CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法
【專利摘要】本發明提供一種CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，通過根據GenBank CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性后應用RNA structure 4.4軟件對靶mRNA序列的二級結構進行評估，得到19nt靶序列；然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈；然后環狀空質粒酶切后，酶切片段連接PLVX.1載體與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體，連接產物轉化新鮮感受態細胞E.coli DH5α，37℃培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒。
【專利說明】
CXCR4RNA i慢病毒載體的構建方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法。
【背景技術】
[0002] 當前在世界范圍內肺癌發病率逐年上升，每年大約有超過一百萬人死于肺癌，已 成為惡性腫瘤最常見死因之一，肺癌約30%患者在病程中出現顱腦轉移，腦轉移瘤自然生存 時間為1~3個月，是惡性腫瘤嚴重并發癥之一，顱腦轉移為肺癌死亡的重要原因之一。趨化 因子是一類具有生物化學趨化性的細胞因子，其中SDF-I及其特異性受體CXCR4在腫瘤細 胞的迀移與侵襲中發揮了重要的作用。研究顯示SDF-I及其受體CXCR4組成的信號傳導通 路可能與肺癌的發生、發展及顱腦轉移關系密切。在非小細胞肺癌早期診斷和治療中，侵襲 和轉移是非小細胞肺癌治療效果不佳的主要因素。為了更好的研究CXCR4/SDF-1生物學軸 在非小細胞肺癌侵襲及轉移特別是腦轉移中的作用，本研究采用具有腦轉移潛能的肺癌細 胞PC-9構建細胞模型，通過設計針對CXCR4基因序列的shRNA片段，構建慢病毒shRNA干擾表 達載體，從而特異性的靶向沉默肺癌細胞CXCR4基因的表達。慢病毒介導的shRNA干擾的特 點是高效、穩定且靜默持續時間長，為進一步研究SDF-1/CXCR4生物學軸在非小細胞肺癌顱 腦轉移中的作用提供了工具。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的在于提供一種CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： CXCR4RNAi慢病毒載體，所述載體含有CXCR4基因片段。
[0005] CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，包括如下： (1)干擾序列設計:根據GenBank CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性 后應用RNA structure 4.4軟件對祀mRNA序列的二級結構進行評估，得到19nt靶序列;然后 針對各祀序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈;同時設計一對對照序列siRNAc; (2 )慢病毒表達載體的構建及鑒定:空載體pGC-LV帶有GFP標記，將PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒用BamH I:和EcoR ?限制性內切酶進行雙酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段，連接空PLVX. 1載體(來自clontech公司）與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成 的重組載體，連接產物轉化新鮮感受態細胞E. coli DH5a，37°C培養16h后挑陽性克隆進行 菌落PCR鑒定，測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒； (3)QPCR篩選shRNA:CXCR4基因的QPCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，培養293細 胞，將質粒和lip〇2000復合物加入六孔板293細胞中，提取各組細胞的RNA，將RNA反轉錄為 cDNA，利用cDNA為模板，利用所述QPCR引物檢測CXCR4基因的相對表達量，焚光定量檢測各 組引物;PCR 反應條件:95°C30s，l 循環，55°C30s40 循環，95°C5s，60°Clmin，95°C15s。
[0006] 步驟（3)中所述QPCR引物序列為：PrimeK + ) : 5 'GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3 ' ' Primer(-):5'-CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3'。
[0007] PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒是由clontech公司載體PLVX_shRNA2改造 的，具體方式是：擴增puro表達框，將puro表達框克隆至PLVX-shRNA2載體ZSgreen后面。公 認的綠色強熒光蛋白，本領域技術人員可以按此方法獲得該質粒。
[0008] 本發明的優點在于： 慢病毒載體和逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等相比，具有以下的優 點：（1)可感染分裂期細胞與非分裂期細胞，如神經系統、造血系統等非分裂期細胞，免疫反 應較小；（2)可轉移基因片段較大，可插入約10 kb的基因片段；（3)病毒突變與產生有復制 能力的病毒機率較小，大大減少了產生有復制能力的病毒（replication competent virUS，RCV); (4)目的基因和宿主基因組通過整合，可實現目的基因較長時間的表達。基因 治療中的RNA干擾技術已成為腫瘤治療的新方法，慢病毒載體能安全將腫瘤目的基因轉移 到機體。通過慢病毒載體介導的RNAi技術，發現與疾病相關的影響因素，并嘗試由此著手研 究治療的方法，達到治療疾病的效果。為此還應該保證更高的安全性、有效性和可靠性，并 逐步從體外實驗和動物實驗進入到臨床試驗階段，相信該技術將在今后的研究領域和臨床 實際應用方面有著更廣闊的前景。
【附圖說明】
[0009] 圖 I CXCR4-shRNA陽性克隆PCR鑒定圖，1:陰性對照（ddH20) ; 2 : Marker ; 3-8 : CXCR4-shRNA 克隆。
[0010] 圖2各組293細胞中CXCR4表達變化(又土 5?，n=3)，*P〈 0.01，**/5 =0.192 >0.05)。
【具體實施方式】
[0011] 1材料與方法 1.1材料 人肺腺癌PC9細胞株購自上海玉博生物科技有限公司。細胞用DMEM 90%，Fetal Bovine Serum 10%培養基，在37°C，5%C〇2的細胞培養箱中常規培養。CXCR4兔多克隆抗體、 GAPDH鼠多抗購自abeam公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自abeam公司 1.2方法 1.2.1干擾序列設計 根據GenBank CXCR4的mRNA全序列(Accession No:NM_003467)，經BLAST同源性比對證 實特異性后應用RNA structure 4.4軟件對革EmRNA序列的二級結構進行評估，得到3條19nt 靶序列。然后針對各靶序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核苷酸單鏈。同時設計一對對照 序列s iRNAc。然后根據s iRNA的序列設計合成兩條shRNA寡核苷酸單鏈。設計如下:BamH i:酶 切位點+19 nt靶核苷酸序列+莖環結構(TTCAAGAGA)+靶序列互補序列+RNA Polyiil聚合酶 轉錄中止位點(TTTTTT)+EcoR|酶切位點六個區域，分別命名為shRNAl、shRNA2、shRNA3、， 以及shRNAc，具體序列見表UshRNA寡核苷酸鏈由上海生工公司合成。
[0012] 表1. CXCR4基因的3條特異性SiRNA靶序列
1.2.2慢病毒表達載體的構建及鑒定 空載體pGC-LV帶有GFP標記。將PLVX-shRNA-PURO vector環狀空質粒用BamH f和 EcoR I限制性內切酶進行雙酶切，并回收PLVX-SHRNA-PURO vector酶切片段。連接空 PLVX. 1載體與shRNA寡核苷酸雙鏈，連接形成的重組載體分別標記為:PLVX-CXCR4shRNAl、 PLVX-CXCR4shRNA2、PLVX-CXCR4shRNA3、PLVX-CXCR4shRNAc。連接產物轉化新鮮感受態細胞 E.coli DH5cu37°C培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，送上海生工進行DNA測序鑒定。 測序結果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒。
[0013] 1.2.3 QPCR篩選最佳干擾效果的shRNA CXCR4基因的QPCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，序列為Primer( + ):5, ' GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3'，Primer(_) :5'CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3'， 培養293細胞，將質粒（pLVX-CXCR4shRNAl，pLVX-CXCR4shRNA2，pLVX-CXCR4shRNA3、 pLVX-acGFP-Cl)和lipo2000復合物加入六孔板293細胞中，提取各組細胞的RNA，將RNA反轉 錄為cDNA，利用cDNA為模板，檢測CXCR4基因的相對表達量，熒光定量檢測各組引物。PCR反 應條件：95°C 30s，1 循環，55 °C30s40循環，95°C 5s，60°C Imin，95 °C 15s。以 2-Met值表示 CXCR4基因 mRNA的相對表達水平。
[0014] 1.2.4慢病毒包裝 根據干擾篩選的結果，將最佳干擾效果的干擾載體PLVX-CXCR4-shRNAl涂板，37 °C培養 過夜，挑取單菌落，接種到200ml的LB培養基中，250rpm，37 °C搖菌培養過夜，大量提取質粒。 大量培養293T細胞，轉染前一天，用胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，用不含抗生素 的DMEM完全培養基接種293FT細胞于60 mm平皿中，每個皿接種細胞2 X 106個細胞，37 °C、5% C02培養箱內培養24 h。將shRNAc、CXCR4-shRNA分別和慢病毒包裝質粒共轉染293T細胞。 48 h收集轉染后的293T細胞上清液，濾液經超速離心后濃縮，去掉上清，保留下面沉淀，加 入適量的PBS溶解病毒沉淀，分裝后保存在病毒管中，-80°C長期保存。
[0015] 1.2.5病毒滴度測定 培養293細胞，將細胞接種到48孔板，每孔105個細胞，37 °C，5%C02繼續培養18h。取20μ1 的病毒稀釋到200μ1的DMEM培養基，依次10稀釋病毒即（10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7)，混勻稀 釋的病毒，分別加到48孔中，每孔100yl，37°C，5%C02繼續培養48h。利用熒光倒置顯微鏡檢 測統計各個孔帶熒光細胞的數量，結合稀釋倍數計算病毒滴度:滴度(TU/ml )=熒光細胞數 X有效稀釋倍數。
[0016] 1.2.6穩定干擾細胞株的建立 感染前1天取對數生長期狀態良好的PC9細胞按每孔5 XlO5個接種于6孔板。感染時， 按照MOI=IOO稀釋慢病毒，孔中分別加入含8 mg·!/1聚凝胺的2種稀釋后病毒液lmL，同時 設定空白的靶細胞作為對照。培養16h后，更換為新鮮的DMEM完全培養基2mL繼續培養，48h 后熒光顯微鏡下觀察感染效率。將感染后的細胞用胰酶消化后制成單細胞懸液，按照每皿 1000個的密度接種于IOcm的培養皿，培養至形成單克隆細胞團，選擇單克隆細胞再一次進 行克隆，然后挑取足夠數量單克隆細胞進行擴增培養，為下一步檢測作準備。得到的穩定干 擾細胞分別命名為PC9/CXCR4-shRNA，陰性對照細胞命名為PC9/shRNAc。
[0017] 1.2.7 QPCR檢測細胞PC-9mRNA干擾效率 收集PC9/CXCR4-shRNA、PC9/shRNAc細胞，按QIAGEN Rneasy Mini kit試劑盒說明書中 的實驗方法和步驟提取細胞總RNA，并按照反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit) 進行cDNA逆轉錄合成。以此cDNA為模板，應用熒光定量PCR試劑盒進行PCR擴增，CXCR4和 GAPDH基因（內參照）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。CXCR4: Pr imer (+ ) : 5' GGAGAGTTGTAGGATTCTAC3，，Primer(-): 5'CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG3'。PCR反應條 件:95°C30s，l 循環，55°C30s40 循環，951：58,60°(：111^11，95°(：158。以2~-(1(1(^值表示〇父〇?4基 因 mRNA的相對表達水平。
[0018] 1.2.8 Western blot檢測細胞PC-9蛋白干擾效率 收集PC9/CXCR4-shRNA、PC9/shRNAc細胞，加入細胞裂解液冰上裂解10 min，取蛋白上 清用BCA蛋白濃度測定濃度。取50~80g蛋白質進行10%SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白質 電轉移至PVDF膜上，用含5 %脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h;加入1:2000稀釋的兔抗人 CXCR4多克隆抗體和1:2000稀釋的小鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4°C反應過夜;TBS洗膜后， 分別加入1:3000稀釋的二抗(HRP標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠 IgG)，室溫反應2h; TBS洗 滌后，加入化學發光試劑，冷CCD成像系統曝光、顯影和定影。掃描膠片，對各蛋白條帶進行 灰度值分析，以CXCR4蛋白條帶灰度值與內參照GATOH蛋白條帶灰度值的比值表示CXCR4蛋 白的相對表達水平。
[0019] 2 結果 2.1重組慢病毒質粒的PCR和測序鑒定 PCR鑒定重組慢病毒質粒時，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為200bp。將PCR 產物進行電泳，第1、2、3對靶點序列結果均顯示陽性克隆(Figl)。從每個靶點序列的陽性克 隆中各選一個進行測序，結果測試結果顯示序列是正確的。
[0020] 2.2最佳干擾效果的ShRNA篩選 各組293細胞中的CXCR4的mRNA表達水平如圖2所示，結果顯示:通過單因素方差分析， 與空白對照組相比，實驗組中的293細胞的CXCR4的表達水平均顯著下降(P=0.00 01〈0.01)， 陰性對照載體組的293細胞的CXCR4表達水平變化無統計學意義（P=0.192>0.05)，說明 CXCR4-shRNA載體能顯著下調293細胞中CXCR4mRNA的表達，且CXCR4-shRNAl載體下調最明 顯。
[0021] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，其特征在于:所述構建方法包括如下： (1) 干擾序列設計:根據GenBank CXCR4的mRNA全序列，經BLAST同源性比對證實特異性 后應用RNA struc化re 4.4軟件對祀1111?^4序列的二級結構進行評估，得到1911*祀序列;然后 針對各祀序列設計合成其相應的兩條shRNA寡核巧酸單鏈； (2) 慢病毒表達載體的構建及鑒定：空載體pGC-LV帶有GFP標記，將化VX-shRNA-PURO vector環狀空質粒，用BamHf和EcoR i:限制性內切酶進行雙酶切，并回收化VX-S皿NA-PUR0 vector酶切片段，連接空化VX. 1載體與shRNA寡核巧酸雙鏈，連接形成的重組載體，連接產 物轉化新鮮感受態細胞E.coli DH5a，37°C培養16h后挑陽性克隆進行菌落PCR鑒定，測序結 果驗證重組質粒構建成功后，提取重組質粒pLVX-CXCR4shRNA; (3) QPCR篩選shRNA: CXCR4基因的QPCR引物為載體多克隆位點兩端的引物，培養293細 胞，將獲得的質粒pLVX-CXCR4shRNA和lipo2000復合物加入六孔板293細胞中，提取各組細 胞的RNA，將RNA反轉錄為cDNA，利用cDNA為模板，利用所述QPCR引物檢測CXCR4基因的相對 表達量，巧光定量檢測各組引物;PCR反應條件:95 °C 30s，1循環，55 °C 30s40循環，95 °C 5s，60 °Clmin，95°C15s。2. 根據權利要求1所述的CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，其特征在于:步驟(3)中所 述QPCR引物序列為：Prime^ + ) :5'GGAGAGTTGTAGGATTCTAC-3' 'Primer(-) :5'- CCTCGGTGTAGTTATCTGAAG-3'。3. 根據權利要求1所述的CXCR4RNAi慢病毒載體的構建方法，其特征在于:所述的化VX- shRNA-PURO vector環狀空質粒是載體PLVX-shRNA2改造獲得。4. 如權利要求1所述的構建方法構建獲得的載體。
【文檔編號】C12N15/867GK106086075SQ201610462279
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發明人】胡志堅, 陳愉生, 李鴻茹, 鐘雪晶
【申請人】福建醫科大學