一種重組大腸桿菌及其生產l-甲硫氨酸的應用
【專利摘要】本發明公開了一種重組大腸桿菌及其生產L?甲硫氨酸的應用，所述重組大腸桿菌構建方法為：將大腸桿菌的metJ基因敲除后，轉入metA*基因和yjeH基因，再敲除metI基因，然后敲除lysA基因和/或thrB基因構建而成；所相比較于出發菌株E.coli W3110幾乎不能在胞外積累L?甲硫氨酸(<50mg/l)，本發明重組大腸桿菌在含有20ml培養基的搖瓶發酵時最高產量這里可達4.083g/l，在3L工作體積的5L發酵罐中最高效價可達9.752g/l。
【專利說明】
一種重組大腸桿菌及其生產L-甲硫氨酸的應用 (一)
技術領域
[0001] 本發明涉及一種L-甲硫氨酸的制備，特別涉及利用重組大腸桿菌制備L-甲硫氨酸 的應用。 (二)
【背景技術】
[0002] 甲硫氨酸(methionine，以下簡稱Met)，又名蛋氨酸，是脊椎動物必需的唯--種 含硫氨基酸，Met參與多種生理代謝過程，Met缺乏會導致多種疾病。在動物飼料制造行業， 為了保證動物營養的均衡性，提高動物對飼料的營養利用率，加快生長速度，縮短飼養周 期，一般會添加5%的Met。目前，每年的Met需求量高達數十萬噸，因此Met具有十分廣闊的 市場前景。
[0003] 現有的Met生產方法是化學合成法，以丙烯醛、甲硫醇、氰化物等為原料，首先甲硫 醇和丙烯醛反應生成3-甲硫基丙醛，3-甲硫基丙醛再與HCN、NH4HC0 3合成海因，海因在KHC03 存在的條件下堿水解為甲硫氨酸鉀鹽，最后酸化得到(D，L)-Met，飼料中的D-Met進入動物 體內必須經過代謝脫氨作用以及氨基轉移作用首先轉化成L-Met才能被正常利用。
[0004] 隨著對微生物代謝細節信息的不斷深入理解，以葡萄糖以及礦物質鹽等廉價反應 物為原料，以更低的成本利用微生物內合適的生物合成途徑的可用性發酵制備具有生物活 性的L-氨基酸表現出良好的前景。但是，由于野生型菌株因為自身的細胞經濟性，胞內的氨 基酸生物合成途徑受到非常嚴格的反饋調控。所以有效制造方法的重要條件是在制造預期 氨基酸方面產量大幅增加(與親本微生物相比較)的適當微生物。高產微生物的獲得可以通 過傳統的突變/篩選及/或用新的代謝工程技術。在代謝工程技術中，由于不同的代謝途徑 之間存在非線性的關聯，不同的代謝節點具有不同的性質，首先需要識別可以引起氨基酸 高產的基因或等位基因。然后將該基因/等位基因引入微生物菌株內或利用分子生物學技 術將其加以失活，以實現相應的氨基酸高產。但是往往要結合多種不同的方法才能真正地 實現高產。
[0005] 微生物體內的L-Met生物合成非常復雜，L-Met和L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸 同屬于天冬氨酸家族，L-天冬氨酸經過天冬氨酸半醛/天冬氨酸酰磷酸轉化為L-高絲氨酸。 然后在三個酶的催化下經過三步反應，包括(經由0-琥珀酰高絲氨酸及胱硫醚)用一個巰基 (該巰基來自半胱氨酸）替代該分子上的羥基，而形成一個高半胱氨酸，再將該巰基加以甲 基化后制得L-Met。該甲基是衍生自絲氨酸代謝作用。可見，L-Met的生物合成與天冬氨酸、 絲氨酸及半管氨酸的生物合成關系緊密，所以其生物合成調控遠較其他氨基酸復雜。除了 主要合成途徑(天冬氨酸-高絲氨酸-高半胱氨酸)之外，半胱氨酸的生物合成以及無機硫的 固定，C1單位的代謝作用必須要加以最佳協調。基于以上理由，過去對L-Met的發酵生產尚 未有深入細致的研究。但是隨著技術理念的發展，以及近年來在絲氨酸及半胱氨酸代謝作 用的最適化作用方面已經取得決定性進步，所以L-Met的發酵法生產也越來越具有可行性。
[0006] 有關L-Met的發酵法生產，利用下列基因/等位基因可以實現L-Met高產：日本專利 JP 2000139471A中曾述及的metA等位基因。metA等位基因編碼0-高絲氨酸轉琥珀酰酶，催 化高絲氨酸和琥珀酰輔酶A合成0-琥珀酰高絲氨酸，該0-高絲氨酸轉琥珀酰酶受到L-Met和 SAM(S-腺苷甲硫氨酸）的反饋抑制。通過上調metA的表達量，以及通過定點突變削弱其對L-Met以及SAM( S-腺苷甲硫氨酸）的敏感性，能夠較大程度地提高L-Met的效價。日本專利JP 2000139471A中述及的metj敲除，metj基因編碼L-Met代謝作用的核心調控因子，參與了 L-Met合成代謝支路中幾乎所有酶的轉錄負調控，因此敲除metj基因有利于代謝支路中關鍵 酶的表達量上調，最終提高發酵液中L-Met的效價。美國專利US 20090298135A1中述及的 y j eH等位基因 。y j eH等位基因編碼的蛋白可能與L_Me t分泌有關，該基因的表達上調可以有 效提高發酵液中L-Met的效價。除此之外，還有很多關于C1單位生成(如metF(編碼亞甲基四 氫葉酸還原酶），gcvTHP(編碼甘氨酸裂解酶系），lpd(編碼硫辛酰胺脫氫酶），glyA(絲氨酸 羥甲基轉移酶）等），半胱氨酸生成（如cysE(編碼絲氨酸乙酰轉移酶）），NADPH可用性（如 PntAB(編碼NAD(P)轉氫酶），UdhA(編碼NAD(P)轉氫酶)等)等相關的有利于提高L-Met發酵 效價的專利報道。 (三)
【發明內容】

[0007] 本發明目的是提供一種重組大腸桿菌及其在制備L-甲硫氨酸中的應用，本發明通 過1)解除關鍵酶的轉錄負調控，2)增強目標產物的分泌和/或削弱目標產物的重吸收，3)提 高胞內目標代謝產物代謝途徑的代謝通量，構建一種L-Met高產的大腸桿菌菌株，并利用本 發明的代謝工程菌株發酵生產L-Met。
[0008] 本發明采用的技術方案是：
[0009] 本發明提供一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌構建方法為：將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除lysA基因和/或 thrB基因構建而成;所述metA*基因是將SEQ ID如.2所示氨基酸序列第881為丙氨酸以)突 變為甘氨酸(G)，獲得突變0-高絲氨酸琥珀酰轉移酶基因 metA*，核苷酸序列為SEQ ID No.3 所示，所述yjeH基因核苷酸序列為SEQ ID No. 5所示，lysA基因核苷酸序列為SEQ ID No. 7 所示，thrB基因核苷酸序列為SEQ ID No.8所示。
[0010] 進一步，所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的metj基因敲除后，轉入metA*基因和 yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除lysA基因構建而成。
[0011] 進一步，所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的metj基因敲除后，轉入metA*基因和 yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除thrB基因構建而成。
[0012] 進一步，所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的metj基因敲除后，轉入metA*基因和 yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除lysA基因和thrB基因構建而成。
[0013] 進一步，所述重組大腸桿菌以大腸桿菌為E.coli W3110為出發菌株。
[0014]本發明還提供一種所述重組大腸桿菌在生成L-甲硫氨酸中的應用，具體所述的應 用為:將重組大腸桿菌接種到含50mg/L的Amp的LB培養基中，37°C、200rpm培養8-12h，將培 養液以體積濃度5%的接種量接種到含50mg/L的Amp的MS培養基中，添加終濃度為100μ mol/ L IPTG，在30 ± 2°C、100~500rpm(優選30°C、150rpm)培養發酵48h，發酵結束后，獲得含L-甲硫氨酸的發酵液，將發酵液分離純化，獲得L-甲硫氨酸;所述MS培養基終濃度組成為:葡 萄糖20g/L、（NH4) 2S〇4 16g/L、KH2P〇4 lg/L、酵母提取物2g/L、CaC03 10g/L、lml/L微量元素 溶液，溶劑為水，pH值自然；其中微量元素溶液組成為：0.15g/L Na2Mo〇4 · 2H20、2.5g/L Na3B03、0.7g/L CoCl2.6H20、0.25g/L CuS〇4.5H20、1.6g/L MnCl2.4H20、0.3g/L ZnS〇4· 7H20,溶劑為水；當重組大腸桿菌敲除lysA時，向MS培養基中添加終濃度0.02g//L的L-賴氨 酸；當重組大腸桿菌敲除thrB基因時，向MS培養基中添加終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸；當重 組大腸桿菌同時敲除lysA基因和thrB基因時，向培養基中添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸 和終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸。
[0015] 本發明以E.coli W3110為出發菌株，首先使用基因敲除技術構建了E.coli W3110 AmetJ。然后定點突變技術和DNA重組技術從E.COliW3110的基因組中克隆并突變獲得抗 反饋抑制的〇-高絲氨酸琥珀酰轉移酶基因 metA*，同時也克隆了L-Met輸出蛋白基因 y jeH， 構建了重組表達質粒pTrc99A/metA*/yjeH，并將其轉化到宿主菌E. coli W3110 Δ metj中獲 得菌株E.coli W3110 ΔmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH。在此基礎上，本發明敲除了與E·coli W3110攝入L-Met相關的基因 metl (編碼甲硫氨酸透酶，與甲硫氨酸結合酶，ATP合酶共同組 成甲硫氨酸攝入系統），破壞攝入與分泌的平衡，構建E .coli W311〇AmetJAmetI/ pTrC99A/metA*/y jeH。在此基礎上，本發明敲除了參與賴氨酸生物合成的關鍵基因 lysA(編 碼二氨基庚二酸脫羧酶)或參與蘇氨酸生物合成的關鍵基因 thrB(編碼高絲氨酸激酶），切 斷了賴氨酸生物合成支路或蘇氨酸生物合成支路，構建E.coli W311〇AmetJAmetI Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH和E.coli W3110 Δ metj Δ metlΔ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH。在 此基礎上，本發明同時敲除了參與賴氨酸生物合成的關鍵基因 lysA(編碼二氨基庚二酸脫 羧酶)和參與蘇氨酸生物合成的關鍵基因 thrB(編碼高絲氨酸激酶），切斷了賴氨酸生物合 成支路和蘇氨酸生物合成支路，構建E · coli W3110 Δ met J Δ metl Δ lysA Δ thrB/pTrc99A/ metA*/yjeH〇
[0016] 構建獲得的菌株接入MS培養基中，對于賴氨酸缺陷菌添加0.02g/l的L-賴氨酸，對 于蘇氨酸缺陷菌添加〇.8g/l的L-蘇氨酸，Amp的工作濃度為50mg/L，IPTG的工作濃度為100μ 111〇1/1^，30°(：發酵4811生產1^-1以，在含有2〇1111培養基的搖瓶發酵時最高產量這里可達 4.083g/l，在3L工作體積的5L發酵罐中最高效價可達9.752g/l。
[0017] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在:與以往的發明不同，本發明除了考 慮解除L-甲硫氨酸生物生成途徑中關鍵酶的轉錄負調控，上調部分關鍵酶及分泌因子外， 還考慮了削弱L-甲硫氨酸攝入系統，切斷競爭代謝支路，進一步實現胞內代謝物流向L-甲 硫氨酸代謝支路調動的最大化，以及減少L-甲硫氨酸在胞內的積累，盡可能削弱反饋調控， 最終提高L-甲硫氨酸的發酵效價;相比較于出發菌株E.coli W3110幾乎不能在胞外積累L-甲硫氨酸（<50mg/l)，本發明重組大腸桿菌在含有20ml培養基的搖瓶發酵時最高產量這里 可達4.083g/l，在3L工作體積的5L發酵罐中最高效價可達9.752g/l。 (四）
【附圖說明】
[0018] 圖1為重組表達質粒的構建流程；
[0019]圖2為重組表達質粒的表達驗證；
[0020]圖3為最優高產菌株的發酵進程。 (五)
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0022] 本發明所述親本菌株E.coli W3110保藏于耶魯大學CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏編號CGSC#4474,已在專利US 2009/0298135 Al,US 2010/0248311 A1 中公開。
[0023] 實施例1:構建表達重組質粒pTrc99A/metA*
[0024] 將E.coli W3110在LB平板(2%瓊脂，下同）上劃線分離單菌落，挑取單克隆接種到 LB試管中，200rpm，37°C培養過夜。取1.5ml過夜培養的菌液，12000rpm，室溫離心lmin，棄上 清，重復操作一次。獲得菌體后，用FastDNA" SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)提取 E. co 1 i W3110基因組DNA，0.9 %瓊脂糖凝膠電泳驗證。
[0025] E.coli W3110來源的0-高絲氨酸琥珀酰轉移酶基因 metA是L-甲硫氨酸合成支路 的第一個關鍵酶，其核苷酸序列見SEQ ID No. 1，氨基酸序列見SEQ ID No.2,設計兩條特異 性引物P1和P2(見表1)，以E.coli W3110基因組為模板擴增獲得metA基因，上下游分別帶有 Nco I和Sac I兩個酶切位點，膠回收純化后將metA基因克隆到pGEM-T easy上，獲得pGEM-T easy/metA〇
[0026] 根據報道，111的#8%^>(；有利于降低其對L-Met的敏感性，從而抵抗反饋抑制，核苷 酸序列見SEQ ID No. 3,氨基酸序列見SEQ ID No. 4 (SEQ ID No. 2氨基酸第881位A突變為 G)。因此設計引物P3和P4(見表1)對pGEM-T easy/metA進行定點突變，具體流程參考 (Current Protocols in Protein Science.2011,26.6.1-26.6.10；Analytical Biochemistry.2008,375:376-378)的描述，獲得pGEM-T easy/metA*。用Nco I和Sac I處理 pTrc99A和pGEM-T easy/metA*，膠回收純化后用T4DNA 1 igase連接，獲得重組表達質粒 pTrc99A/metA*。
[0027] 實施例2:構建表達重組質粒pTrc99A/metA*/y jeH
[0028] E.coli W3110yjeH基因是L-甲硫氨酸的重要分泌因子，其核苷酸序列見SEQ ID No.5,氨基酸序列見SEQ ID No.6,設計特異性引物P5，P6(見表1)，以E.coli W3110基因組 為模板(見實施例1)擴增獲得yjeH基因，上下游分別帶有BamH I和Hind III兩個酶切位點， P5的BamH I位點和yjeH的起始密碼子ATG之間加一段RBS序列:AAGGAGATATAC。膠回收純化 后，連接pGEM-T easy(同實施例1)后測序，結果表明克隆到的yjeH序列和GenBank公布的序 列一致。用Sac I和Hind III處理pGEM-T easy/yjeH和pTrc99A/metA*后T4DNA ligase連 接，構建獲得pTrc99A/metA*/yjeH重組表達質粒。
[0029] 實施例3:構建E.coli W3110 AmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH
[0030] 在E.coli中metj基因與L-Met生物合成有十分重要的作用，所以本發明首先要構 建一個metj基因敲除菌，解除其對L-Met生物合成途徑中眾多關鍵酶的轉錄抑制。基因敲除 技術參考（Construction of Escherichia coli K-12in-frame , single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology.2006)的描述，具體過程如 下：
[0031] 為了敲除E.coli W3110中的metj基因，設計引物P7，P8(見表1)擴增獲取線性打靶 片段，膠回收純化后，再經過一步醇沉濃縮，使DNA濃度> lyg/μL。
[0032] 將pKD46轉化到E.coli W3110中，單克隆接種到LB試管中，30°C過夜培養，再以體 積濃度1%的接種量接種到含50ml LB培養基的250ml搖瓶中，并加入500μ1 lmol/1的L-阿 拉伯糖，150rpm，30°C培養至0D6qq Ο · 4~Ο · 6，4000rpm，4°C離心1 Omin收集細胞，制備電轉化 感受態，詳細過程見（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition,99-102)的 描述。
[0033] 取5μ1線性打靶片段與40μ1電擊感受態細胞混合，轉入預冷的2mm電擊杯中，冰浴 lmin左右，用電穿孔儀(MicroPluser?，BI〇-RAD)進行電擊轉化，電擊完成后立即加入lml LB培養基并立即輕柔吸出，轉移到1.5ml離心管中，37 °C復蘇2-3h后涂布含0.05mg/l Kan (卡那霉素）的LB平板，37°C倒置培養12-16h。
[0034] 根據GenBank公布的序列，設計兩條位于metj基因外側的引物P9，P10(見表1)，以 及位于kan抗性基因內部的引物kl和k2(見表1)，以P9和k2為一對引物，kl和P10為一對引 物，P9和P10為一對引物，E. co 1 i W3110的基因組(見實例1)為陰性對照，對篩選平板上長出 的菌落進行菌落PCR檢驗，其中陰性對照不能用P9和k2以及P10和kl擴增出條帶，而能用P9 和P10擴增與GenBank公布的序列大小一致的條帶。而陽性對照則可以用三對引物同時擴增 能出條帶，而且前兩對引物擴增出的條帶長度之和等于第三對引物擴增所得的條帶長度。 [0035]回收以陽性菌落為模板，P9和P10為引物擴增得到的PCR產物，測序驗證，結果表明 E.coli W3110中的metj基因被兩端帶有FRT位點的kan片段成功替換。
[0036] 制備E.coli W3110metJ: :kan化轉感受態，轉化輔助質粒pCP20,涂布含Amp的抗性 平板，30°C培養過夜。用P9和P10對單克隆進行菌落PCR檢驗，以E.coli W3110的基因組為陰 性對照，理論上陽性克隆可以擴增出比對照小的片段。得到的陽性克隆接種LB試管，37°C培 養8-10h，然后42°C培養10_12h，然后再無抗LB平板上劃線分離單菌落，37°C倒置培養，得到 的單菌落分別在含Amp和含Kan的LB平板上檢驗抗性，同時喪失Amp(氨芐青霉素)和Kan(卡 那霉素)抗性的單菌落為陽性菌落，即E. co 1 i W3110 Δ metJ，將以陽性克隆為模板，P9和P10 為引物的擴增產物膠回收純化后，送樣測序，結果表明metj已經成功敲除。
[0037] 將重組表達質粒pTrc99A/metA*/yjeH(見實施例2)轉化到E. coli W3110 Δ metj中 構建獲得E.coli W3110 AmetJ/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0038] 實施例4:構建E.coli W3110 AmetJAmetI/pTrc99A/metA*/yjeH
[0039] 在E·coli中存在兩套L_Met攝入系統（transport system) :MetD和MetP，其中MetD 為主要的攝入系統，由metD基因座編碼，其中包含metl(編碼甲硫氨酸透酶），metN(編碼ATP 合酶)和metQ(編碼甲硫氨酸結合酶)三個基因。本發明旨在E.coli W3110 ΔmetJ的基礎上 通過基因敲除破壞L-Met攝入系統，破壞攝入與分泌的平衡，提高L-Met的發酵效價。用與實 施例3相同的方法，設計線性打靶片段擴增引物P11和P12(見表1)，檢驗引物P13和P14(見表 1)。測序表明成功構建了E. coli W3110 Δ metj Δ metI/pTrc99A/metA*/y jeH〇
[0040] 實施例5:構建E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/metA*
[0041] /yjeH
[0042] L-Met和L-賴氨酸都以L-天冬氨酸為前體，在代謝通量上存在相互競爭的關系。本 發明在E. coli W3110 Δ metJ Δ metl的基礎上，用實施例3相同的方法，設計線性片段擴增引 物P15和P16,檢驗引物P19和P20,敲除了lysA基因，核苷酸序列見SEQ ID如.7，切斷了1^-賴 氨酸生物合成途徑，成功構建了E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0043] 實施例6:構建E.coli W3110 AmetJAmetl Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH
[0044] L-Met和L-蘇氨酸都以L-天冬氨酸為前體，在代謝通量上存在相互競爭的關系。本 發明在E. coli W3110 Δ metJ Δ metl的基礎上，用實施例3相同的方法，設計線性片段擴增引 物P17和P18,檢驗引物P21和P22,敲除了thrB基因，核苷酸序列見SEQ ID如.8，切斷了1^-蘇 氨酸生物合成途徑，成功構建了E.coli W3110 AmetJAmetl Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0045] 表1引物
[0047] 實施例7:構建E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysAA thrB/pTrc99A/metA*/yjeH
[0048] 在E. col i W3110 Δ met J Δ metl Δ lySA的基礎上，繼續實施例5相同的方法敲除 thrB基因，同時切斷L-賴氨酸和L-蘇氨酸生物合成途徑，成功構建E. coli W3110 Δ met J Δ metlΔlysA Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH〇
[0049] 實施例8:搖瓶發酵及效價比較
[0050] 將生產菌株(包括E.coli W3110、E.coli W311〇AmetJ/pTrc99A、E.coli W3110A metJ/pTrc99A/metA*/yjeH、E·coli W3110 Δ metj Δ metI/pTrc99A/metA*/yjeH、E·coli W3110 Δ metJ Δ metlΔlysA/pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W311〇AmetJΔmetlΔ thrB/ pTrc99A/metA*/yjeH、E.coli W3110 Δ metj Δ metlΔlysA Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH)接 種到10ml含50mg/L Amp的LB培養基（lOg/L蛋白胨，5g//L酵母提取物，lOg/L NaCl，溶劑為 水，pH值自然）中，37 °C、200rpm培養用作預培養物，其中E · co 1 i W3110 Δ met J/pTrc99A為陰 性對照。8-12h后，接種lml預培養物到裝20ml含50mg/L的MS培養基(葡萄糖20g/L、（NH4)2S〇4 16g/L、KH2P〇4 lg/L、酵母提取物2g/L、CaC03 10g/L(單獨滅菌）、lml/L微量元素溶液，溶劑 為水，pH值自然;其中微量元素溶液組成為:0.15g/L Na2Mo〇4· 2H20、2.5g/L Na3B03、0.7g/L C0CI2 · 6H20、0.25g/L CuS〇4 · 5H20、1.6g/L MnCh · 4H20、0.3g/L ZnS〇4 · 7H20,溶劑為水） 的500ml搖瓶中，添加終濃度為100μ mol/L IPTG，然后在30°C、150rpm培養發酵48h，發酵結 束后，取lml發酵液，12000rpm，室溫離心3min，將發酵上清稀釋100倍，用全自動氨基酸分析 儀（SYKAM S-433D，德國）分析氨基酸效價。發酵液上清中的L-Met含量如表2所示。E. co 1 i W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH向MS培養基中添加終濃度0.02g/L的L-賴 氨酸；E.coli W3110 AmetJAmetl Δ thrB/pTrc99A/metA*/yjeH向MS培養基中添加終濃度 為0 · 8g/L 的 L-蘇氨酸；E · coli W3110 Δ metj AmetlAlysAA thrB/pTrc99A/metA*/y jeH 向 培養基中添加終濃度〇. 〇2g/L的L-賴氨酸和終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸。
[0051 ]表2不同高產菌株的效價
[0053] 實施例9:最優菌株E · coli W3110 Δ metj Δ metl Δ lysA/pTrc99A/metA*/y jeH 5L 罐分批補料發酵
[0054] 在實施例 8 基礎上，對最優高產菌株 E.coli W3110 AmetJAmetl Δ lysA/pTrc99A/ metA*/yjeH進行了 5L發酵罐放大。具體過程如下：
[0055] 將生產菌株(E.coli W3110、E.coli W311〇AmetJ/pTrc99A、E.coli W311〇AmetJ Ametl Δ lysA/pTrc99A/metA*/yjeH)接種到 10ml含有50mg/l的Amp的LB培養基中，37°C、 200rpm培養用作一級種子。8-12h后，接種0.5ml到含有50ml LB培養基的250ml搖瓶中，共接 3瓶，37°C、200rpm培養作為二級種子。6-8h后，將3瓶種子液混合后接種到含有3L MS培養基 (其中的葡萄糖為30g/l，添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸）的5L發酵罐中，添加終濃度為100 ymol/L IPTG，31°C，攪拌轉速500rpm，通氣量為21/min，pH 7.0,用氨水或磷酸調節pH，發酵 48h，每6h取一次樣，當發酵液中的葡萄糖濃度降低到5g/l以下，加入100ml補料培養基（葡 萄糖500g/L、（NH4)2S〇4 16g/L、KH2P〇4 12.5g/L、L-lysine 4.357g/L、Na2S2〇3 23.83g/L、酵 母提取物lg/L、Vb12 0.02g/L、溶劑為水，pH值自然），使葡萄糖達到20g/L。樣品處理方式如 實施例8所述，結果表明陰性對照在整個發酵過程中發酵液中的甲硫氨酸效價都小于50mg/ 1，而E · coli W3110 Δ metj Δ metl Δ lysA/pTrc99A/metA*/y jeH的發酵進程見圖3，發酵效價 隨著菌體干重的增加而增加，發酵42h，發酵效價即可達到9.417g/l，最高發酵效價可達 9.752g/l。
[0056] 本發明不受上述具體文字描述的限制，本發明可在權利要求書所概括的范圍內做 各種改變，如以其他屬于大腸桿菌屬的微生物作為出發菌株，對另一套攝入系統MetP的破 壞，其他分泌因子(如ygaZH)的表達上調，以及實施例中提到的最優菌的發酵過程優化、補 料工藝開發均在本發明的范圍之內。
【主權項】
1. 一種重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌構建方法為:將大腸桿菌的metJ 基因敲除后，轉入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除IysA基因和/或thrB基 因構建而成;所述metA*基因是將SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第881位丙氨酸突變為甘氨 酸，獲得突變O-高絲氨酸琥珀酰轉移酶基因 metA*，所述yjeH基因核苷酸序列為SEQ ID No · 5所示。2. 如權利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除IysA基因構建而 成。3. 如權利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除thrB基因構建而 成。4. 如權利要求1所述重組大腸桿菌，其特征在于所述重組大腸桿菌是將大腸桿菌的 metj基因敲除后，轉入metA*基因和yjeH基因，再敲除metl基因，然后敲除IysA基因和thrB 基因構建而成。5. 如權利要求1-4之一所述重組大腸桿菌，其特征在于所述大腸桿菌為E. coli W3110。6. -種權利要求1所述重組大腸桿菌在生成L-甲硫氨酸中的應用。7. 如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的應用為：將重組大腸桿菌接種到含 50mg/L的Amp的LB培養基中，37 °C、200rpm培養8-12h，將培養液以體積濃度5 %的接種量接 種到含50mg/L的Amp的MS培養基中，添加終濃度為lOOymol/L IPTG，在30±2°C、100~ 500rpm培養發酵48h，發酵結束后，獲得含L-甲硫氨酸的發酵液，將發酵液分離純化，獲得L-甲硫氨酸;所述MS培養基終濃度組成為：葡萄糖20g/L、（NH4) 2S〇4 16g/L、KH2P〇4 lg/L、酵母 提取物2g/L、CaC03 10g/L、lml/L微量元素溶液，溶劑為水，pH值自然;其中微量元素溶液組 成為：0.15g/L Na2MoO4 · 2H20、2.5g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2 · 6H20、0.25g/L CuS〇4 · 5H20、 1.6g/L MnCl2 · 4H20、0.3g/L ZnS〇4 · 7H20,溶劑為水；當重組大腸桿菌敲除IysA時，向MS培 養基中添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸；當重組大腸桿菌敲除thrB基因時，向MS培養基中添 加終濃度為〇. 8g/L的L-蘇氨酸；當重組大腸桿菌同時敲除IysA基因和thrB基因時，向培養 基中添加終濃度0.02g/L的L-賴氨酸和終濃度為0.8g/L的L-蘇氨酸。
【文檔編號】C12R1/19GK105886449SQ201610232254
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月14日
【發明人】鄭裕國, 柳志強, 黃建峰, 沈寅初
【申請人】浙江工業大學