本(ben)發明(ming)屬于(yu)免疫診斷(duan)和生(sheng)物治療領(ling)域。具體(ti)地(di)說，本(ben)發明(ming)涉及CD146分子及其抗體(ti)在治療乳(ru)腺(xian)癌(ai)方面的(de)應用。更具體(ti)地(di)，CD146單克隆抗體(ti)AA98及其功(gong)能(neng)形式的(de)功(gong)能(neng)在于(yu)抑(yi)制(zhi)三(san)陰性乳(ru)腺(xian)癌(ai)細胞間質細胞特(te)征及惡性特(te)征，從而抑(yi)制(zhi)腫(zhong)瘤轉移(yi)侵襲。

背景技術：

乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)是女(nv)性(xing)中最(zui)(zui)常見且致死率最(zui)(zui)高(gao)的(de)(de)(de)惡(e)性(xing)腫瘤。全球(qiu)每年(nian)有(you)將(jiang)近130萬(wan)女(nv)性(xing)患上乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)，并且有(you)超過(guo)40萬(wan)女(nv)性(xing)因為乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)的(de)(de)(de)轉移(yi)復(fu)發而死亡。乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)中惡(e)性(xing)程度最(zui)(zui)高(gao)的(de)(de)(de)一種亞型(xing)，稱為三陰(yin)(yin)性(xing)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)，以雌激(ji)素受體(ER)陰(yin)(yin)性(xing)/黃(huang)體激(ji)素受體(PR)陰(yin)(yin)性(xing)/表(biao)皮生長(chang)因子受體(HER2)陰(yin)(yin)性(xing)為特征。三陰(yin)(yin)性(xing)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)的(de)(de)(de)發病率約占乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)中的(de)(de)(de)17％～25％，由于(yu)缺乏抗雌激(ji)素和(he)抗HER2靶(ba)向(xiang)治療的(de)(de)(de)靶(ba)標，以及極高(gao)的(de)(de)(de)概率發生轉移(yi)復(fu)發，是預后最(zui)(zui)差的(de)(de)(de)一種乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)類型(xing)。

目前，在(zai)臨(lin)床(chuang)上(shang)治(zhi)療(liao)三(san)(san)陰(yin)性(xing)(xing)乳(ru)腺(xian)癌(ai)主要是(shi)化療(liao)藥物(wu)(wu)，例如順鉑及蒽(en)環類藥物(wu)(wu)，主要發揮預防(fang)腫(zhong)瘤轉移的(de)功能。這類藥物(wu)(wu)沒有靶向性(xing)(xing)，對(dui)(dui)全身正常的(de)組織器官也將(jiang)造成(cheng)損(sun)害，具有很強的(de)毒副作用。另外(wai)，盡管三(san)(san)陰(yin)性(xing)(xing)乳(ru)腺(xian)癌(ai)在(zai)化療(liao)早(zao)期對(dui)(dui)化療(liao)藥物(wu)(wu)比(bi)較敏感，但是(shi)預后依舊很糟糕。因(yin)此，探索三(san)(san)陰(yin)性(xing)(xing)乳(ru)腺(xian)癌(ai)的(de)發病(bing)機理，并從中發掘新靶標，是(shi)三(san)(san)陰(yin)性(xing)(xing)乳(ru)腺(xian)癌(ai)治(zhi)療(liao)的(de)新方向。

大(da)量(liang)文獻報道，上皮細(xi)(xi)胞(bao)(bao)向(xiang)間質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉(zhuan)(zhuan)化的(de)(de)(de)(de)(de)機制(epithelial to mesenchymal transition，EMT)在三(san)陰性(xing)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)的(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)移復發(fa)(fa)(fa)(fa)中發(fa)(fa)(fa)(fa)揮(hui)重(zhong)要作(zuo)用。EMT賦予(yu)腫(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)侵(qin)(qin)襲轉(zhuan)(zhuan)移能力(li)，耐(nai)藥性(xing)以(yi)及干細(xi)(xi)胞(bao)(bao)特征(zheng)。從基因(yin)分型來說，三(san)陰性(xing)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)屬于(yu)(yu)(yu)基底樣(yang)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)的(de)(de)(de)(de)(de)類型，其腫(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)更(geng)傾(qing)向(xiang)于(yu)(yu)(yu)表達間質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)標記分子(zi)，被認為(wei)是一類已(yi)經(jing)發(fa)(fa)(fa)(fa)生(sheng)(sheng)EMT的(de)(de)(de)(de)(de)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)類型，并通(tong)(tong)過(guo)EMT的(de)(de)(de)(de)(de)機制發(fa)(fa)(fa)(fa)生(sheng)(sheng)遠端遷移至(zhi)腦部(bu)、肺(fei)部(bu)等重(zhong)要臟器(qi)。由(you)于(yu)(yu)(yu)三(san)陰性(xing)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)間質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)性(xing)質(zhi)特征(zheng)在一定程(cheng)度(du)上解(jie)釋了腫(zhong)瘤(liu)(liu)的(de)(de)(de)(de)(de)惡性(xing)轉(zhuan)(zhuan)移程(cheng)度(du)，抑(yi)(yi)制其間質(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)特征(zheng)并發(fa)(fa)(fa)(fa)掘新的(de)(de)(de)(de)(de)相關靶標分子(zi)將成為(wei)三(san)陰性(xing)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)治療(liao)的(de)(de)(de)(de)(de)潛(qian)在方向(xiang)。由(you)于(yu)(yu)(yu)很多重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)長因(yin)子(zi)受體相關的(de)(de)(de)(de)(de)酪氨酸(suan)(suan)激(ji)酶活化、TGF-β相關信(xin)(xin)號通(tong)(tong)路，以(yi)及整合素等細(xi)(xi)胞(bao)(bao)黏附(fu)分子(zi)相關的(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)(xin)號通(tong)(tong)路在誘導上皮來源的(de)(de)(de)(de)(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)發(fa)(fa)(fa)(fa)生(sheng)(sheng)EMT的(de)(de)(de)(de)(de)過(guo)程(cheng)中發(fa)(fa)(fa)(fa)揮(hui) 重(zhong)要作(zuo)用，以(yi)這些信(xin)(xin)號通(tong)(tong)路為(wei)靶標的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)體藥物、小分子(zi)抑(yi)(yi)制劑以(yi)及拮(jie)抗(kang)劑被大(da)量(liang)證明通(tong)(tong)過(guo)抑(yi)(yi)制EMT而達到治療(liao)腫(zhong)瘤(liu)(liu)轉(zhuan)(zhuan)移侵(qin)(qin)襲的(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)果(Targeted therapies in control of EMT in carcinoma and fibrosis.Kian-Ngiap Chua，Jing Ma，Jean-Paul Thiery.DOI：10.1016/j.ddmec.2008.06.002)。例如(ru)，cystatin C，一種絲氨酸(suan)(suan)抑(yi)(yi)制劑，在乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中被發(fa)(fa)(fa)(fa)現可以(yi)作(zuo)為(wei)TGF-β受體的(de)(de)(de)(de)(de)拮(jie)抗(kang)劑，進而抑(yi)(yi)制TGF-β與其受體的(de)(de)(de)(de)(de)結合及激(ji)活下游(you)誘導EMT發(fa)(fa)(fa)(fa)生(sheng)(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)(xin)號通(tong)(tong)路。因(yin)此，cystatin C可以(yi)作(zuo)為(wei)潛(qian)在的(de)(de)(de)(de)(de)藥物用于(yu)(yu)(yu)受TGF-β調節的(de)(de)(de)(de)(de)乳(ru)(ru)腺(xian)癌(ai)治療(liao)中。

技術實現要素：

本發(fa)明(ming)首次(ci)提出CD146是三(san)陰性(xing)乳腺(xian)(xian)(xian)癌的(de)新(xin)靶標，抗CD146抗體是治療(liao)這類疾(ji)病(bing)的(de)新(xin)型(xing)靶向藥物(wu)。與傳統的(de)化療(liao)藥物(wu)相比(bi)，抗CD146抗體的(de)副(fu)作用小，不會引(yin)起全身范圍的(de)組(zu)織器官損傷。CD146及其(qi)抗體在三(san)陰性(xing)乳腺(xian)(xian)(xian)癌診斷(duan)和治療(liao)中(zhong)(zhong)的(de)應(ying)用是基于以下重要(yao)的(de)科學發(fa)現：(1)CD146分(fen)子在三(san)陰性(xing)乳腺(xian)(xian)(xian)癌病(bing)理(li)組(zu)織中(zhong)(zhong)特異(yi)性(xing)高表(biao)達(da)；(2)CD146在上皮性(xing)質乳腺(xian)(xian)(xian)癌細(xi)(xi)胞(bao)MCF-7細(xi)(xi)胞(bao)中(zhong)(zhong)過(guo)表(biao)達(da)之后，誘導細(xi)(xi)胞(bao)發(fa)生(sheng)EMT，賦予細(xi)(xi)胞(bao)侵(qin)襲轉移能力；(3)在原(yuan)位(wei)乳腺(xian)(xian)(xian)癌老(lao)鼠模型(xing)(Orthotopic Breast Cancer Mouse Model)中(zhong)(zhong)CD146分(fen)子的(de)過(guo)表(biao)達(da)促進(jin)乳腺(xian)(xian)(xian)腫瘤(liu)的(de)形成，降低(di)腫瘤(liu)的(de)分(fen)化程(cheng)度，以及促進(jin)腫瘤(liu)的(de)原(yuan)位(wei)侵(qin)襲及遠端遷移；(4)在三(san)陰性(xing)乳腺(xian)(xian)(xian)癌細(xi)(xi)胞(bao)MDA-MB-231中(zhong)(zhong)使用siRNA下調CD146分(fen)子的(de)表(biao)達(da)或使用CD146的(de)功能性(xing)抗體AA98，可以抑制其(qi)間質細(xi)(xi)胞(bao)性(xing)質特征，降低(di)細(xi)(xi)胞(bao)轉移侵(qin)襲能力。

綜上所(suo)述，CD146的(de)(de)(de)(de)(de)過表(biao)達可以(yi)誘導上皮性(xing)(xing)(xing)質的(de)(de)(de)(de)(de)腫瘤細(xi)胞(bao)(bao)發(fa)生EMT，這對(dui)三陰(yin)(yin)性(xing)(xing)(xing)乳腺癌的(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)生及進展(zhan)具有重(zhong)(zhong)要作用。同(tong)時，CD146分(fen)子(zi)(zi)對(dui)維持(chi)三陰(yin)(yin)性(xing)(xing)(xing)乳腺癌的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)質細(xi)胞(bao)(bao)特征及惡性(xing)(xing)(xing)程(cheng)度有重(zhong)(zhong)要功(gong)(gong)能(neng)。我們(men)自主研制的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)CD146功(gong)(gong)能(neng)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體(ti)AA98可以(yi)在體(ti)外抑(yi)(yi)制三陰(yin)(yin)性(xing)(xing)(xing)乳腺癌細(xi)胞(bao)(bao)MDA-MB-231的(de)(de)(de)(de)(de)遷(qian)移及侵襲能(neng)力。因此，我們(men)提出CD146可以(yi)作為三陰(yin)(yin)性(xing)(xing)(xing)乳腺癌的(de)(de)(de)(de)(de)靶標分(fen)子(zi)(zi)，其功(gong)(gong)能(neng)性(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)體(ti)AA98可以(yi)通過結合細(xi)胞(bao)(bao)膜表(biao)面(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)CD146分(fen)子(zi)(zi)，通過抑(yi)(yi)制其下游信號通路，從(cong)而阻斷其誘導EMT的(de)(de)(de)(de)(de)功(gong)(gong)能(neng)，或者抑(yi)(yi)制惡性(xing)(xing)(xing)腫瘤細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)質性(xing)(xing)(xing)質特征。同(tong)時，該(gai)種(zhong)抗(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)特異性(xing)(xing)(xing)較好(hao)，不會引起全身范圍的(de)(de)(de)(de)(de)免疫功(gong)(gong)能(neng)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)損傷。

因此，本發(fa)明一(yi)方(fang)面涉及抗CD146的(de)抗體或該抗體的(de)功(gong)能形式在制(zhi)備用于治療(liao)三陰性乳(ru)腺癌藥物中的(de)應用。

在本發明中，抗(kang)CD146的(de)抗(kang)體(ti)(ti)(ti)或(huo)該抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)功能(neng)形式可包括抗(kang)CD146的(de)單克隆抗(kang) 體(ti)(ti)(ti)、基因工程抗(kang)體(ti)(ti)(ti)和人源化抗(kang)體(ti)(ti)(ti)。此類抗(kang)體(ti)(ti)(ti)可根據本領域大量公開的(de)文(wen)獻容易地制備。

在本發明中，抗(kang)CD146的(de)(de)抗(kang)體或該抗(kang)體的(de)(de)功能形式是抗(kang)CD146的(de)(de)抗(kang)體的(de)(de)功能耦合物(wu)(wu)(wu)，其(qi)中與抗(kang)體結合的(de)(de)物(wu)(wu)(wu)質可以是藥物(wu)(wu)(wu)、毒素(su)、放射活(huo)性劑(ji)、酶、細胞(bao)因(yin)子或另(ling)一種抗(kang)體。

在本發(fa)明中(zhong)，抗CD146的抗體(ti)優(you)選(xuan)地是單(dan)克隆抗體(ti)AA98。

本發(fa)明(ming)又一(yi)方(fang)面涉(she)及抗(kang)(kang)(kang)CD146的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)或該抗(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)功(gong)能(neng)(neng)形(xing)式(shi)在制備用于三(san)陰性靶向性治(zhi)療的(de)藥物(wu)中的(de)應用。優選地，所述(shu)抗(kang)(kang)(kang)CD146的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)或該抗(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)功(gong)能(neng)(neng)形(xing)式(shi)包括(kuo)抗(kang)(kang)(kang)CD146的(de)單克隆抗(kang)(kang)(kang)體(ti)、基因工程抗(kang)(kang)(kang)體(ti)和人(ren)源化抗(kang)(kang)(kang)體(ti)。更優選地，所述(shu)抗(kang)(kang)(kang)CD146的(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)是單克隆抗(kang)(kang)(kang)體(ti)AA98。

本(ben)說明書(shu)中(zhong)使用的抗體AA98、AA4、AA1等可根據中(zhong)國專利申請號99107586.2、中(zhong)國專利申請號200810057260.7的描述獲得。

為了更(geng)全面地理解和(he)應(ying)用本(ben)發(fa)明，提供下列(lie)實(shi)施例。

附圖說明

從下面(mian)結合附圖的詳(xiang)細描述中，本發明(ming)的上述特征(zheng)和優點將更明(ming)顯，其(qi)中：

圖1.A：臨(lin)床標本：CD146在三陰性乳腺癌病(bing)人腫(zhong)瘤組織病(bing)理切片中特異(yi)性高表達；B：三陰性乳腺癌vs.非三陰性乳腺癌：88.9％vs.8.7％，p＜0.0001。

圖(tu)2.CD146在(zai)MCF-7細胞(bao)中(zhong)過表達，篩選出(chu)穩定克隆。其中(zhong)Mock為對照，轉入空(kong)載；B10和A5是CD146表達株(zhu)，B10中(zhong)等表達CD146，A5為高表達CD146。

圖3.CD146的(de)(de)過表達誘導細胞發(fa)生EMT。A-B，Mock、B10和A5依次發(fa)生EMT相關的(de)(de)細胞形態及信號分(fen)子變化；C，Mock、B10和A5細胞遷(qian)移能力依次增強；D，Mock、B10和A5侵(qin)襲細胞數。

圖4.在體內(nei)水平，CD146過表達導(dao)致增(zeng)加乳腺(xian)癌腫瘤(liu)生成(cheng)(A)，并減(jian)低腫瘤(liu)分化程度(du)(B)，以(yi)及(ji)腫瘤(liu)的原位遷移(C)；

圖5.在體內水平，CD146過(guo)表達促進乳腺癌遠端遷移(A-D)；

圖6.在三陰性乳(ru)腺癌細(xi)(xi)胞系MDA-MB-231中下(xia)(xia)調CD146表(biao)達(da)逆(ni)轉(zhuan)其間質細(xi)(xi)胞特征(zheng)。(A)Western Blot鑒定乳(ru)腺癌細(xi)(xi)胞系MCF-7、MDA-MB-231以及Hs78T細(xi)(xi)胞EMT相(xiang)關標記分子(zi)(B)CD146表(biao)達(da)下(xia)(xia)調導致EMT相(xiang)關標記分子(zi)的(de)變化(hua)；(C)CD146表(biao)達(da)下(xia)(xia)調導致細(xi)(xi)胞形態的(de)逆(ni)轉(zhuan)；(D-E)CD146表(biao)達(da)下(xia)(xia)調導致細(xi)(xi)胞遷移(yi)及侵襲能(neng)力的(de)下(xia)(xia)降；

圖7.抗CD146功能(neng)性(xing)抗體AA98抑制三陰(yin)性(xing)乳腺癌細胞(bao)(bao)系MDA-MB-231的間質細胞(bao)(bao)特征(A-D)。

圖8.Sigma公司真核表達(da)質(zhi)粒(li)p3XFLAG-HA-cmv-14圖譜(pu)。

具體實施方式

實施例一：CD146在三(san)陰(yin)性乳腺癌病人腫瘤組織病理切片中特異性高(gao)表達；

細(xi)胞黏附(fu)分(fen)子(zi)(zi)在(zai)乳(ru)腺癌發生發揮(hui)過程中發揮(hui)重(zhong)要作用。CD146分(fen)子(zi)(zi)是一(yi)個有(you)關血管新生及腫(zhong)瘤轉移的(de)重(zhong)要細(xi)胞黏附(fu)分(fen)子(zi)(zi)。為了研究CD146在(zai)乳(ru)腺癌中的(de)作用，我們對(dui)90例乳(ru)腺癌組織病理切片(pian)進行(xing)免疫組化分(fen)析(xi)，發現CD146分(fen)子(zi)(zi)在(zai)三陰性(xing)乳(ru)腺癌中特異性(xing)高(gao)表(biao)達。

主要(yao)材(cai)料(liao)：乳(ru)腺(xian)癌病人腫瘤(liu)組織石(shi)蠟切片，包(bao)括44例三陰(yin)性乳(ru)腺(xian)癌及46例非三陰(yin)性乳(ru)腺(xian)癌組織，均來源于天津(jin)腫瘤(liu)醫院(yuan)；

主(zhu)要試劑：4％多聚甲醛，二甲苯，無水(shui)(shui)乙醇，無水(shui)(shui)甲醇，過氧化氫，PBS，小(xiao)鼠(shu)抗CD146單克隆抗體(ti)AA4；本說明書中使用的(de)抗體(ti)AA98、AA4、AA1等(deng)可根(gen)據中國專(zhuan)利申(shen)請(qing)號99107586.2、中國專(zhuan)利申(shen)請(qing)號200810057260.7的(de)描(miao)述獲得。

主要方法：石(shi)蠟切片(pian)制(zhi)作：用4％多(duo)聚甲(jia)醛固定新鮮組(zu)織24小時(shi)后，石(shi)蠟包埋，以下為石(shi)蠟切片(pian)的免疫(yi)組(zu)化過程：

1)取出片子，入二(er)甲苯溶(rong)液37℃脫蠟兩次，每(mei)次30分鐘(zhong)；

2)入無水(shui)乙醇(chun)×2-95％-80％-70％-50％-30％和蒸餾水(shui)中水(shui)化，室(shi)溫(wen)每(mei)次5分鐘(zhong)；

3)0.3％過(guo)(guo)氧(yang)化氫/甲醇溶(rong)液37℃避(bi)光處理30分鐘，消除內源(yuan)性過(guo)(guo)氧(yang)化物酶的活性，PBS洗三次；

4)pH6.0檸(ning)檬酸修(xiu)(xiu)復液100℃水浴30分鐘(zhong)抗原熱修(xiu)(xiu)復，自然冷(leng)卻；

5)5％的正常羊血清37℃封閉1小時；

6)加(jia)入PBS稀釋(shi)的一抗(兔抗CD146多抗或AA4)，4℃孵育過夜；

7)PBS洗三(san)次；山羊抗-兔-生物素(su)或山羊-抗-小(xiao)鼠-生物素(su)二抗(購自(zi)中衫金(jin)橋(qiao))(1∶1000)在37℃孵育1小(xiao)時(shi)，PBS洗三(san)次；

8)親和(he)素-HRP(1∶1000)在37℃孵(fu)育45分鐘(zhong)；

9)用現配(pei)的DAB避光顯(xian)色2-7分(fen)鐘，再(zai)進行蘇木(mu)素復(fu)染。

10)逐級脫水：50-70-80-90-100-100％乙醇-二(er)甲苯，晾干，中(zhong)性樹脂封 片。

11)顯微(wei)成像系統中拍(pai)片。

結(jie)果(guo)顯(xian)示，如(ru)圖1所(suo)示，相比于非三(san)陰(yin)性(xing)乳腺(xian)癌組織，CD146分子在三(san)陰(yin)性(xing)乳腺(xian)癌組織中特異性(xing)高(gao)表(biao)達(da)。CD146表(biao)達(da)在腫瘤(liu)細胞(bao)的(de)細胞(bao)膜，并更傾(qing)向于表(biao)達(da)在腫瘤(liu)遷移的(de)邊(bian)緣。

實施(shi)例二：CD146過表達誘導上皮性質乳(ru)腺癌細(xi)胞MCF-7發生EMT；

我(wo)們選擇了(le)CD146陰性(xing)的(de)(de)細胞(bao)系MCF-7細胞(bao)(購自上(shang)海細胞(bao)庫，目錄號為(wei)(wei)(wei)TCHu74)作為(wei)(wei)(wei)了(le)細胞(bao)模型(xing)，發現CD146在(zai)(zai)惡性(xing)的(de)(de)三陰性(xing)乳腺癌(ai)組織中(zhong)高表(biao)達具(ju)有重要意義。MCF-7是一個上(shang)皮(pi)性(xing)質的(de)(de)乳腺癌(ai)腫瘤細胞(bao)系，惡性(xing)程度低(di)，分化程度高，細胞(bao)遷移能力極弱。我(wo)們在(zai)(zai)MCF-7中(zhong)過表(biao)達CD146分子，構建(jian)獲(huo)得了(le)2個穩定(ding)表(biao)達株(zhu)，B10和A5，其中(zhong)B10中(zhong)等表(biao)達CD146，A5為(wei)(wei)(wei)高表(biao)達CD146。同時，我(wo)們也在(zai)(zai)MCF-7細胞(bao)中(zhong)轉入空載體，構建(jian)了(le)對(dui)照(zhao)穩定(ding)株(zhu)Mock。具(ju)體過程如下詳述。

主要(yao)試(shi)(shi)劑(ji)：CD146 cDNA(SEQ ID NO：7)武漢三鷹生物(wu)技術有(you)限公司(si)(si)購買(mai)獲得(編(bian)號(hao)(hao)：BC056418，載(zai)體(ti)(ti)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)為(wei)pCMV-SPORT6)，所(suo)編(bian)碼的(de)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)序列見SEQ ID NO：8。我們(men)選擇了真核(he)(he)表達質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)p3XFLAG-HA-cmv-14(購買(mai)于(yu)Sigma公司(si)(si)，編(bian)號(hao)(hao)E4901)構建(jian)CD146真核(he)(he)表達質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)，原始質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)圖譜見圖8。CD146 cDNA通(tong)過EcoRI與BamHI兩(liang)個酶切位點插(cha)入p3XFLAF-HA-cmv-14，構建(jian)后(hou)所(suo)得的(de)目(mu)的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)由本實驗室長期保存。其中(zhong)(zhong)從(cong)含有(you)CD146 cDNA的(de)載(zai)體(ti)(ti)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)上PCR出5’及3’端(duan)分(fen)別帶有(you)EcoRI與BamHI的(de)CD146 cDNA片段運用(yong)(yong)的(de)引物(wu)為(wei)：正向5’-CGGAATTCA ATG GGG CTT CCC AGG CTG-3’(SEQ ID NO：1)；反向5’-GCG GAT TCA TGC CTC AGA TCG ATG TA-3’(SEQ ID NO：2)。轉染試(shi)(shi)劑(ji)為(wei)羅氏(shi)Fugene HD。G418試(shi)(shi)劑(ji)購買(mai)于(yu)Sigma。Transwell技術使(shi)用(yong)(yong)的(de)96孔板(ban)(8μm)購買(mai)于(yu)美國康寧(Coring)。本說明書中(zhong)(zhong)使(shi)用(yong)(yong)的(de)抗(kang)體(ti)(ti)AA98、AA4、AA1等可根(gen)據中(zhong)(zhong)國專利(li)(li)申請號(hao)(hao)99107586.2、中(zhong)(zhong)國專利(li)(li)申請號(hao)(hao)200810057260.7的(de)描述(shu)獲得。抗(kang)E-cadherin抗(kang)體(ti)(ti)、抗(kang)cytokeratin抗(kang)體(ti)(ti)、抗(kang)Fibronectin抗(kang)體(ti)(ti)、抗(kang)GAPDH抗(kang)體(ti)(ti)購買(mai)于(yu)Abcam，抗(kang)Vimentin抗(kang)體(ti)(ti)購買(mai)于(yu)Sigma。胰酶購買(mai)于(yu)Gibco。Matrigel購于(yu)BD biosciences公司(si)(si)。

主要方法：采用脂質體轉染(ran)(ran)試劑轉染(ran)(ran)真核(he)細(xi)胞，并采用G418抗(kang)性(xing)篩選出單(dan)克隆(long)，再運用Western Blot、流式細(xi)胞儀、Transwell技術等鑒定所得細(xi)胞的特性(xing)。

(1)將MCF-7細胞(bao)種在(zai)2個35mm的細胞(bao)培養皿中，使第二天(tian)轉染時細胞(bao)密(mi)度 達到80％左右。

(2)根據羅(luo)氏Fugen HD轉染(ran)試劑(ji)的說(shuo)明，分別對兩(liang)個25mm培養皿(min)中(zhong)的MCF-7細胞轉染(ran)p3XFlag質(zhi)粒(li)或p3XFlag-CD146質(zhi)粒(li)，48h后(hou)分別加(jia)入G418(0.5μg/ml)進行篩選；

(3)1周后，等存活的細胞長滿后，胰酶消化細胞后，用新鮮培養基稀釋細胞密度至1X10⁴個/ml，種于96孔(kong)板，對多克(ke)隆(long)進行單克(ke)隆(long)化。

(4)96孔板的(de)(de)細胞長滿后，擴大到35mm培(pei)養(yang)(yang)皿進(jin)行培(pei)養(yang)(yang)，并采(cai)用流(liu)式分析(xi)的(de)(de)方(fang)法對CD146的(de)(de)表達量進(jin)行檢測，挑(tiao)選不(bu)同表達量的(de)(de)CD146克(ke)隆。

(5)對挑選出的克隆繼續在G418存在的情況下培養約2-3月，待克隆穩定后即可進行后續細胞形態觀察、細胞遷移侵襲測試等實驗。對于細胞遷徙實驗，5X10³個細胞種于Tranwell板中的上孔，培養在50μl無血清的MEM培養基中，下孔中為含200μl10％血清的MEM培養基作為誘導，14-18h后，上孔中的培養基被吸干，覆蓋于膜上的細胞被蘸了70％的酒精的棉球棒擦干凈，膜被揭下并倒扣在在玻片上。遷移過來的細胞用4％的PFA固定并結晶紫染色，顯微鏡拍照并計數。每個細胞需要設計3個平行對照孔。對于細胞侵襲實驗，膜上需預先覆蓋2.5mg/ml的Matrigel膠，1X10⁴個細(xi)胞將用于該(gai)實驗。接下步驟與上同。

如圖(tu)3所示，在MCF-7穩定克隆株(zhu)Mock、B10和A5這一系列中，我們觀察到有關EMT的(de)(de)(de)相關變化。首(shou)先，Mock細(xi)(xi)(xi)胞(bao)維持(chi)母本MCF-7細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)典(dian)(dian)型的(de)(de)(de)上(shang)皮性(xing)質(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)形(xing)態(tai)，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)成片生長，呈鋪路石狀，其緊密連接。然而，高表(biao)(biao)達CD146分(fen)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)A5細(xi)(xi)(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)發(fa)生極(ji)大變化，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)分(fen)散生長成梭性(xing)。中等表(biao)(biao)達CD146分(fen)子(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)B10細(xi)(xi)(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)處于兩種的(de)(de)(de)中間狀態(tai)。其次，Western Blot實(shi)驗表(biao)(biao)明Mock細(xi)(xi)(xi)胞(bao)表(biao)(biao)達典(dian)(dian)型的(de)(de)(de)上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)標記分(fen)子(zi)(zi)(zi)，例(li)如E-cadherin和Cytokeratin。而A5細(xi)(xi)(xi)胞(bao)表(biao)(biao)達典(dian)(dian)型的(de)(de)(de)間質(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)標記分(fen)子(zi)(zi)(zi)，例(li)如Vimentin和Fibronectin。(Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease，Jean Paul Thiery，Hervé Acloque，Ruby Y.J.Huang and M.Angela Nieto.Cell 139，November 25，2009)。最重要的(de)(de)(de)是，應用Transwell技術(shu)(Leukocyte transmigration through vascular endothelium.An in vitro method.Allavena P，Del Maschio A.Methods Mol Biol.1999；96：171-6)，我們能(neng)發(fa)現(xian)CD146在A5細(xi)(xi)(xi)胞(bao)中的(de)(de)(de)高表(biao)(biao)達顯著地增(zeng)強了(le)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)遷徙及侵襲能(neng)力。

實施(shi)例三：在原(yuan)(yuan)位(wei)乳(ru)腺癌老(lao)鼠模(mo)型中(zhong)CD146過表達促進乳(ru)腺腫瘤的(de)形成，降低腫瘤的(de)分化程(cheng)度，并(bing)促進腫瘤的(de)原(yuan)(yuan)位(wei)侵襲及遠(yuan)端遷(qian)移；

我們利用SCID/Beige構建(jian)了(le)原位移(yi)植的乳腺癌小鼠模(mo)型，發(fa)現在體(ti)內水平CD146的高表達對乳腺癌的發(fa)生發(fa)展具有(you)重(zhong)要作用。

實驗方法：選擇20只4周大小雌性的SCID/Beige(購于維通利華)小鼠，隨機分為2組。分別在乳腺脂肪組織墊注射1×10⁶個MCF-7細胞來源的克隆Mock或A5細胞重懸在50ul PBS，與(yu)50ul 2.5mg/ml的Matrigel混合。每周觀察1次，測量長(chang)、寬及高，以便計算腫瘤(liu)體積。10周后(hou)，當有荷瘤(liu)鼠變(bian)得虛弱后(hou)，脫頸(jing)法處死所有小鼠，剝離腫瘤(liu)和重要臟器，4％PFA固定(ding)24小時后(hou)，石蠟包(bao)埋，切片并做免(mian)疫組化(hua)分析。

結(jie)(jie)果如(ru)(ru)圖(tu)(tu)4、圖(tu)(tu)5所示，Mock細胞(bao)(bao)在SCID/Beige小(xiao)鼠(shu)上成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)瘤(liu)(liu)性差，10只(zhi)小(xiao)鼠(shu)中(zhong)只(zhi)有(you)3只(zhi)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)瘤(liu)(liu)，且(qie)(qie)腫(zhong)瘤(liu)(liu)體積偏小(xiao)，腫(zhong)瘤(liu)(liu)組織(zhi)(zhi)結(jie)(jie)構(gou)(gou)完(wan)整，表明(ming)分化程度高(gao)，且(qie)(qie)沒有(you)發生原位侵襲(xi)及遠端遷移(yi)。而形成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)鮮明(ming)對比的(de)(de)是，CD146高(gao)表達的(de)(de)A5細胞(bao)(bao)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)瘤(liu)(liu)容易(yi)，10只(zhi)小(xiao)鼠(shu)中(zhong)只(zhi)有(you)8只(zhi)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)瘤(liu)(liu)，且(qie)(qie)腫(zhong)瘤(liu)(liu)體積普(pu)遍偏大(da)，腫(zhong)瘤(liu)(liu)組織(zhi)(zhi)結(jie)(jie)構(gou)(gou)混(hun)亂，表明(ming)分化程度低。更重要的(de)(de)是，A5形成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)的(de)(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)顯著地侵襲(xi)到鄰(lin)近的(de)(de)正常(chang)組織(zhi)(zhi)，例如(ru)(ru)皮膚，乳腺，肋(lei)骨等，且(qie)(qie)轉移(yi)到了肺部及肝臟。

實施例四：在三(san)陰(yin)性乳腺(xian)癌細(xi)胞(bao)系(xi)MDA-MB-231下調CD146或(huo)抗(kang)CD146功(gong)能性抗(kang)體AA98表達抑制其間(jian)質細(xi)胞(bao)特征。

主(zhu)要試(shi)劑：靶向(xiang)(xiang)CD146的siRNA序列：正(zheng)向(xiang)(xiang)5’-CCA GCU CCG CGU CUA CAA AdTdT-3’(SEQ ID NO：3)，反向(xiang)(xiang)5’-UUU GUA GAC GCG GAG CUG GdTdT-3’(SEQ ID NO：4)；靶向(xiang)(xiang)GFP的siRNA序列：正(zheng)向(xiang)(xiang)5’-CUU CAG CCU CAG CUU GCC GdTdT-3_(SEQ ID NO：5)，反向(xiang)(xiang)5’-CGG CAA GCU GAC CCU GAA GdTdT-3’(SEQ ID NO：6).Lipofectin 2000轉染試(shi)劑購于Invitrogen公(gong)司(si)。

主要方(fang)法：(1)MDA-MB-231細(xi)胞(bao)(bao)分(fen)(fen)于2個35mm細(xi)胞(bao)(bao)培養(yang)皿(min)中，以使第二天轉染siRNA時密度達(da)到70％左右。根據(ju)Lipofectin 2000的(de)(de)轉染要求，分(fen)(fen)別對兩個35mm培養(yang)皿(min)的(de)(de)MDA-MB-231細(xi)胞(bao)(bao)轉染siRNA-GFP或者siRNA-CD146，48h后(hou)(hou)使用RIPI裂解緩沖液裂解細(xi)胞(bao)(bao)，做總(zong)蛋白定量之后(hou)(hou)跑SDS-PAGE，并進(jin)行Western Blot進(jin)行相關分(fen)(fen)子的(de)(de)檢測。確(que)認CD146在MDA-MB-231細(xi)胞(bao)(bao)中表(biao)達(da)下調的(de)(de)效果后(hou)(hou)，進(jin)一步進(jin)行細(xi)胞(bao)(bao)形態變化(hua)觀察、細(xi)胞(bao)(bao)侵襲遷(qian)移能力等測試。

(2)MDA-MB-231細(xi)(xi)胞(bao)分于2個35mm細(xi)(xi)胞(bao)培養皿(min)后，立即(ji)加(jia)入mIgG及AA98 (50mg/ml)進行刺激，48h后進行各種檢(jian)測，與上(shang)同。

我們進一步選擇三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231(購自ATCC，編號HTB-26^TM)為研究模型，使用(yong)靶向CD146分子(zi)的(de)(de)siRNA(于Invitrogen合成(cheng))下調CD146的(de)(de)表達或抗CD146功能性抗體(ti)AA98，發現CD146對維(wei)持間(jian)質細胞特征的(de)(de)腫(zhong)瘤細胞的(de)(de)惡(e)性程度具有重要功能。

結(jie)果如(ru)圖(tu)6、圖(tu)7所(suo)示，靶(ba)向CD146分(fen)(fen)子(zi)(zi)的(de)siRNA將MDA-MB-231細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)中CD146蛋白水(shui)平下(xia)調(diao)到(dao)原(yuan)來的(de)三(san)分(fen)(fen)之(zhi)一。我們(men)觀(guan)察到(dao)梭性(xing)(xing)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)開始部(bu)分(fen)(fen)回(hui)圓。與此同時，間(jian)質細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)標(biao)記(ji)分(fen)(fen)子(zi)(zi)vimentin及Fibronectin表(biao)(biao)達(da)下(xia)調(diao)，上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)標(biao)記(ji)分(fen)(fen)子(zi)(zi)E-cadherin表(biao)(biao)達(da)上(shang)調(diao)。更(geng)重要的(de)是，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)遷(qian)移及侵襲能力受到(dao)了(le)抑制(zhi)。同時，抗(kang)(kang)CD146功(gong)能性(xing)(xing)抗(kang)(kang)體(ti)AA98也可(ke)以顯著抑制(zhi)MDA-MB-231細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)間(jian)質細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)標(biao)記(ji)分(fen)(fen)子(zi)(zi)Slug表(biao)(biao)達(da)，上(shang)調(diao)上(shang)皮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)標(biao)記(ji)分(fen)(fen)子(zi)(zi)E-cadherin的(de)表(biao)(biao)達(da)，并抑制(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)遷(qian)移能力。