和Fc融合蛋白中的改變[0127]本申請還提供了具有經改造或改變之Fc區域的抗體、ALKl-Fc融合蛋白和DAN-Fc融合蛋白。這樣的抗體和Fc融合蛋白可用于例如調節效應子功能，例如抗原依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。此外，所述修飾可改善抗體和Fc融合蛋白的穩定性。通過將合適的核苷酸改變引入DNA或通過肽合成來制備所述抗體和Fc融合蛋白的氨基酸序列變體。這樣的變體包括例如在本文公開的抗體和Fc融合蛋白的氨基酸序列中缺失和/或插入和/或替換殘基。可進行缺失、插入和替換的任意組合以形成最終構建體，條件是最終構建體具有所需的特征。氨基酸變化還可改變抗體和Fc融合蛋白的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數目或位置。[0128]效應子功能降低的抗體和Fc融合蛋白可通過在氨基酸序列中引入改變來產生，所述改變包括但不限于Bluestone等所述的Ala-Ala突變(參見WO94/28027和WO98/47531;還參見Xu等2000CellImmunol200;16-26)。因此，在一些實施方案中，在恒定區內具有突變(包括Ala-Ala突變）的本公開內容之抗體和Fc融合蛋白可用于降低或消除效應子功能。根據這些實施方案，抗體和Fc融合蛋白可包含234位的丙氨酸突變或235位的丙氨酸突變，或者其組合。在一個實施方案中，所述抗體或Fc融合蛋白包含IgG4框架，其中Ala-Ala突變為在234位從苯丙氨酸突變為丙氨酸和/或235位從亮氨酸突變為丙氨酸。在另一實施方案中，所述抗體或Fc融合蛋白包含IgGl框架，其中Ala-Ala突變表示在234位從亮氨酸突變為丙氨酸和/或235位從亮氨酸突變為丙氨酸。所述抗體或Fc融合蛋白可作為替代地或另外地攜帶其它突變，包括CH2結構域中的點突變K322A(Hezareh等2001JVirol.75:12161-8)。[0129]在一些具體實施方案中，可對所述抗體或Fe融合蛋白進行修飾使其增強或抑制補體依賴性細胞毒性(CDC)。可通過在Fc區域中引入一個或多個氨基酸替換、插入或缺失來實現⑶C活性的調節(參見，例如美國專利No.6,194,551)。作為替代地或另外地，可在Fc區域中引入半胱氨酸殘基，從而允許在該區域中形成鏈間二硫鍵。因此，所得到的同源二聚體抗體可具有提高的或降低的內化能力和/或增強的或減弱的補體介導之細胞殺傷。參見，Caron等，J.ExpMed.176:1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol·148:2918-2922(1992)，W099/51642，Duncan&WinterNature322:738-40(1988);美國專利No·5，648，260;美國專利No·5，624，821以及W094/29351。[0130]6.調節血管發生、周細胞包裹和某些疾病的方法和組合物[0131]本公開內容提供了抑制哺乳動物中血管發生和/或提高周細胞包裹的方法，其通過向對象施用有效量的此后統稱為"治療劑"的ALKlE⑶多肽(例如ALKl-Fc融合蛋白）、DAN蛋白（例如DAN-Fc融合蛋白）、本文公開的抗體(例如針對⑶F5、GDF6、GDF7、BMP9、BMPl0或ALKlECD的抗體)或任何前述核酸拮抗物(例如，反義核酸或siRNA)來實現。所展示數據具體表明，本文公開的抗血管發生治療劑可用于抑制哺乳動物眼中的血管發生。預期這些治療劑還可用于抑制骨和關節以及腫瘤中的血管發生，尤其是與骨和關節有關的腫瘤。[0132]血管發生相關疾病包括但不限于血管發生依賴性癌癥，其包括例如實體瘤、血源性腫瘤(例如白血病)和腫瘤轉移；良性腫瘤，例如血管瘤、聽神經瘤(acousticneuroma)、神經纖維瘤(neurofibroma)、沙眼（trachoma)和化胺性肉芽腫（pyogenicgranuloma);類風濕性關節炎;銀肩病;紅變(rubeosis);奧斯勒-韋伯綜合征(Osler-WebberSyndrome);心肌血管發生（myocardialangiogenesis);動脈粥樣斑塊新血管形成（plaqueneovascularization);毛細血管擴張（telangiectasia);血友病性關節（hemophiIiacjoint)和血管纖維瘤(angiofibroma)。[0133]特別地，本公開內容的多肽治療劑可用于治療或預防癌癥（腫瘤），特別是已知依賴于血管發生過程來支持生長的那些癌癥。與大多數抗血管發生劑不同的是，ALKlE⑶多肽影響由多種因素引起的血管發生。這與癌癥中的情況非常吻合，在癌癥中常需要多種因素來支持腫瘤血管發生。因此，本文公開的治療劑特別有效地用于治療對于靶向單一血管發生因素之藥物(例如，靶向VEGF的貝伐單抗)治療具有抗性的腫瘤。如本文證明地，ALKl-Fc融合蛋白有效用于減輕黑素瘤、肺癌、胰腺癌（如，胰腺內分泌組織腫瘤）、多發性骨髓瘤和乳腺癌(例如，原發性乳腺癌或轉移性乳腺癌;雌激素受體陽性(ER+)或雌激素受體陰性(ER-))的病理作用。[0134]多發性骨髓瘤被普遍認為是包括顯著的血管發生要素的癌癥。因此，預期ALKl-Fc融合蛋白和本文公開的其它治療劑可用于治療多發性骨髓瘤和與骨相關的其它腫瘤。如本文所證明地，本文公開的治療劑可用于改善與多發性骨髓瘤相關的骨損傷，并且因此可用于減輕與其它腫瘤(例如乳腺癌或前列腺癌)之骨轉移有關的骨損傷。如本文指出地，GDF5-7配體在骨中高度表達，不希望受任何具體機制的約束，干擾這些配體可破壞骨中腫瘤發展所需的過程。[0135]在所述方法的一些實施方案中，可一起（同時)或在不同時間（依次地)施用一種或多種多肽治療劑。另外，多肽治療劑可與另一類治療癌癥或抑制血管發生的化合物一起施用。[0136]在一些實施方案中，本公開內容的主題方法可單獨使用。或者，可將所述主題方法與其它用于治療或預防增殖性疾病(例如腫瘤）的常規抗癌治療法組合使用。例如，這些方法可用于預防癌癥、預防癌癥復發和手術后轉移，以及作為其它癌癥治療的輔助手段。本公開內容表明，可通過使用目標多肽治療劑來增強常規癌癥治療(例如，化療、放療、光療、免疫療法和手術)的有效性。[0137]眾多的常規化合物已顯示出具有抗腫瘤活性。這些化合物已用作化療中的藥劑來縮小實體瘤、預防轉移及進一步生長或者降低白血病或骨髓惡性腫瘤中惡性細胞的數目。盡管化療已有效用于治療多種類型的惡性腫瘤，但是許多抗腫瘤化合物會誘導有害副作用。已顯示，當聯合應用兩種或更多種不同的治療時，這些治療可協同作用并使每種治療的劑量降低，從而降低了每種化合物在較高劑量下的有害副作用。在另一些情況下，對某種治療具有"難治性"的惡性腫瘤可對包括兩種或多種不同治療的組合治療產生反應。[0138]當將本文公開的多肽治療劑與另一常規抗腫瘤藥劑（同時或依次)聯合施用時，這些治療劑可提高該抗腫瘤藥劑的治療效果或者克服對該抗腫瘤藥劑的細胞抗性。這允許減少抗腫瘤藥劑的劑量，從而降低有害副作用，或者恢復抗腫瘤藥劑在抗性細胞中的有效性。[0139]根據本公開內容，本文所述的抗血管發生藥劑可與其它治療疾病的組合物和方法聯合使用。例如，可使用與ALKl或ALKl配體拮抗劑相聯合的手術、放療或化療來常規地治療腫瘤，隨后向患者施用該詰抗劑以延長微轉移(micrometastasis)的休眠以及穩定任何殘余的原發腫瘤。[0140]還可以將血管發生抑制劑預防性地給予已知具有發生新發癌癥或復發癌癥高風險的個體。因此，本公開內容的一個方面包括在對象中預防癌癥發生的方法，所述方法包括向該對象施用有效量的ALKl或ALKl配體拮抗劑和/或其衍生物或者本公開內容的另一種血管發生抑制劑。[0141]如本文所證明地，ALKl-Fc有效用于減輕類風濕性關節炎小鼠模型的表型。因此，本文公開的治療劑可用于治療類風濕性關節炎和其它類型的骨或關節炎癥。[0142]某些正常的生理過程也與血管發生有關，例如排卵、月經和胎盤形成。本公開內容的血管發生抑制蛋白可用于治療過度或異常刺激內皮細胞的疾病。這些疾病包括但不限于腸粘連、動脈粥樣硬化、硬皮病和肥厚性瘢痕（即瘢痕疙瘩）。它們還可用于治療以血管發生為病理性后果的疾病，例如貓抓病(catscratchdisease)(Rocheleminaliaquintosa)和潰瘍(幽門螺桿菌(1^1；[(3(^3(^61口7101'；0)。[0143]-般的血管發生抑制蛋白可用作生育控制劑，其通過降低或阻止胚胎著床所需的子宮血管發生來實現。因此當將足以阻止胚胎著床之量的所述抑制蛋白施用于雌性個體時，本公開內容提供了有效的生育控制方法。在所述生育控制方法的一個方面，在性交和受精發生前或發生后施用足以阻止胚胎著床之量的所述抑制蛋白，從而提供了生育控制的有效方法，有可能為"房事后施用(morningafter)"的方法。不希望受本說明書的約束，認為抑制子宮內膜的血管生成會干擾胚泡的著床。類似的對輸卵管粘膜血管生成的抑制會干擾胚泡的著床，防止輸卵管妊娠的發生。施用方法可包括但不限于藥片、注射(靜脈內、皮下、肌內）、栓劑、陰道海綿(vaginalsponge)、陰道棉條(vaginaltampon)和子宮內裝置。還認為，施用本公開內容的血管發生抑制劑會干擾胎盤的正常血管生成增加，還會干擾成功著床的胚泡以及發育中胚胎和胎兒內的血管發育。[0144]在眼中，血管發生與例如糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病(retinopathyofprematurity)、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼和晶狀體后纖維增生癥(retrolentalfibroplasia)相關。本文公開的治療劑可在眼內施用或通過其它施用至眼的局部施用來實現。另外，如實施例中所示，ALKl-Fc可全身施用，仍可對眼部血管發生具有期望效果。[0145]與眼中血管發生有關的其它疾病包括但不限于流行性角膜結膜炎（epidemickeratoconiunctivitis)、維生素A缺乏癥（VitaminAdeficiency)、隱形眼鏡過戴(contactlensoverwear)、特應性角膜炎（atopickeratitis)、上邊緣角膜炎（superiorlimbickeratitis)、干燥性翼狀胬肉角膜炎（pterygiumkeratitissicca)、舍格倫病(sjogren)、玫瑰痤瘡（acnerosacea)、小水皰病、梅毒（syphilis)、分支桿菌感染(Mycobacteriainfection)、脂質變性（lipiddegeneration)、化學燒傷、細菌性潰瘍(bacterialulcer)、真菌性潰瘍（fungalulcer)、單純皰疼感染（Herpessimplexinfection)、帶狀皰疼感染（Herpeszosterinfection)、原生動物感染（protozoaninfection)、卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)、莫倫潰瘍(Moorenulcer)、Terrie角膜邊緣性變性（Terrien'smarginaldegeneration)、邊緣性角質分離（mariginalkeratolysis)、類風濕性關節炎、系統性狼瘡（systemiclupus)、多動脈炎（polyarteritis)、創傷(trauma)、韋格納結節病(Wegenerssarcoidosis)、鞏膜炎(Scleritis)、史-約病(Stever/sJohnsondisease)、類天皰瘡放射狀角膜切開術(periphigoidradialkeratotomy)和角膜移植排斥(cornealgraftreiection)、鐮狀細胞貧血(sicklecellanemia)、結節病(sarcoid)、彈性假黃瘤（pseudoxanthomaelasticum)、佩吉特病（Pagetsdisease)、靜脈阻塞（veinocclusion)、動脈阻塞（arteryocclusion)、頸動脈阻塞性疾病（carotidobstructivedisease)、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎(chronicuveitis/vitritis)、分支桿菌感染(mycobacterialinfections)、萊姆病（Lyme'sdisease)、系統性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosis)、早產兒視網膜病（retinopathyofprematurity)、伊爾斯病(Ealesdisease)、白塞病（Bechetsdisease)、導致視網膜炎(retinitis)或脈絡膜炎(choroiditis)的感染、假定的眼組織胞衆菌病(presumedocularhistoplasmosis)、貝斯特病（Bestsdisease)、近視（myopia)、視凹（opticpit)、斯達加特病（Stargartsdisease)、睫狀體平坦部炎（parsplanitis)、慢性視網膜脫落（chronicretinaldetachment)、高粘滯綜合征（hyperviscositysyndromes)、弓形體病（toxoplasmosis)、創傷(trauma)和激光手術后并發癥(post-lasercomplication)。其它疾病包括但不限于與紅變（角新生血管（neovasculariationoftheangle))有關的疾病以及由纖維血管(fibrovascular)或纖維組織(fibroustissue)異常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃體視網膜病('^廿60代1：；[11(^31：1150。[0146]可通過以下方式來治療或預防眼部病癥，例如通過治療劑的全身、局部、眼內注射或通過植入釋放治療劑的持續釋放裝置來實現。可利用可藥用眼科裝置來遞送治療劑，從而使該化合物與眼表面維持接觸足夠的時間以使該化合物穿透眼的角膜和內部區域(例如前房（anteriorchamber)、后房（posteriorchamber)、玻璃體（vitreousbody)、房水(aqueoushumor)、玻璃體液（vitreoushumor)、角膜（cornea)、虹膜/睫狀體（iris/ciliary)、晶狀體、脈絡膜/視網膜(choroid/retina)和鞏膜(sclera)。所述可藥用的眼科載體可以是例如軟膏、植物油或包裹材料。或者，本公開內容的治療劑可直接注射進玻璃體液或房水中。在另一替代性方案中，可全身施用所述化合物進行眼部治療，例如通過靜脈內輸注或注射來實現。[0147]可施用一種或多種治療劑。本公開內容的方法還包括與用于治療眼部病癥的其它藥物共施用。當施用多于一種藥劑或者藥劑和藥物組合時，可同時施用或依時間前后施用。可通過不同施用途徑或通過同樣的施用途徑來施用所述治療劑和/或藥物。在一個實施方案中，治療劑和藥物以眼科藥物制劑的形式一起施用。[0148]在一個實施方案中，使用治療劑來治療與眼中血管發生有關的疾病，其通過與利用藥物機制阻斷血管發生的其它藥物同時施用來實現。可與本公開內容的治療劑同時施用的藥物包括但不限于：倍加他尼（Macugen?)、雷珠單抗（Lucentis?)、乳酸角鯊胺(squalaminelactate)(EvizonTM)、肝素酶(heparinase)和糖皮質激素（例如曲安西龍(Triamcinolone))。在一個實施方案中，提供了治療血管發生相關疾病的方法，其通過施用含有至少一種本文公開之治療劑和至少一種以下藥物的眼科藥物制劑來治療：倍加他尼(Macugen?)、雷珠單抗(Lucentis?)、乳酸角藍胺(Evizon?)、肝素酶和糖皮質激素(例如曲安西龍）。[0149]7.制劑和有效劑量[0150]可將本文所述的治療劑配制成藥物組合物。按照本公開內容使用的藥物組合物可使用一種或多種生理可接受的載體或賦形劑以常規方式進行配制。這樣的制劑通常基本不含熱原，以符合大多數法規要求。[0151]在一些實施方案中，本公開內容的治療方法包括全身性或者作為植入物或裝置局部地施用所述組合物。當施用時，本公開內容中使用的治療組合物是無熱原、生理可接受的形式。組合物中除ALKl信號傳導拮抗劑以外的可任選含有的上述治療用藥劑可與本文公開之方法中的目的化合物（例如，本文公開的ALKlECD多肽或任何抗體）同時施用或依次施用。[0152]通常，本文公開的蛋白質治療劑經胃腸外施用，特別是靜脈內或皮下施用。適于胃腸外施用的藥物組合物可包含一種或多種ALKlECD多肽或其它抗體并聯合一種或多種藥物可接受的無菌等滲水溶液或非水溶液、分散體系、混懸液或乳劑、或可在使用前被重構成無菌注射用溶液或分散體系的無菌粉末，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與目標接受者之血液等滲的溶質或者助懸劑或增稠劑。本公開內容的藥物組合物中可用的合適的水性載體和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當的混合物、植物油（例如橄欖油）以及可注射有機酯（例如油酸乙酯）。可保持適當的流動性，例如通過使用涂層物質（例如卵磷脂）、（在膠體溶液的情形中）通過保持所需顆粒大小以及通過使用表面活性劑來實現。[0153]在一個實施方案中，本文公開的抗體和ALKlE⑶蛋白采用眼科藥物制劑的形式來施用。在一些實施方案中，所述眼科藥物制劑是無菌水溶液(優選合適的注射用濃度)或者油膏（salve)或軟膏(ointment)。這樣的油膏或軟膏通常包含溶于或懸于無菌可藥用油膏或軟膏基質（例如礦物油-白凡士林基質）中的一種或多種本文公開的抗體或ALKlECD蛋白。在油膏或軟膏組合物中，所述制劑中還可包含無水羊毛脂。硫柳汞或氯代丁醇也優選作為抗微生物劑被添加至所述軟膏組合物中。在一個實施方案中，所述無菌水溶液描述于美國專利No.6,071,958中。[0154]本公開內容提供了包含酸和堿以調節pH的可變化的制劑;將pH保持在一窄范圍內的緩沖劑。可將另外的藥物添加至所述制劑中。這些藥物包括但不限于倍加他尼、肝素酶、雷珠單抗或糖皮質激素。通過無菌操作來制備本公開內容的眼科藥物制劑，或者在制備的適當階段進行滅菌處理。[0155]如果需要，所述組合物和制劑可采用包(盒、袋)或分配裝置的形式提供，其可包含含有活性成分的一個或多個單位劑型。所述包(盒、袋)可例如包含金屬箱或塑料箱，例如吸塑包裝(blisterpack)。所述包(盒、袋)或分配裝置可帶有施用說明。[0156]實施例[0157]實施例1=ALKl-Fc融合蛋白的表達[0158]【申請人】構建了包含融合有人Fc的人ALKl細胞外結構域或融合有小鼠Fc結構域的小鼠ALKl的可溶性ALKl融合蛋白，其中所述ALKl和Fc結構域之間具有最小接頭。所述構建體分別表示為MLKl-Fc^PmALKl-Fc0[0159]圖3顯示從CHO細胞系純化的hALKl-Fc(SEQIDN0:3)。值得注意的是，盡管慣常的人ALKl蛋白細胞外結構域C端是SEQIDNO:1的118位氨基酸，但我們已證實避免以谷氨酰胺殘基結尾的結構域是理想的。因此，源自人ALKl的SEQIDNO:3的部分在Ql18之C端并入兩個殘基一一亮氨酸和丙氨酸。因此，本公開內容提供了ALKlECD多肽(包含Fc融合蛋白），其ALKl來源序列的C端包含Q118上游(SEQIDNO:1的113-117位)或下游（119-123位)的1~5個氨基酸。[0160]所述hALKl-Fc和mALKl-Fc蛋白表達在CHO細胞系中。考慮三種不同的前導序列：：[0161](i)蜜蜂蜂毒素(HBML):MKFLVNVALVFMWYISYIYA(SEQIDN0:7);[0162](ii)組織型纖維蛋白溶酶原激活蛋白（tissueplasminogenactivator，TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQIDNO：8)；[0163](iii)天然的：MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG(SEQIDN0:9)。[0164]所選形式使用了TPA前導序列并具有圖4中所示的未加工氨基酸序列（SEQIDNO:5)〇[0165]該多肽由圖4中所示核酸序列（SEQIDN0:4)編碼。[0166]可通過一系列柱層析步驟實現純化，包括例如采用任何順序的以下中三種或更多種：蛋白A層析、Qsepharose層析、phenylsepharose層析、大小排阻層析和陽離子交換層析。可使用病毒過濾和緩沖劑交換來完成純化。將MLKl-Fc蛋白純化至純度>98%(通過大小排阻層析來確定）以及>95%(通過SDSPAGE來確定）。[0167]在蛋白質產生和純化過程中，我們觀察到，盡管在變性、還原性條件下(例如，還原性SDS-PAGE)hALKl-Fc顯示為純的，但其傾向于以二聚體與更高級聚集體的混合物表達，這會對向患者施用帶來問題。所述聚集體可以是免疫原性的或生物利用度低的，并且由于其不均一性，這些聚集體難以賦予藥物制劑以藥物開發期望水平的特征。因此，已測試多種方法來降低最終制劑中聚集體的量。[0168]在一個方法中，測試了多種不同的細胞培養基。ISCHO-CD(貨號91119，IrvineScientific，SantaAna，CA)顯示顯著降低了聚集體產物的產生，同時保持了hALKl-Fc的高水平產生。此外，在pH8.0將材料從疏水相互作用柱(如苯基瓊脂糖)進行洗脫使得聚集產物進一步分離。所得的材料包含超過99%的二聚體。與R&DSystems(貨號370-AL，Minneapolis，MN)所售ALKl-Fc融合蛋白的比較顯示，在NSO細胞中產生的該蛋白質的84%為二聚體，其余的蛋白質經大小排阻層析顯示為高分子量種類。圖11顯示制劑的大小排阻柱譜圖的比較。由于已確定聚集體的形成是ALKl-Fc生產的重要問題，預期可以開發出其它方法，包括涉及額外純化步驟的方法(盡管此種步驟可導致純化蛋白的低產量）。[0169]實施例2=ALKl-Fc配體的鑒定[0170]ALKl是TGFP家族成員的I型受體。使用Biacore?系統測試了TGFP家族多種成員與人ALKl-Fc融合蛋白的結合。TGFP本身、GDF8、⑶F11、BMP2和BMP4均不顯示與hALKl-Fc蛋白的顯著結合。BMP2和BMP4顯示有限的結合。GDF5、⑶F7和BMP9分別顯示Kd值約為5X10-8M、5XHT8M和IX的結合。基于⑶F5和⑶F7與⑶F6的相似性，預計⑶F6會以類似的親和力結合。BMP10與BMP9密切相關，因此也預期BMP10以類似的親和力結合。[0171]實施例3:表征ALKl-Fc和抗ALKl抗體對內皮細胞的作用[0172]使用受四個連續的相同SBE位點調控的螢光素酶報告基因構建體(SBE4-1UC)，其響應于Smadl/5/8介導的信號傳導，我們在HMVEC細胞中測量了在hALKl-Fc藥物或中和性ALKl特異性單克隆抗體存在和不存在時BMP-9介導的活性。HMVEC細胞被誘導Smadl/5/8介導之轉錄活化的rhBMP-9(50ng/ml)所刺激，在這里由SBE4-luc調節之轉錄上調的增加顯示。當添加后，hALKl-Fc化合物（10μg/ml)或抗體（10μg/ml)降低了該轉錄應答，每種均降低了幾乎60%，這表明ALKl-Fc的存在顯著降低了BMP9信號傳導，并且BMP9信號傳導與ALKl活性有關。[0173]常使用SMAD磷酸化的活化來測定上游激活蛋白受體的活化。已知ALKl在被其配體活化后調節SMAD蛋白1、5和8的磷酸化。在這里，我們添加rhBMP-9(50ng/ml)，在30分鐘時程期間起始HUVEC細胞中的SMAD磷酸化，所述HUVEC細胞是固有表達ALKl受體的人內皮細胞系。在用所述配體處理細胞5分鐘后觀察到SMAD1/5/8的磷酸化，并且在整個30分鐘期間保持磷酸化。在相對低濃度的hALKl-Fc(250ng/ml)存在時，SMAD1/5/8磷酸化減少，證明該藥劑抑制內皮細胞中的Smad1/5/8活化。[0174]為了評價ALKl-Fc在體外系統中對血管發生的作用，我們測定了該化合物對減少Matrigel基底上內皮細胞管形成的有效性。該技術常用于評估新血管生成，其可得到快速且高重復性的結果。使用內皮細胞生長添加劑(ECGS)來誘導從Matrigel上由內皮細胞形成微血管，然后在18小時時程期間，在所述藥物和ECGS存在下，測量抗血管發生化合物減少管形成的效果。正如預期的一樣，與陰性對照(未施加處理)相比，添加ECGS(200ng/ml)誘導顯著的管形成，這表明在Matrigel基底上產生了基礎水平的內皮細胞管形成（圖5)。添加了1^1(1-?〇(10〇1^/1111)或11^1(1-?(3(10〇1^/1111)之后，可觀察到管形成的減少。最后對所有樣品中的管長度定量測定表明，各種濃度的hALKl-Fc或mALKl-Fc均將新生血管發生減少至基礎水平。另外，在強的促血管發生因子ECGS存在時，hALKl-Fc和mALKl-Fc對新血管生成保持強的抑制，這表明其比陰性對照內皮抑素(lOOng/ml)具有更強的抗血管發生活性。[0175]實施例4:CAM檢測[0176]VEGF和FGF刺激血管發生是眾所周知的。使用CAM(雞絨毛尿囊膜)測定系統來評估GDF7的血管發生作用。如圖6所示，⑶F7刺激血管發生的效力與VEGF類似。使用GDF5和⑶F6也觀察到類似的結果。[0177]在CAM測定中測試ALKl-Fc融合蛋白的抗血管發生活性。這些融合蛋白對由VEGF、FGF和⑶F7刺激的血管發生顯示出強的抗血管發生作用。參見圖7。在該測定中，BMP9和TOGF顯示出相對較弱的血管發生誘導能力，盡管如此，這些因子的血管發生作用仍被ALKl抑制。[0178]在CAM測定中將ALKl-Fc蛋白與市售抗血管發生的抗VEGF單克隆抗體進行比較。與抗VEGF相比，ALKl-Fc蛋白具有相似的效力。抗VEGF抗體貝伐單抗目前用于在人中治療癌癥和黃斑變性。參見圖8。[0179]令人感興趣的是，在該測定系統中抗ALKl抗體(R&DSystems)不能顯著抑制血管發生。我們預計這可能反映出不同物種中ALKl序列的差異。[0180]實施例5:小鼠角膜微囊袋測定[0181]小鼠角膜微囊袋測定用于評估ALKl-Fc對小鼠眼中血管發生的作用。經腹膜內施用的hALKl-Fc顯著抑制眼部血管發生。如圖9所示，hALKl-Fc與抗VEGF抑制眼部血管發生的程度相同。MLKl-Fc和抗VEGF以同樣的重量/重量劑量使用。當將灌滿VEGF的Matrigel栓植入非眼部位置時，得到了類似的數據。[0182]這些數據表明ALKl的高親和力配體促進血管發生，ALKl-Fc融合蛋白具有強的抗血管發生活性。ALKl的配體歸為兩類，其中⑶F5、6、7組具有針對ALKl的中等親和力，BMP9、10組具有針對ALKl的高親和力。[0183]GDF5、6和7主要定位于骨和關節，而BMP9在血液中循環。因此，似乎存在骨和關節的促血管發生系統（其包含ALKl、GDF5、6和7)以及全身的血管發生系統（其包含ALKl和BMP9,以及可能的BMP10)。[0184]實施例6:小鼠類風濕性關節炎模型[0185]膠原誘導的關節炎小鼠模型是廣泛接受的類風濕性關節炎模型。在該研究中，用載體、抗VEGF(貝伐單抗--作為陰性對照，因為貝伐單抗不抑制小鼠VEGF)或lmg/kg、10mg/kg或25mg/kg劑量的mALKl-Fc("RAP-041"）處理每組10只的小鼠組。在第21天用膠原加強后，所有組中的關節炎評分(參見圖10)和爪腫脹均持續提高，在約第38天時到達峰值。用mALKl-Fc("RAP-041"）處理的小鼠顯示出上述兩項特征評分的降低，尤其是在最高劑量(25mg/kg)時，盡管該降低不具有統計學顯著性。但是，劑量相關性趨勢是明顯的。[0186]通過研究第42天結束時的情形，關節炎的發生已達到：在用載體對照處理的小鼠中為10/10,在用貝伐單抗處理的小鼠中為9/10,在lmg/kgmALKl-Fc處理組中為8/10,在10mg/kgmALKl-Fc處理組中為9/10。在25mg/kgmALKl-Fc處理組中疾病發生降低至6/10。[0187]實施例7:DAN的配體結合特性[0188]DAN是分泌型胱氨酸結蛋白家族的成員，其抑制BMP活性。已知DAN結合并拮抗GDF5。我們已測定DAN還緊密結合GDF7，但不結合BMP9。因此，我們得出結論:DAN抑制定位于骨和關節的ALKl配體組，并預計DAN是骨和關節相關血管發生的強拮抗劑。因此，DAN可用于治療骨癌，例如多發性骨髓瘤和骨轉移，以及類風濕性關節炎和骨關節炎。[0189]綜上，這些實施例公開的發現提供了本文所述的多種試劑用于體內抑制血管發生，特別是眼部血管發生。這些發現還表明，靶向⑶F5、6和7的藥劑可用于選擇性地抑制骨和關節血管發生。這些發現還表明這些藥劑可用于治療癌癥和類風濕性關節炎。[0190]實施例8=ALKl-Fc在CAM測定中減少腫瘤血管發生[0191]任何組織的腫瘤都有基本的營養和氧氣需求。盡管小腫瘤可從鄰近血管的擴散中獲得足夠的量，但隨著腫瘤大小的增加，其必須通過募集和維系已存在的毛細血管來確保營養供應。為了測試ALKl-Fc蛋白通過抑制血管而限制腫瘤生長的能力，我們在黑素瘤外植體CAM測定中測試了不同濃度的mALKl-Fc。與上述CAM測定一樣，在每個蛋表面開小孔，并通過該小孔植入5X105個B16黑素瘤細胞。然后，每天用0.02mg/mlmALKl-Fc、0.2mg/mlmALKl-Fc處理蛋，持續一周，或者不進行處理。在實驗結束時，小心取出腫瘤，稱重并獲取數碼圖像。與未處理的CAM腫瘤相比，源自用mALKl-Fc處理的CAM腫瘤的大小顯示顯著的體積減小。對腫瘤重量定量表明，與未處理的CAM相比，每天用0.02mg/ml或0.2mg/mlmALKl-Fc處理的腫瘤的重量分別有65%和85%的降低（圖6E)。結論是，加入ALKl-Fc使新血管發生和腫瘤生長以劑量響應的方式被顯著抑制，這表明ALKl-Fc是強的抗血管發生藥劑。[0192]實施例9:肺癌實驗模型[0193]為了進一步證實ALKl-Fc對腫瘤進展的作用，測試了小鼠肺癌模型。將熒光標記的鼠Lewis肺癌細胞(LL/2-luc)經由尾靜脈施加到白化Black6小鼠中。在同一天，開始用經腹膜內施加的PBS對照(n=7)或10mg/kgmALKl-Fc(n=7)處理小鼠。活體焚光成像顯示了對照小鼠中肺部腫瘤的顯著進展，以致于在植入后22天小鼠已瀕臨死亡，并只能進行處死。與之相反，經ALKl-Fc處理的小鼠顯示了顯著的肺腫瘤生長延遲，在第22天時仍具有100%的存活率。見圖12。[0194]這些數據表明，ALKl-Fc對肺癌小鼠模型中的腫瘤生長有明顯的作用，并有益于存活。[0195]實施例10:ALKl-Fc蛋白對胰腺腫瘤模型的作用[0196]SV40大T抗原是癌基因，其可在小鼠的多種不同組織中表達從而刺激小鼠中自發、同位腫瘤的形成。與常用的異種移植模型相比，這些腫瘤可具有與天然腫瘤更大的相似性。在RIPl-Tag2小鼠中，對小鼠進行遺傳改造從而在胰島素啟動子的控制下表達T抗原，這樣小鼠會特異性地在胰腺內分泌組織中生成腫瘤。我們測試了ALKl-Fc對RIPl-Tag2腫瘤的作用。[0197]我們觀察到RIPl_Tag2小鼠的胰腺組織經歷一系列階段，開始為正常組織，然后表現出增生，經歷血管發生形成顯著的新血管系統，并最終產生成形的腫瘤。在這些不同階段監測了組織中ALKl和BMP9的表達。結果顯示在圖13中。在腫瘤生成的血管發生階段ALKl的表達到達峰值，而BMP9的表達則在腫瘤生成的整個過程中升高。[0198]從10周齡(腫瘤生成早期)或12周齡(腫瘤生成成熟期)開始，用mALKl-Fc或對照Fc(每只小鼠300微克，或約12mg/kg，一周兩次，持續2周）處理RIPl-Tag2小鼠。在每種情形中，mALKl-Fc的處理都基本停止了腫瘤的生長。見圖14。值得注意的是，在10周齡進行處理的小鼠的腫瘤體積在10周到12周期間未增加，而用對照Fc蛋白處理的小鼠在相同的期間內腫瘤體積增加為3倍。類似地，在12周齡進行處理的小鼠的腫瘤體積在12周到14周期間未增加，但對照組則顯示腫瘤體積又增加了30%。[0199]如對⑶31(內皮細胞標志物)進行染色所測量地，對經處理和對照腫瘤的熒光染色顯示mALKl-Fc處理導致血管化降低。圖15。明顯地，如通過NG2陽性細胞（周細胞)與CD31陽性細胞的比值而測量地，mALKl-Fc處理使得腫瘤血管的周細胞包裹升高。見圖16。周細胞是形成血管之一部分并在調節血管穩定性和滲透性中起作用的細胞。在用CaLu6非小細胞肺癌細胞系的異種移植腫瘤模型中，觀察到周細胞包裹響應于ALKl-Fc處理的類似升高。[0200]總之，這些數據顯示ALKl-Fc是RIPl-Tag2小鼠中形成的自發、同位胰腺腫瘤中腫瘤生長的強效抑制劑，且腫瘤抑制與腫瘤血管化的顯著降低和腫瘤血管周細胞包裹的顯著升高相關。后者對腫瘤生物學的意義仍待確定。然而，應注意，糖尿病性視網膜病的病理很大程度上歸因于周細胞的缺失以及從糖尿病性視網膜血管的流體泄漏。因此，這些數據表明ALKl-Fc可用作抗腫瘤/抗血管發生藥劑，進一步地，該藥劑可用于促進血管化組織中周細胞的形成。[0201]實施例11=ALKl-Fc融合蛋白對乳腺癌腫瘤模型的作用[0202]mALKl-Fc有效地延遲了源自雌激素受體陽性(ER+)和雌激素受體陰性(ER-)兩種腫瘤細胞的乳腺癌腫瘤細胞系的生長。[0203]用螢光素酶基因穩定轉染MDA-MB-231乳腺癌細胞系(源自ER-細胞）以允許體內檢測腫瘤生長和潛在轉移。在本研究中，將IXIO6個MDA-MB-231-LUC細胞同位植入無胸腺裸鼠（Harlan)的乳房脂肪墊中。用IVIS光譜成像系統(CaliperLifeSciences)通過生物發光檢測來跟蹤腫瘤進展。發光(所檢測的光子數)的提高對應于腫瘤負荷的增加。[0204]將IXIO6個腫瘤細胞注射入30只雌性裸鼠的乳房脂肪墊中。腫瘤植入3天后通過皮下（SC)注射用對照載體或mALKl-Fc(30mg/kg)每周2次處理小鼠。繼續進行處理，并利用生物發光成像監測腫瘤進展，持續10周。利用生物發光檢測，與載體處理的對照相比，用30mg/kgmALKl-Fc進行處理減緩了腫瘤進展（圖17)。在該模型中，用mALKl-Fc處理延遲了腫瘤生長，但并沒有逆轉腫瘤生長。這是抗血管發生化合物的可預期作用，即腫瘤可以在需要新血管形成以支持其繼續生長之前存活至一定體積。在一個類似的實驗中，在低至3mg/kg的劑量水平下，hALKl-Fc產生了類似(稍小）的作用。[0205]還在同位植入模型中測試了雌激素受體陽性(ER+)的表達螢光素酶的細胞系MCF-7。在該模型中，在雌性裸鼠皮下植入17β-雌二醇的60天緩釋顆粒。在植入顆粒兩天后，將5\106個1^-7腫瘤細胞植入乳房脂肪墊中。經腹膜內途徑用載體對照或3、10和3〇11^/1^的hALKl-Fc處理小鼠，一周2次。用IVIS光譜成像儀(CaliperLifeSciences)通過生物發光成像每周跟蹤腫瘤進展。在載體處理的小鼠中，腫瘤快速進展直至研究第26天（圖18)。26天后腫瘤發光有起伏，一直持續到第60天本研究終止時（當雌二醇顆粒耗盡時）。這些起伏是該模型的常見特點，即腫瘤快速生長可超過宿主動物的血管發生應答，導致腫瘤壞死并伴隨著發光信號的下降。存留的細胞繼續生長并導致信號增強。與載體處理的對照相比，用10或30mg/kghALKl-Fc處理的小鼠可在本研究期間使腫瘤大小維持在恒定的水平，這表明該分子對腫瘤生長的強效作用。[0206]通過引用并入[0207]本文提及的所有出版物和專利均通過引用整體并入本文，如同指明每篇出版物或專利具體地以及單獨地通過引用并入本文一樣。在存在矛盾時，以本申請(包括本文中的任意定義)為準。[0208]等同方案[0209]盡管本發明的【具體實施方式】在本文中明確地公開，以上說明書是示例性的而非限制性的。通過閱讀本說明書和權利要求書，本發明的許多變化形式對本領域技術人員來說是顯而易見的。本發明的完整范圍應參考權利要求書及其等同方案的完整范圍以及說明書連同所述變化形式來確定。[0210]以下內容對應于母案申請中的原始權利要求書，現作為說明書的一部分并入此處：[0211]1.包含ALKl-Fc融合蛋白的藥物制劑，所述融合蛋白包含：具有與SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列有至少97%同一性的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于IXHT7M的Kd結合⑶F5、⑶F7和BMP9,以大于IX10_6的Kd結合TGFI3-1，并且其中所述ALKl-Fc融合蛋白的至少90%以二聚體形式存在。[0212]2.項1的藥物制劑，其中所述ALKl-Fc融合蛋白的Fc部分是人IgGl的Fc部分。[0213]3.項1的藥物制劑，其中所述AUQ-Fc融合蛋白包含SEQIDN0:3的氨基酸序列。[0214]4.項1的藥物制劑，其中所述ALKl-Fc融合蛋白通過在哺乳動物細胞系中表達SEQIDNO:4的核酸來產生。[0215]5.項4的藥物制劑，其中所述ALKl-Fc融合蛋白通過在中國倉鼠卵巢(CH0)細胞系中表達SEQIDN0:4的核酸來產生。[0216]6.項1的藥物制劑，其中所述藥物制劑為適于施用于眼部的藥物制劑。[0217]7.項1-6中任一項的藥物制劑，其中所述ALKl-Fc融合蛋白的至少95%以二聚體形式存在。[021S]8.項I-6中任一項的藥物制劑，其中所述ALKI-Fe融合蛋白的至少99%以二聚體形式存在。[0219]9.在有此需要的哺乳動物中抑制血管發生的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用有效量的項1之藥物制劑。[0220]10.在有此需要的哺乳動物中治療腫瘤的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用有效量的項1之藥物制劑。[0221]11.在有此需要的哺乳動物中治療血管發生相關眼部疾病的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用有效量的項1之藥物制劑。[0222]12.在有此需要的哺乳動物中治療類風濕性關節炎的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用有效量的項1之藥物制劑。[0223]13.項9-12中任一項的方法，其中所述方法還包括施用抑制血管發生的另一種藥劑。[0224]14.在有此需要的哺乳動物中促進血管化組織中周細胞包裹提高的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用有效量的ALKlE⑶蛋白。[0225]15.項14的方法，其中所述ALKlE⑶蛋白是ALKl-Fc融合蛋白。[0226]16.項15的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白包含具有與SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fe部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXHT6的Kd結合TGF0-1。[0227]17.項14的方法，其中所述ALKIECD蛋白結合選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10的一種或多種ALKl配體。[0228]18.項14的方法，其中所述ALKlECD多肽包含與對應于SEQIDNO:1之34-95位氨基酸的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。[0229]19.項14的方法，其中所述ALKlECD包含由在嚴格雜交條件下與SEQIDN0:2之100-285位核苷酸或者SEQIDN0:2之100-285位核苷酸的編碼相同氨基酸序列的變體雜交的核酸所編碼的氨基酸序列。[0230]20.項15的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。[0231]21.項15的方法，其中所述ALKI-Fe融合蛋白在藥物制劑中施用，其中所述ALKI-Fe融合蛋白的至少90%為二聚體形式。[0232]22.項14的方法，其中所述ALKlE⑶融合蛋白經靜脈內遞送或局部遞送至眼。[0233]23.項14的方法，其中所述方法還包括施用抑制血管發生的另一種藥劑。[0234]24.項14的方法，其中所述血管化組織選自腫瘤、骨、關節和哺乳動物的眼。[0235]25.項14的方法，其中所述哺乳動物患有糖尿病性視網膜病或者特征在于視網膜血管中周細胞包裹缺失的其它視網膜疾病。[0236]26.項14的方法，其中所述哺乳動物患有選自黑素瘤、肺腫瘤、多發性骨髓瘤和乳腺癌的腫瘤。[0237]27.項14的方法，其中所述哺乳動物患有胰腺腫瘤。[0238]28.項27的方法，其中所述哺乳動物患有胰腺內分泌組織腫瘤。[0239]29.在有此需要的哺乳動物中促進血管化組織中周細胞包裹提高的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用有效量的與ALKl多肽結合并抑制選自GDF5、GDF6、GDF7、BMP^PBMPlO之至少一種ALKl配體結合的抗體，所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成。[0240]30.項29的方法，其中所述抗體以小于5XHT8M的Kd結合所述ALKl多肽。[0241]31.項29的方法，其中所述抗體以小于IX10_1()M的Kd結合所述ALK1多肽。[0242]32.項29的方法，其中所述抗體抑制ALK1與ALK1配體的結合，其中所述ALK1配體選gBMP^BMP10〇[0243]33.項29的方法，其中所述抗體經靜脈內遞送。[0244]34.項29的方法，其中所述方法還包括施用抑制血管發生的另一種藥劑。[0245]35.項29的方法，其中所述血管化組織選自腫瘤、骨、關節和哺乳動物的眼。[0246]36.項29的方法，其中所述哺乳動物患有糖尿病性視網膜病或者特征在于視網膜血管中周細胞包裹缺失的其它視網膜疾病。[0247]37.項29的方法，其中所述哺乳動物患有選自黑素瘤、肺腫瘤、多發性骨髓瘤和乳腺癌的腫瘤。[0248]38.項29的方法，其中所述哺乳動物患有胰腺腫瘤。[0249]39.項38的方法，其中所述哺乳動物患有胰腺內分泌組織腫瘤。[0250]40.用于治療哺乳動物中腫瘤的方法，該方法包括向患有腫瘤的哺乳動物施用有效量的選自以下的藥劑：[0251](a)ALKlECD蛋白；[0252](b)結合ALK1配體并抑制所述ALK1配體與ALK1結合的抗體，其中所述ALK1配體選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10;[0253](c)結合ALKl多肽并抑制選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMPlO之至少一種ALKl配體結合的抗體，其中所述ALKl多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成;和[0254]⑷DAN多肽，[0255]其中所述腫瘤選自：黑素瘤、多發性骨髓瘤、骨相關腫瘤、已轉移至骨的腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤和乳腺癌。[0256]41.項40的方法，其中所述ALKlE⑶蛋白是ALKl-Fc融合蛋白。[0257]42.項41的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白包含具有與SEQIDNO:1之22-118位氨基酸所示序列有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXHT6的Kd結合TGF0-1。[0258]43.項40的方法，其中所述ALK1ECD蛋白結合選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10的一種或多種ALKl配體。[0259]44.項41的方法，其中所述ALKl-Fc融合蛋白具有SEQIDN0:3的序列。[0260]45.項40的方法，其中所述ALKlECD多肽包含與對應于SEQIDNO:1之34-95位氨基酸的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。[0261]46.項40的方法，其中所述ALKlECD包含由在嚴格雜交條件下與SEQIDN0:2之100-285位核苷酸或者SEQIDNO:2之100-285位核苷酸的具有相同編碼序列的變體雜交的核酸所編碼的氨基酸序列。[0262]47.項40的方法，其中（b)中所述抗體以小于5XHT8M的Kd結合所述ALKl多肽。[0263]48.項40的方法，其中（b)中所述抗體以小于IX10-iqM的Kd結合所述ALK1多肽。[0264]49.項40的方法，其中（b)中所述抗體抑制由選自GDF5、GDF6和GDF7的至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。[0265]50.項40的方法，其中（b)中所述抗體抑制ALK1與ALK1配體的結合，其中所述ALK1配體選自BMro和BMPlO。[0266]51.項40的方法，其中（c)中所述抗體抑制由選自GDF5、GDF6和GDF7的至少一種ALKl配體所刺激的血管發生。[0267]52.項40的方法，其中（c)中所述抗體抑制由選自BMP9和BMP10的至少一種ALK1配體所刺激的血管發生。[0268]53.項40的方法，其中所述DAN蛋白是DAN-Fc融合蛋白。[0269]54.項53的方法，其中所述DAN-Fc融合蛋白包含具有與SEQIDNO:10之21-125位氨基酸所示序列有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，其中所述ALKl-Fc融合蛋白以大于IXHT6的Kd結合TGF0-1。[0270]55.項40的方法，其中所述DAN蛋白結合選自GDF5、GDF6和⑶F7的一種或多種ALKl配體。[0271]56.項40的方法，其中所述DAN蛋白包含與對應于SEQIDNO:10之17-180位氨基酸的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。[0272]57.項40的方法，其中所述DAN蛋白包含由在嚴格雜交條件下與SEQIDNO:11之153-467位核苷酸或者SEQIDNO:11之153-467位核苷酸的具有相同編碼序列的變體雜交的核酸所編碼的氨基酸序列。[0273]58.項40的方法，其中所述藥劑經靜脈內遞送。[0274]59.項40的方法，其中該方法還包括施用抑制血管發生的另一種藥劑。[0275]60.項10的方法，其中所述腫瘤選自：黑素瘤、肺腫瘤、多發性骨髓瘤、胰腺腫瘤和乳腺癌。【主權項】1.包含ALKl-Fc融合蛋白的藥物制劑，所述融合蛋白包含：具有與SEQIDN0:1之22-118位氨基酸所示序列有至少97%同一性的氨基酸序列的多肽，該多肽與免疫球蛋白的Fc部分融合，并且其中所述ALKl-Fc融合蛋白以小于1X10_7M的KD結合⑶F5、GDF7和BMP9,以大于1X10_6的KD結合TGFI3-1，并且其中所述ALKl-Fc融合蛋白的至少90%以二聚體形式存在。2.權利要求1的藥物制劑，其中所述ALKl-Fc融合蛋白包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。3.權利要求1的藥物制劑，其中所述藥物制劑為適于施用于眼部的藥物制劑。4.權利要求1的藥物制劑在制備用于在有此需要的哺乳動物中抑制血管發生之藥物中的用途。5.權利要求1的藥物制劑在制備用于在有此需要的哺乳動物中治療腫瘤之藥物中的用途。6.權利要求1的藥物制劑在制備用于在有此需要的哺乳動物中治療血管發生相關眼部疾病之藥物中的用途。7.權利要求4-6中任一項的用途，其中所述權利要求1的藥物制劑與抑制血管發生的第二藥劑組合使用。8.ALK1ECD蛋白在制備用于在有此需要的哺乳動物中促進血管化組織中周細胞包裹提高之藥物中的用途。9.抗體在制備用于在有此需要的哺乳動物中促進血管化組織中周細胞包裹提高之藥物中的用途，其中所述抗體結合ALK1多肽并抑制選自⑶F5、GDF6、⑶F7、BMP9和BMP10之至少一種ALK1配體結合，其中所述ALK1多肽由SEQIDΝΟ:1的22-118位氨基酸組成。10.選自以下的藥劑在制備用于在哺乳動物中治療腫瘤之藥物中的用途：(a)ALKlECD蛋白；(b)結合ALK1配體并抑制所述ALK1配體與ALK1結合的抗體，其中所述ALK1配體選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10;(c)結合ALK1多肽并抑制選自GDF5、⑶F6、GDF7、BMP9和BMP10之至少一種ALK1配體結合的抗體，其中所述ALK1多肽由SEQIDNO:1的22-118位氨基酸組成;和(d)DAN多肽，其中所述腫瘤選自：黑素瘤、多發性骨髓瘤、骨相關腫瘤、已轉移至骨的腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤和乳腺癌。【文檔編號】A61P35/00GK105963695SQ201610297436【公開日】2016年9月28日【申請日】2009年5月1日【發明人】阿斯亞·格林貝格,約翰·克諾夫,拉溫德拉·庫馬爾,羅伯特·斯科特·皮爾索爾,亞斯比爾·西拉,克里斯蒂安·彼得拉斯【申請人】阿塞勒隆制藥公司,路德維格癌癥研究有限公司