重組細胞以及β-水芹烯的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種具有0 -水芹烯生產能力的重組細胞及使用該重組細胞的0 -水 芹烯的生產方法。
【背景技術】
[0002] 單萜為以櫳牛兒基二磷酸（GPP)為生物合成前體的符合具有10個碳的異戊二烯 規則的化合物的總稱，所述櫳牛兒基二磷酸為二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)和異戊烯基二 磷酸（IPP)縮合而成。單萜目前已知有900種以上。
[0003] 單萜具有如玫瑰及柑橘類之類的芳香，也多用于香水等。例如檸檬烯為檸檬等柑 橘類中所含的香氣成分，也用作溶劑及粘接劑原料等。另外，薄荷醇具有清爽的芳香，可 在點心及醫藥品中用作清涼劑。另一方面，在樹脂產業中，將蒎烯、a-蒎烯、檸檬烯、 a_水芹烯等作為粘接劑及透明樹脂等單體原料進行研宄（非專利文獻1)
[0004] 單貓之一的0 _水序稀（0-phellandrene)可期待作為新的聚合物材料的用途。 0 _水芹烯與a_水芹烯相比能夠得到分子量更高的聚合物。但是，在通過合成化學的方法 得到水芹烯的情況下，無法避免其異構體即水芹烯的生成，另外，這些異構體的分 離非常困難（非專利文獻2)。因此，難以得到高純度的水芹烯，這就難以調查水芹 烯的聚合物物性等。
[0005] 另一方面，作為0_水芹烯的生物合成路徑，可通過櫳牛兒基二磷酸（GPP)合成酶 或橙花基二磷酸（NPP)合成酶的作用，由異戊烯基二磷酸（IPP)對櫳牛兒基二磷酸（GPP) 或橙花基二磷酸（NPP)進行生物合成。接著，可通過水芹烯合成酶的作用由GPP或NPP 對水芹烯進行生物合成。而且，在西紅柿和薰衣草中，發現了 水芹烯合成酶（非專 利文獻3、4)。
[0006] 在專利文獻1中記載有一種使用導入了對環狀貓合成酶（Cyclicterpene synthase)進行編碼的核酸的Cl代謝宿主細胞的轉化體制造單貓的方法。作為其實施例， 記載有一種使用甲基單胞菌屬細菌的轉化體制造檸檬烯的實驗例。但是，關于水芹烯 雖然有提到，但未示出實施例。有提到水芹烯合成酶，但未示出水芹烯合成酶和其 基因的具體例及獲得方法以及可生產0 _水芹烯的轉化體的具體構成及構建方法。
[0007] 現有技術文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1 :日本特表號公報
[0010] 非專利文獻
[0011] 非專利文獻 1:SatouK.，etal.，GreenChemistry2006, 8, 878-882
[0012] 非專利文獻 2:MoriK.，Tetrahedron:Asymmetry2006, 17, 2133-2142
[0013] 非專利文獻 3:Demissie,Z.A.，etal.，，Planta.2011，233, 685-96.
[0014]非專利文獻4 :Schilmiller，A.L.，etal.，ProcNatlAcadSciUS A.,2009,106,10865-70.

【發明內容】

[0015] 發明所要解決的問題
[0016] 鑒于上述現狀，本發明的目的在于，提供一種用于高純度且大量地獲得水芹 烯的一系列的技術。
[0017] 用于解決問題的技術方案
[0018] 用于解決上述的問題的本發明的一個方面為一種具有水芹烯生產能力的重 組細胞，其將選自編碼櫳牛兒基二磷酸合成酶的核酸及編碼橙花基二磷酸合成酶的核酸中 的至少1種核酸和編碼水芹烯合成酶的核酸導入宿主細胞而成，且這些核酸在宿主細 胞內表達。。
[0019] 本發明涉及一種具有水芹烯生產能力的重組細胞。本發明的重組細胞是將 "選自編碼櫳牛兒基二磷酸（GPP)合成酶的核酸及編碼橙花基二磷酸（NPP)合成酶的核酸 中的至少1種核酸"和"編碼0 _水芹烯合成酶的核酸"導入宿主細胞而成的，且這些核酸 在宿主細胞內表達。即，在本發明的重組細胞中，相對于宿主細胞新添加或增強了GPP合成 酶和/或NPP合成酶的表達能力和0-水芹烯合成酶的表達能力。
[0020] 在本發明的重組細胞中，可基于細胞內所表達的GPP合成酶的作用由異戊烯基二 磷酸（IPP)合成GPP，和/或可基于細胞內所表達的NPP合成酶的作用由IPP合成NPP。并 且，可基于細胞內所表達的水芹烯合成酶的作用由GPP和/或NPP合成水芹烯。其 結果，可以通過培養本發明的重組細胞來高純度且大量地生產水芹烯。
[0021] 優選宿主細胞不具有甲烷單加氧酶。
[0022] 優選宿主細胞為大腸桿菌或酵母。
[0023] 可以通過這種構成容易地大量培養重組細胞。
[0024] 優選重組細胞的濕潤菌體lg可生產10mg以上的0 -水芹烯。
[0025]優選編碼櫳牛兒基二磷酸合成酶的核酸對下述（a)、（b)或（c)的蛋白質進行編 碼。
[0026] (a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質、
[0027] (b)由在序列號2所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1~20個氨基酸而成 的氨基酸序列構成，且具有櫳牛兒基二磷酸合成酶活性的蛋白質、
[0028] (c)具有與序列號2所示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且 具有櫳牛兒基二磷酸合成酶活性的蛋白質。
[0029] 優選編碼橙花基二磷酸合成酶的核酸對下述（d)、（e)或（f)的蛋白質進行編碼。
[0030] (d)由序列號4所示的氨基酸序列構成的蛋白質、
[0031] (e)由在序列號4所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1~20個氨基酸而成 的氨基酸序列構成，且具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白質、
[0032] (f)具有與序列號4所示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序列，且 具有橙花基二磷酸合成酶活性的蛋白質。
[0033] 優選編碼0 _水芹烯合成酶的核酸對下述（g)、（h)或（i)的蛋白質進行編碼。
[0034] (g)由序列號6或8所示的氨基酸序列構成的蛋白質、
[0035] (h)由在序列號6或8所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 1~20個氨基酸 而成的氨基酸序列構成，且具有0 -水芹烯合成酶活性的蛋白質、
[0036] (i)具有與序列號6或8所示的氨基酸序列顯示60%以上的同源性的氨基酸序 列，且具有水芹烯合成酶的活性的蛋白質。
[0037] 優選還導入對在異戊烯基二磷酸的合成路徑中發揮作用的至少1個酶進行編碼 的核酸，該核酸在宿主細胞內表達。
[0038] 可通過這種構成有效地供給GPP合成酶及NPP合成酶的基質即IPP。
[0039] 優選異戊烯基二磷酸的合成路徑為甲羥戊酸路徑。
[0040] 優選所述甲羥戊酸路徑為酵母或放線菌的甲羥戊酸路徑。
[0041] 本發明的其它方面為一種水芹烯的生產方法，其包括：通過培養上述的重組 細胞使該重組細胞生產水芹稀。
[0042] 本發明涉及一種0-水芹烯的生產方法。在本發明中，通過培養上述的重組細胞 使該重組細胞生產水芹烯。根據本發明，可以高純度且大量地生產水芹烯。
[0043] 優選使重組細胞的濕潤菌體lg生產10mg以上的0 -水芹烯。
[0044] 優選對釋放到重組細胞的細胞外的0 -水芹烯進行回收。
[0045] 優選從重組細胞的培養體系的氣相中回收0-水芹烯。
[0046] 發明的效果
[0047] 根據本發明，可以高純度且大量地生產水芹烯。
【附圖說明】
[0048] 圖1是表示用GC-MS對實施例5中進行的培養的氣相分率進行分析的結果的總離 子色譜圖，（a)為對照的重組體的情況，（b)為具有水芹烯生產能力的重組體的情況；
[0049] 圖2是表示用GC-MS對圖1 (b)的各峰進行鑒定的結果的質譜，（a)為峰A( 0-水 芹烯）的情況，（b)為峰B(檸檬烯）的情況，（c)為峰C(月桂烯）的情況。
【具體實施方式】
[0050] 本發明的重組細胞為將選自編碼櫳牛兒基二磷酸合成酶的核酸及編碼橙花基二 磷酸合成酶的核酸中的至少1種核酸和編碼0-水芹烯合成酶的核酸導入宿主細胞而成， 且這些核酸在宿主細胞內表達，并具有水芹烯合成能。
[0051] 作為GPP合成酶，只要為可在重組細胞內發揮其酶活性的酶就沒有特別限定。關 于編碼GPP合成酶的核酸（基因）也同樣，只要為可在重組細胞內正常地轉錄、翻譯的核酸 就沒有特別限定。
[0052] 關于NPP合成酶、0-水芹烯合成酶及編碼這些的核酸也同樣。
[0053] 作為GPP合成酶的具體例，可以舉出：源自于擬南芥（Arabidopsisthaliana) 的酶（基因銀行注冊編號：（GenBankAccessionNo.) :Y17376/At2g34630 ;Bouvier,F.，et al.，PlantJ, ? 2000, 24, 241-52.)、源自于結核菌（Mycobacteriumtuberculosis)的 酶（基因銀行注冊編號：（GenBankAccessionNo.) :NP_215504 ;Mann，F.M.，etal.，FEBS Lett.，2011，585, 549-54.)等。
[0054] 序列號1中示出與編碼上述源自于擬南芥的GPP合成酶的核酸（DNA)的堿基序列 對應的氨基酸序列，序列號2中僅示出氨基酸序列。具有序列號1所示的堿基序列的DNA 為編碼GPP合成酶的核酸的一個例子。
[0055] 并且，編碼GPP合成酶的核酸中至少含有對下述（a)、（b)或（c)的蛋白質進行編 碼的核酸。
[0056] (a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質、
[0057] (b)由在序列號2