專利名稱：具有增加的穩定性的重組因子viii的制作方法
具有增加的穩定性的重組因子Vl I I本申請要求2007年11月1日提交的美國臨時專利申請序列第60/984，518號和 2007年11月30日提交的美國臨時專利申請系列第60/991，304號的優先權權益，通過引用 將他們每一個整體并入本文。本發明是根據美國國家衛生研究院授予的HL 76213和HL 38199號基金在政府的 支持下進行的。政府具有本發明的某些權利。
背景技術：
最常見的重度遺傳性出血疾患血友病A是由血漿蛋白因子VIII的缺乏或缺陷引 起的。還沒有血友病A的治愈方法并且治療由使用(純化的)血漿制劑或重組蛋白制劑的 替代治療組成。因子VIII以非共價的金屬離子依賴性的異源二聚體參與循環。這種前體輔因 子(procofactor)形式的蛋白含有包括Al (al)A2 (a2)B結構域的重鏈(HC)和包括(a3) A3C1C2結構域的輕鏈(LC)，小寫的a表示富含酸性殘基的短的(約30至40個殘基)區 段(參見 Fay, "Activation of Factor VIII andMechanisms of Cofactor Action (因子 VIII的激活和輔因子的作用機制)，"Blood Rev. 18 :1_15 (2004))。因子VIII在A1A2、A2B 和A3A3接合處被凝血酶或因子Xa催化的蛋白裂解激活。該反應的產物因子VIIIa是包括 稱為A1、A2和A3C1C2的亞基的異源三聚體，它在酶原因子X向絲氨酸蛋白酶因子Xa的膜 依賴性的轉化中作為絲氨酸蛋白酶因子IXa的輔因子起作用(參見Fay，“Activation of Factor VIII and Mechanisms of Cofactor Action (因子 VIII 的激活和輔因子的作用機 制)，” Blood Rev. 18 1-15 (2004)) ·重構研究已顯示因子VIII異源二聚體結構是由靜電相互作用和疏水相互作用二 者支撐的(Fay, "Reconstitution of Human Factor VIII from IsolatedSubunits (由 分離的亞基重構人因子 VIII)，”Arch Biochem Biophys. 262 525-531 (1988) ；Ansong 等 人，“Factor VIII Al Domain Residues 97_105Represent a Light Chain-interactive Site(因子VIII Al結構域殘基97-105代表輕鏈相互作用位點)，"Biochemistry. 45 13140-13149(2006))，并且鏈間親和力被因子VIII與馮維勒布蘭德(von ffillebrand) 因子的結合進一步加強(Fay, "Reconstitution of Human Factor VIII from Isolated Subunits (由分離的亞基重構人因子 VIII)，”Arch Biochem Biophys. 262 525-531 (1988)； Kaufman等人,“Regulation of Factor VIII Expression and Activity by vonffillebrand Factor (馮維勒布蘭德因子對因子VIII表達和活性的調節，，，Thromb Haemost. 82 201-208(1999))。金屬離子也促進鏈間親和力和活性參數(Wakabayashi等人，“Metal Ion-independent Association of Factor VlIISubunits and the Roles of Calcium and Copper Ions for Cofactor Activity andlnter-subunit Affinity (金屬離子 非依賴性的因子VIII亞基締合和鈣離子和銅離子對輔因子活性和亞基間親和力的作 用)，"Biochemistry40 10293-10300 (2001))。需要鈣來產生活性的因子VIII構象。誘變研 究將鈣結合位點定位在Al結構域內富含酸性殘基的區段(殘基110-126)并且鑒定了此區 域中離子配位的主要的特定殘基(Wakabayashi等人，“Residuesll0-126in the Al Domainof Factor VIII Contain a Ca2+ Binding Site Requiredfor Cofactor Activity(因 子VIII的Al結構域中的殘基110-126含有輔因子活性所需的Ca2+結合位點)，” J Biol Chem. 279 12677-12684 (2004))。近期的中間分辨率的X射線結構(Shen等人，"The Tertiary Structure and DomainOrganization of Coagulation Factor VIII (凝血因 子VIII的三級結構和結構域組織)，”Blood 111 =1240-1247 (2008))證實了這種鈣結合 位點并提出了在A2結構域中的第二個可能位點。這個結構還顯示Al和A3結構域中占 有兩個1型銅離子位點。較早的功能研究已顯示銅離子促進重鏈和輕鏈締合形成異源二 聚體，這在生理PH值下將鏈間親和力增加幾倍(Fay等人，“HumanFactor Villa Subunit Structure ；Reconstruction of Factor Villa from thelsolated Al/A3-Cl_C2Dimer and A2Subunit (人因子Villa亞基結構由分離的A1/A3-C1-C2 二聚體和A2亞基重構 因子 Villa)，” J Biol Chem. 266 :8957_8962 (1991) ；Wakabayashi 等人，“ρΗ-d印endent Association ofFactor VIII Chains !Enhancement of Affinity at Physiological pH by Cu2+(pH依賴性的因子VIII鏈的締合Cu2+在生理pH下增強親和力)，"BiochimBiophys Acta. 1764 1094-1101 (2006) ；Ansong等人，“Factor VIII A3 DomainResidues 1954-1961 Represent an Al Domain-Interactive Site (因子 VIII A3 結構域殘基 1954-1961 代表 Al 結構域相互作用位點)，” Biochemistry44 :8850_8857 (2005))。 因子VIIIa的不穩定性是由A2亞基和A1/A3C1C2 二聚體之間的弱靜電相互 作用引起的(Fay 等人，"Human Factor Villa Subunit Structure -Reconstruction of Factor Villa from the Isolated A1/A3-C1-C2 Dimer and A2Subunit(人因 子Villa亞基結構由分離的A1/A3-C1-C2 二聚體和A2亞基重構因子Villa)，” J Biol Chem. 266 8957-8962(1991) ；Lollar φ 入，“pH—dependent Denaturation of Thrombin-activated Poreine Factor VIII (凝血酶激活的豬因子VIII的pH依賴性的 變性，”J Biol Chem. 265 1688-1692 (1990))并且會導致因子 Xase 的活性減弱(Lollar 等人，"Coagulant PropertiesofHybrid Human/Porcine Factor VIII Molecules (雜合 的人/ 豬因子 VIII 分子的促凝血特性)，”J Biol Chem. 267 =23652-23657 (1992) ； Fay 等 人，"Modelfor the Factor Villa-dependent Decay of the Intrinsic Factor Xase Role ofSubunit Dissociation and Factor IXa-catalyzed Proteolysis (因子 Villa 依賴性的內在因子Xase衰退(decay)的模型亞基解離和因子IXa催化的蛋白水解的 作用)，”J Biol Chem. 271 =6027-6032 (1996)) 關于因子VIIIa中的A2亞基的締合的 可用信息是有限的，Al和A3結構域中的殘基似乎都促進這種亞基的保留。已經顯示幾 種因子VIII點突變相對于野生型有利于A2的解離，并且這些殘基定位在A1-A2結構域 界面(Pipe 等人，“Mild HemophiliaA Caused by Increased Rate of Factor VIII A2 Subunit Dissociation :Evidencefor Nonproteolytic Inactivation of Factor Villa in vivo (因子VIII A2亞基解離的速率增加引起的輕度血友病A 體內因子VIII非蛋白 水解滅活的證據)，”Blood 93:176-183(1999) ；Pipe 等人，“Hemophilia A Mutations Associatedwith l-stage/2-stage Activity Discrepancy Disrupt Protein-protein Interactionswithin the Triplicated A Domains of Thrombin-activated Factor VIIIad期/2期活性差異相關的血友病A突變破壞凝血酶激活的因子VIIIa的三個A結構 域中的蛋白-蛋白相互作用)，”Blood 97:685-691(2001))或A2-A3結構域界面(Hakeos等人，“Hemophilia A Mutations within the Factor VIII A2_A3Subunit Interface Destabilize Factor Villa and Cause One-stage/Two-stageActivity Discrepancy(因 子VIII A2-A3亞基界面內的血友病A突變使因子VIIIa不穩定并且引起1期/2期活 性差異)，”Thromb Haemost. 88 781-787 (2002))。這些因子VIII變體表現出特征性 的 1 期/2 期測定差異(Duncan 等人，“Familial Discrepancy Between the One-stage and Two-stage Factor VIIIMethods in a Subgroup of Patients with Haemophilia A(患血友病A的患者亞群中1期和2期因子VIII方法之間的家族差異)，”Br J Haematol. 87 :846-848 (1994) ；Rudzki 等人，“Mutations in a Subgroup of Patients with MildHaemophilia A and a Familial Discrepancy Between the One-stage andTwo—stage Factor VIII =C Methods (患輕度血友病A的患者亞群中的突變和1期與2期因子VIII =C 方法之間的家族差異)，”Br J Haematol. 94 :400_406 (1996))，其中由于A2亞基解離的速 率增加致使后一種測定所測得的活性值顯著降低。因子VIII的A結構域的基于血漿銅藍蛋白的同源性模型的檢測(Pemberton等 人，“A Molecular Model for the Triplicated A Domains ofHuman Factor VIII Based on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血漿銅藍蛋白的晶體結構的 人因子VIII的三個A結構域的分子模型)，” Blood89 =2413-2421 (1997))表明A2結構域 與Al和A3結構域的每一個之間的的延伸界面，其中多個可能的接觸點有利于結合相互作 用。在穩定因子VIIIa方面存在著明顯的興趣，因為更穩定形式的蛋白代表了血 友病A的優良治療劑，可能需要較少的材料來治療患者(Fay等人，“Mutating Factor VIII =Lessons from Structure to Function(對因子VIII進行突變由結構到功能的 教導)，”Bl00dRevieWS 19:15-27(2005))。為了這個目的，描述了因子VIII的制備，其 中通過在A2和其他的因子VIII結構域之間引入新共價鍵在重組蛋白中制備了突變以 防止 A2 亞基解離(Pipe 等人，“Characterization of a Genetically Engineered I nactivation-resistantCoagulation Factor Villa( it # XfMit 白勺 舌白勺 Hil IS 子 VIIIa 的表征)，”Proc NatlAcad Sci USA 94:11851-11856(1997) ；Gale 等人，“An EngineeredInterdomain Disulfide Bond Stabilizes Human Blood Coagulation Factor Villa(工程化的結構域間二硫鍵穩定人血凝血因子Villa)，” J. Thromb. Haemostasis 1 1966-1971(2003))。然而，從此有建議認為這些類型的突變可能在治療性因子VIII中是不 希望的，因為他們基本上排除了下調的方法。這種情況會產生可能引起損傷的血栓前病癥。 因此，可能希望增強因子VIII和因子VIIIa兩者的穩定性，但是以促進前血栓病癥的可能 性最小的方式進行。本發明針對于克服本領域內的這些和其他缺陷。發明概述本發明的第一方面涉及重組因子VIII，所述重組因子VIII包括導致因子VIII和 因子VIIIa兩者的穩定性增強的一種或多種突變。優選地，所述一種或多種突變構成了疏水性氨基酸殘基對A1A2或A2A3結構域界 面的任一界面或兩個界面的一個或多個帶電荷氨基酸殘基的取代。本發明的特別優選的重 組因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子VIII的Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的Glu665殘基的取代、 野生型因子VIII的Glul984殘基的取代或它們的組合。本發明的第二方面涉及包含根據本發明的第一方面的重組因子VIII的藥物組合 物。本發明的第三方面涉及編碼根據本發明的第一方面的重組因子VIII的分離的核 酸分子。本發明的這個方面還包括含有編碼本發明的重組因子VIII的DNA分子的重組DNA 表達系統、和含有所述DNA分子和/或重組表達系統的重組宿主細胞。本發明的第四方面涉及制備重組因子VIII的方法，該方法包括將根據本發明的 第三方面的宿主細胞在使得所述宿主細胞表達重組因子VIII的條件下培養；和分離所述 重組因子VIII。本發明的第五方面涉及治療動物血友病A的方法。該治療方法包括給表現血友 病A的動物施用有效量的根據本發明的第一方面的重組因子VIII，從而使動物在血管損傷 后表現出有效的血液凝集。本發明證明在A1A2和A2A3結構域界面的大量帶電荷的殘基不參與氫鍵鍵合，但 是可能使因子VIII結構不穩定和/或在因子VIII前體輔因子激活后促進A2亞基解離。在 所附的實施例中顯示用疏水性殘基取代這些帶電荷的殘基-目的是增加隱藏的疏水區域 并誘導隱藏的親水區域-增強結構域間的結合親和力。在評估了因子VIII變體在較高的 溫度下的活性和A2亞基解離所導致的因子VIII活性衰退的時程之后評估了穩定性參數。 這些研究的結果證明大量突變產生增加的穩定性參數，這與可能由于A2結構域界面處隱 藏的電荷所導致的去穩定力的消除是一致的。因子VIII和激活的輔因子VIIIa的這些穩 定化的變體應該提供治療血友病A的改良治療劑。附圖簡述

圖1為圖解如通過一期凝集測定(黑色柱)和二期發色因子Xa生成測定(灰色 柱)所測量的因子VIII突變體相對于野生型因子VIII的活性的圖。野生型和突變體因子 VIII形式的活性如實施例中所描述地測量。誤差線顯示由三次獨立的測定進行平均的標準 偏差的值。圖2A-B分別圖解野生型和突變體因子VIII和因子VIIIa的活性衰退。在圖2A 中，在55°C下孵育因子VIII(4nM)并在所指示的時間取出等分試樣并通過如實施例中所描 述的因子Xa生成測定來測定活性。顯示了野生型(虛線，空心圓)、R282A(空心三角形)、 S524A (空心正方形)、N684A (空心菱形)、R531A (實心圓)、S650A (實心三角形)、E287A (實 心正方形)和D302A(實心菱形)的結果。在圖2B中，在40nM因子IXa存在的條件下在 23°C下孵育凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)并在所指示的時間點取出等分試樣并通過如實 施例中所描述的因子Xa生成測定來測量活性。顯示了野生型(虛線，空心圓)、R282A(空 心三角形)、S524A(空心正方形)、Y1792F(空心菱形)、N684A(實心圓)、Y1786F(實心三 角形)、R531A(實心正方形)、E287A(實心菱形)和D302A(灰色圓)的結果。所選的快速 衰退的變體的結果在圖2B的插圖中以放大的比例顯示。圖3A-B圖解因子VIII突變體和野生型因子VIII的SDS-PAGE和蛋白質印 跡分析。圖3A顯示在8 %的聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE后通過GelCode顯現的 純化的野生型和突變體因子VIII蛋白(0.77yg)。圖3B顯示在8 %的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉移到PVDF膜上并通過生物素化的R8B12抗體探測的純化的野生型和 突變體因子VIII蛋白(0.34yg)。條帶通過如所附的實施例中所描述的化學熒光顯 現。野生型(泳道 1)、Glu272Ala(泳道 2)、Glu272Val (泳道 3)、Asp519Ala(泳道 4)、 Asp519Val (泳道 5)、Glu665Ala(泳道 6)、Glu665Val (泳道 7)、Glul984Ala(泳道 8)和 Glul984Val (泳道9)。MW，分子量標志物sFVIII，單鏈形式的因子VIII :HC，重鏈LC， 輕鏈。單鏈形式與野生型和突變體因子VIII的異源二聚體形式的表觀化學計量比為 0. 96 (野生型)、0. 64(Glu272Ala)、0· 92 (Glu272Val)、0· 74 (Asp519Ala)、0· 8 (Asp519Val)、 0. 64(Glu665Ala)、0. 63(Glu665Val)、0. 91 (Glul984Ala)和 0. 5(Glul984Val)。圖4A-D圖解因子VIII突變體相對于野生型因子VIII的比活和凝血酶生成測 定。圖4A顯示使用如所附的實施例中所描述的一期凝集測定(灰色柱)和二期發色因 子Xa生成測定(實心柱)所測定的活性值。圖4B-C圖解因子VIII蛋白的凝血酶生成圖 (thrombogram)。野生型(虛線)、Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val (實心正方形)、 Asp519Ala(空心圓)、Asp519Val (實心圓)、Glu665Ala(空心三角形)、Glu665Val (實心三 角形)、Glul984Ala (空心菱形)和Glul984Val (實心菱形)。圖4D圖解由凝血酶生成測定 所獲得的參數值。凝血酶生成測定如所附的實施例中所描述地進行。凝血酶生成圖顯示三 次重復樣品的平均值。參數值表達為相對于野生型的值(％ )。野生型的實際值為7. 5士0. 5 分鐘(滯后時間)、13. 7士0. 3 分鐘(峰時間)、157. 3士 14. 7nM(峰值),979. 8士37. 9nM/ 分鐘(ETP)。顯示了滯后時間(空心柱)、峰時間(灰色柱)、峰值(實心柱)和ETP(線紋 柱)。誤差線顯示由三次獨立的測定進行平均的標準偏差的值。圖5A-B圖解野生型和突變體因子VIII的活性衰退。在不同的溫度(52_60°C )下 孵育因子VIII(4nM)并在所指示的時間取出等分試樣并通過如所附的實施例中所描述的 因子Xa生成測定來測定活性。通過非線性最小二乘回歸擬合數據，獲得衰退速率。每個點 代表由三次獨立的測定平均的值。顯示了野生型(虛線，交叉符號)、Glu272Ala(空心正方 形)、Glu272Val (實心正方形)、Asp519Ala (空心圓)、Asp519Val (實心圓)、Glu665Ala (空 心三角形)、Glu665Val (實心三角形)、Glul984Ala (空心菱形)、Glul984Val (實心菱形) 和全長的Kogenate因子VIII (灰色圓)的結果。圖5A圖解在55°C孵育后代表性的因子 VIII衰退曲線。圖5B圖解在不同溫度下的因子VIII衰退速率的曲線。圖5B中的插圖為 在52-55°C的溫度范圍內的衰退結果的放大。圖6為圖解在37°C下血漿中的因子VIII的活性衰退的圖。在缺乏因子VIII的 血漿中在37°C下孵育因子VIII (InM)并在所指示的時間取出等分試樣并進行如所附的實 施例中所描述的一期凝集測定。顯示了野生型(虛線，交叉符號)、Asp519Ala(空心圓)、 Asp519Val (實心圓)、Glu665Ala (空心三角形)、Glu665Val (實心三角形)、Glul984Ala (空 心菱形)和Glul984Val (實心菱形)的結果。通過非線性最小二乘回歸擬合數據，并且每 個點代表由三次獨立的測定平均的值。圖7A-B為圖解在不存在或存在因子IXa的條件下野生型和突變體因子VIIIa的 活性衰退的圖。圖7A顯示在23°C下孵育的凝血酶激活的因子VIIIa(4nM)。在所指示的 時間點取出等分試樣并通過如所附的實施例中所描述的因子Xa生成測定來測量活性。圖 7B顯示在存在IXa的條件下野生型和突變體因子VIIIa的活性衰退。在存在40nM因子 IXa的條件下用凝血酶激活因子VIII (4nM)。在所指示的時間點取出等分試樣并通過如所附的實施例中所描述的因子Xa生成測定來測量活性。顯示了野生型(虛線，交叉符號)、 Glu272Ala(空心正方形)、Glu272Val (實心正方形)、Asp519Ala(空心圓)、Asp519Val (實 心圓)、Glu665Ala (空心三角形)、Glu665Val (實心三角形)、Glul984Ala(空心菱形)和 Glul984Val (實心菱形)的結果。通過非線性最小二乘回歸擬合數據，并且每個點代表由三 次獨立的測定平均的值。圖8為圖解將Asp519、Glu665和/或Glul984殘基變為Ala或Val的因子VIII 雙組合突變體或三組合突變體的比活的圖。使用如實施例中所描述的一期凝集測定(灰色 柱)和二期發色因子Xa生成測定(黑色柱)測定活性值。誤差線顯示由三次獨立的測定 進行平均的標準偏差值。圖9為圖解野生型因子VIII和將Asp519、Glu665和/或Glul984殘基變為Ala 或Val的因子VIII雙組合突變體或三組合突變體的因子VIII活性衰退速率的圖。如實施 例中所描述的，進行因子VIII活性衰退實驗并通過非線性最小二乘回歸評估衰退速率。灰 色柱顯示相對于最佳單突變體的速率(參見實施例5，圖5A)并其通過除以最佳(最低)的 速率值計算。例如，最佳單突變體D519AE665A對的速率相對值等于D519AE665A的衰退速 率除以D519A的衰退速率。黑色柱顯示表示為10倍的實際衰退速率參數值。圖10為圖解野生型因子VIII和將Asp519、Glu665和/或Glul984殘基變為Ala 或Val的因子VIII雙組合突變體或三組合突變體的因子VIIIa活性衰退速率的圖。如實 施例中所描述的，在不存在因子IXa的條件下孵育1. 5nM因子VIIIa后進行因子VIIIa活 性衰退測量并且通過非線性最小二乘回歸評估了衰退速率。灰色柱顯示相對于最佳單突變 體的速率(參見實施例7，圖7A)，并且其如圖9的說明中所描述的計算。黑色柱顯示表示 為10倍的實際衰退速率參數值。圖IlA-B圖解使用組合突變體的凝血酶生成測定的結果。圖IlA顯示因子VIII蛋 白的凝血酶生成圖。凝血酶生成測定如實施例中所描述的進行。試劑的終濃度為0. 2nM(因 子 VIII)、0. 5pM(rTF)、4 μ M(PSPCPE 囊泡)、433 μ M(熒光底物)、13. 3mM CalClJP 105nM (凝 血酶校準物)。顯示了野生型(虛線)、D519AE665V(空心圓)、D519VE665V(實心圓)、 D519VE1984A(空心三角形)和D519VE665VE1984A(實心三角形)的結果。圖IlB顯示由凝 血酶生成測定所獲得的參數值。凝血酶生成圖顯示三次重復樣品的平均值。參數值表達為 相對于野生型的值(％)。野生型的實際值為8. 5士0.4分鐘(滯后時間)、21.3士0.6分鐘 (峰時間)>58. 5士 15. 6nM(峰值),883. 6士 199. 8nM/分鐘(ETP)。滯后時間(空心柱)、峰 時間(灰色柱)、峰值(實心柱)和ETP(線紋柱)。誤差線顯示由三次獨立的測定進行平 均的標準偏差值。圖12A-C圖解與Glull3Ala突變的組合的在殘基Asp519、Glu665和/或Glul984 處的Ala或Val突變體的因子VIII和因子VIIIa的相對于野生型的比活和活性衰退速率。 圖12A顯示使用如實施例中所描述的一期凝集測定(灰色柱)和二期發色因子Xa生成測 定(黑色柱)所測定的組合突變體相對于野生型的比活。誤差線顯示由三次獨立的測定進 行平均的標準偏差值。圖12B顯示在55°C下的因子VIII活性衰退測定的結果，衰退速率通 過如實施例中所描述的非線性最小二乘回歸評估。圖12C顯示在不存在因子IXa的條件下 孵育1. 5nM因子VIIIa后進行的因子VIIIa活性衰退測量的結果，并且衰退速率通過如實 施例中所描述的非線性最小二乘回歸評估。
發明詳述本發明涉及重組因子VIII，所述重組因子VIII具有導致因子VIII和因子VIIIa 兩者的穩定性增強的一種或多種突變。本發明的重組因子VIII可以通過修飾野生型因子VIII或突變體因子VIII的氨 基酸序列來制備，所述突變體因子VIII已被另外修飾以影響因子VIII的其他特性，如抗原 性、循環半衰期、蛋白分泌、對因子IXa和/或因子X的親和力、改變的因子VIII滅活裂解 位點、免疫原性、架存期等。可以根據本發明被修飾的合適的野生型因子VIII可以來自多種動物，包括但不 限于哺乳動物，如人(參見，例如GenBank登錄號AAA52484(氨基酸)和K01740(核苷 酸)；和GenBank登錄號CAD97566 (氨基酸)和ΑΧ746360(核苷酸)，通過引用將它們整體 并入本文)、大鼠(參見，例如，GenBank登錄號AAQ21580(氨基酸)和AY362193 (核苷酸)， 通過引用將它們整體并入本文)、小鼠(參見，例如，GenBank登錄號AAA37385(氨基酸)和 L05573(核苷酸)，通過引用將它們整體并入本文)、豚鼠、狗(參見，例如，GenBank登錄號 AAB87412 (氨基酸)和AF016234 (核苷酸)；以及GenBank登錄號AAC05384 (氨基酸)和 AF049489(核苷酸)，通過引用將它們整體并入本文)、貓、猴、黑猩猩(參見，例如GenBank 登錄號XP 529212(氨基酸和XM 529212 (核苷酸)，通過引用將它們整體并入本文)、猩猩、 牛、馬、綿羊、豬(參見，例如GenBank登錄號NP_999332(氨基酸)和NM_214167 (核苷酸)， 通過引用將它們整體并入本文)、山羊、兔和雞。這些和其他序列還可以經由血友病A突變、 結構、測試和資源網站(或HAMSTeRS)以電子方式獲得，該網站還提供人、豬、鼠和犬的因子 VIII蛋白的比對。因此，哺乳動物因子VIII蛋白的保守性和同源性是熟知的。舉例來說，人因子VIII cDNA核苷酸和預測的氨基酸序列分別以SEQID NO :1和2 顯示在下面。人因子VIII是作為約300kDa的單鏈蛋白合成的，它具有定義“結構域”序列 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H的內在序列同源性。在因子VIII分子中，如本文所用的“結構 域”為通過內在氨基酸序列同一性和凝血酶的蛋白裂解位點定義的連續的氨基酸序列。除 非另外指明，否則在與人氨基酸序列(SEQ ID NO 2)比對時，因子VIII結構域包含下列氨 基酸殘基Al，殘基 Ala1-Arg372 ；A2，殘基 Ser373-Arg740 ；B,殘基 Ser741-Arg1648 ；A3，殘基 Ser169tl-Ile2032 ；
Cl，殘基 Ar&Q33-Asn2172 ；以及C2，殘基 Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包含殘基Ser169tl-Tyr2332。剩余的序列殘基Glu1649-Arg1689通常被稱 為因子VIII輕鏈激活肽。因子VIII被凝血酶或因子Xa激活，凝血酶或因子Xa將它從馮 維勒布蘭德因子解離形成因子Villa，因子VIIIa具有促凝血功能。因子VIIIa的生物學 功能是通過幾級放大來增加因子IXa對因子X激活的催化效力。凝血酶激活的因子VIIIa 為160kDa的A1/A2/A3-C1-C2異源三聚體，它與因子IXa和因子X在血小板或單核細胞的 表面上形成復合體。如本文所用的“部分結構域”是形成結構域的部分的連續氨基酸序列。編碼野生型人因子VIII的基因具有如下的SEQ ID NO=I的核苷酸序列
gccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagc
ttctcccagaattcaagacaccctagcactaggcaaaagcaatttaatgccaccacaattccagaaaatgacatagagaagactgacccttggtttgcacacagaacacctatgcctaaaatacaaaatgtctcctctagtgatttgttgatgctcttgcgacagagtcctactccacatgggctatccttatctgatctccaagaagccaaatatgagactttttctgatgatccatcacctggagcaatagacagtaataacagcctgtctgaaatgacacacttcaggccacagctccatcacagtggggacatggtatttacccctgagtcaggcctccaattaagattaaatgagaaactggggacaactgcagcaacagagttgaagaaacttgatttcaaagtttctagtacatcaaataatctgatttcaacaattccatcagacaatttggcagcaggtactgataatacaagttccttaggacccccaagtatgccagttcattatgatagtcaattagataccactctatttggcaaaaagtcatctccccttactgagtctggtggacctctgagcttgagtgaagaaaataatgattcaaagttgttagaatcaggtttaatgaatagccaagaaagttcatggggaaaaaatgtatcgtcaacagagagtggtaggttatttaaagggaaaagagctcatggacctgctttgttgactaaagataatgccttattcaaagttagcatctctttgttaaagacaaacaaaacttccaataattcagcaactaatagaaagactcacattgatggcccatcattattaattgagaatagtccatcagtctggcaaaatatattagaaagtgacactgagtttaaaaaagtgacacctttgattcatgacagaatgcttatggacaaaaatgctacagctttgaggctaaatcatatgtcaaataaaactacttcatcaaaaaacatggaaatggtccaacagaaaaaagagggccccattccaccagatgcacaaaatccagatatgtcgttctttaagatgctattcttgccagaatcagcaaggtggatacaaaggactcatggaaagaactctctgaactctgggcaaggccccagtccaaagcaattagtatccttaggaccagaaaaatctgtggaaggtcagaatttcttgtctgagaaaaacaaagtggtagtaggaaagggtgaatttacaaaggacgtaggactcaaagagatggtttttccaagcagcagaaacctatttcttactaacttggataatttacatgaaaataatacacacaatcaagaaaaaaaaattcaggaagaaatagaaaagaaggaaacattaatccaagagaatgtagttttgcctcagatacatacagtgactggcactaagaatttcatgaagaaccttttcttactgagcactaggcaaaatgtagaaggttcatatgacggggcatatgctccagtacttcaagattttaggtcattaaatgattcaacaaatagaacaaagaaacacacagctcatttctcaaaaaaaggggaggaagaaaacttggaaggcttgggaaatcaaaccaagcaaattgtagagaaatatgcatgcaccacaaggatatctcctaatacaagccagcagaattttgtcacgcaacgtagtaagagagctttgaaacaattcagactcccactagaagaaacagaacttgaaaaaaggataattgtggatgacacctcaacccagtggtccaaaaacatgaaacatttgaccccgagcaccctcacacagatagactacaatgagaaggagaaaggggccattactcagtctcccttatcagattgccttacgaggagtcatagcatccctcaagcaaatagatctccattacccattgcaaaggtatcatcatttccatctattagacctatatatctgaccagggtcctattccaagacaactcttctcatcttccagcagcatcttatagaaagaaagattctggggtccaagaaagcagtcatttcttacaaggagccaaaaaaaataacctttctttagccattctaaccttggagatgactggtgatcaaagagaggttggctccctggggacaagtgccacaaattcagtcacatacaagaaagttgagaacactgttctcccgaaa
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ccagacttgcccaaaacatctggcaaagttgaattgcttccaaaagttcacatttatcagaaggacctattccctacggaaactagcaatgggtctcctggccatctggatctcgtggaagggagccttcttcagggaacagagggagcgattaagtggaatgaagcaaacagacctggaaaagttccctttctgagagtagcaacagaaagctctgcaaagactccctccaagctattggatcctcttgcttgggataaccactatggtactcagataccaaaagaagagtggaaatcccaagagaagtcaccagaaaaaacagcttttaagaaaaaggataccattttgtccctgaacgcttgtgaaagcaatcatgcaatagcagcaataaatgagggacaaaataagcccgaaatagaagtcacctgggcaaagcaaggtaggactgaaaggctgtgctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtg
aataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga由SEQ ID NO 1編碼的野生型人因子VIII具有如下的SEQ ID NO 2的氨基酸序 列ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTVHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASL E ISPITFLTAQTLLM D LGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVED GPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYE DTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYEGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTffAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEV
EDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVF TVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY在上面的序列中，通過粗體和下劃線標記了幾個帶電荷的殘基，包括Glu287、 Asp302、Asp519、Glu665 和 Glul984。本發明的重組因子VIII由在A1A2或A2A3結構域界面的任一個或兩個的一個或 多個帶電荷氨基酸殘基被疏水性氨基酸殘基取代來表征。優選地，被取代的帶電荷的殘基 為不參與A1A2結構域之間或A2A3結構域之間的氫鍵鍵合的Glu或Asp殘基。取代帶電 荷的殘基的疏水性氨基酸殘基可以為Ala、Val, lie、Leu、Met、Phe或Trp的任一種。本發 明的特別優選的重組因子VIII包括野生型因子VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子 VIII的Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的 Glu665殘基的取代、野生型因子VIII的Glul984殘基的取代或它們的組合。D302A、E287A、 E665A、E665V、D519A、D519V、E1984A 和 E1984V 取代對于實現因子 VIII 和因子 VIIIa 二者的 穩定性增強的重組因子VIII是優選的。這些取代的優選組合包括但不限于D519AE665V、 D519VE665V 和 D519VE1984A 雙突變體、以及 D519AE665VE1984A 和 D519VE665VE1984A 三突 變體。認為這些突變體的增強的穩定性是通過與野生型因子VIIIa相比穩定因子VIII中 的結構域間界面以及降低A2亞基從A1/A3C1C2解離來達成的。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII序列還可以包括任何先前已知 的或隨后被鑒定的突變體因子VIII序列，所述突變體因子VIII序列具有關于多種屬性的 被修飾的特性，包括但不限于抗原性、循環半衰期、蛋白分泌、對因子IXa和/或因子X的 親和力、改變的因子VIII滅活裂解位點、因子VIIIa的增強的比活、免疫原性和架存期。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的一個實例為具有修飾的鈣結 合位點，優選在SEQ ID NO :2的殘基113處的因子VIII。這提供具有增強的比活的因子 VIIIa0這種類型的示例性突變體描述在授予Fay等人的美國專利申請公布第10/581,471 號中，通過引用將其整體并入本文。優選地，還根據一種或多種上文所描述的突變(例如， 在位置287、302、519、665和/或1984)修飾殘基113突變體以提供高穩定性/高比活的 因子VIII蛋白。示例性的高穩定性/高比活的因子VIII蛋白包括但不限于具有組合的 E113AD519A、E113AD519V、E113AE665A、E113AE665V或E113AE1984V 取代的那些。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第二個實例為含有SEQ ID NO 2的氨基酸殘基1-740和1690-2332的無B結構域的因子VIII (參見，例如授予Lollar 的美國專利第6，458，563號，通過引用將其整體并入本文)。在本發明的無B結構域的重組因子VIII的一個實施方式中，B-結構域被DNA接
16頭區段取代，并且至少一個密碼子被編碼與豬的因子VIII的相應殘基具有相同電荷的氨 基酸殘基的密碼子取代(參見，例如授予Hauser等人的美國專利申請公布第2004/0197875 號，通過引用將其整體并入本文)。在本發明的無B結構域重組因子VIII的另一實施方式中，修飾的突變體因子VIII 被具有插入一個或多個位點的截短的因子IX內含子1的核苷酸序列編碼(參見，例如授予 Negrier的美國專利第6，800，461號和授予Negrier的美國專利第6，780，614號，通過引用 將他們每一個整體并入本文)。這種重組因子VIII可用于體外產生較高產率的重組因子 VIII和用于基因治療的轉移載體中(參見，例如授予Negrier的美國專利第6，800，461號， 通過引用將其整體并入)。在此實施方式的具體實例中，重組因子VIII可以被具有插入兩 個位點的截斷的因子IX內含子1并且具有適于在造血細胞系、并且尤其是在血小板中驅動 表達的啟動子的核苷酸序列編碼(參見，例如授予Negrier的美國專利第6，780，614號，通 過引用將其整體并入本文)。無論實施方式如何，無B結構域的因子VIII優選含有一種或多種上文所述的突變 (例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。根據本文的實施例所制備的重組因子VIII 蛋白為無B結構域的。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第三個實例為含有一個或多 個動物氨基酸殘基作為負責人因子VIII的抗原性的人氨基酸殘基的取代的嵌合的人/動 物因子VIII。具體地，動物(例如，豬)殘基取代可以包括但不限于下列的一種或多種 R484A、R488G、P485A、L486S、Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、 P492L、P492A、K493A、G494S、V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、 I503M、L504M、P505A、G506A、E507G、I508M、I508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、 K2227E和/或L2251 (授予Lollar的美國專利第5，859，204號、授予Lollar的美國專利 第6，770，744號和授予Lollar的美國專利申請公布第2003/0166536號，通過引用將它們 每一個整體并入本文)。優選地，重組嵌合因子VIII含有一種或多種上文所述的突變(例 如，在位置 287、302、519、665 和 / 或 1984)。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第四個實例為以下的增強的 親和力的因子 VIII 因子 IXa(參見，例如 Fay 等人，“Factor VIIIaA2 Subunit Residues 558-565R印resent a Factor IXa Interactive Site (因子 Villa A2 亞基殘基 558-565 代表因子 IXa 的相互作用位點)，”J. Biol. Chem. 269(32) =20522-7(1994) ；Bajaj 等人， "Factor IXa :Factor Villa Interaction. Helix 330_338of Factor IXa Interacts with Residues 558_565and SpatiallyAdjacent Regions of the A2 Subunit of Factor Villa (因子IXa 因子Villa相互作用。因子IXa的螺旋330-338與因子VIIIa的A2亞 基的殘基 558-565 和空間鄰近區相互作用)，”J. Biol. Chem. 276(19) =16302-9(2001)； 禾口 Lenting 等人"The Sequence Glu 1811-Lys 1818 of Human Blood Coagulation FactorVIII Comprises a Binding Site for Activated Factor IX(人血凝血因子 VIII 的序列Glul811-Lysl818包含激活的因子IX的結合位點)，”J. Biol. Chem. 271(4) 1935-40(1996)，通過引用將它們每一個整體并入本文)和/或因子X(參見，例如Lapan 等人，"Localization of a Factor X Interactive Site in theAl Subunit of Factor Villa(因子Villa的Al亞基中的因子X相互作用位點的定位)，” J. Biol. Chem. 272 2082-88(1997)，通過引用將其整體并入本文)。優選地，親和力增強的因子VIII含有一種 或多種上文所述的突變(例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第五個實例為被修飾以增強 因子VIII的分泌的因子VIII (參見，例如Swaroop等人，“Mutagenesis of a Potential Immunoglobulin-Binding Protein-Binding SiteEnhances Secretion of Coagulation Factor VIII (可能的免疫球蛋白-結合蛋白-結合位點的誘變增強凝血因子VIII的分 泌)，”J. Biol. Chem. 272(39) :24121_4 (1997)，通過引用將其整體并入本文)。優選地，分 泌增強的突變體因子VIII含有一種或多種上文所鑒定的突變(例如，在位置287、302、519、 665 和 / 或 1984)。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第六個實例為具有增加 的循環半衰期的因子VIII。這種修飾可以使用多種方法制備，包括但不限于通過降 低與下列物質的相互作用硫酸乙酰肝素(Sarafanov等人，“ Ce 11 Surface Heparan Sulfate Proteoglycans Participate in Factor VlIICatabolism Mediated by Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(細胞表面酸乙酰月干素蛋白聚糖參 與低密度脂蛋白受體相關蛋白介導的因子VIII的分解代謝)，”J. Biol. Chem. 276(15) 11970-9(2001)，通過引用將其整體并入本文)和/或低密度脂蛋白受體相關的蛋白 ("LRP，，)(Saenko 等 人，“Role of the Low Density Lipoprotein-Related Protein Receptor inMediation of Factor VIII Catabolism(低密度脂蛋白相關蛋白的受體在介 導因子 VIII 分解代謝中的作用)，”J. Biol. Chem. 274(53) :37685_92 (1999)；以及Lenting 等人，"The Light Chain of Factor VIII Comprises a Binding Site for Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein(因子VIII的輕鏈包含低密度脂蛋白受體相關 蛋白的結合位點)，” J. Biol. Chem. 274(34) :23734_9 (1999)，通過引用將他們每一個整體 并入本文)。優選地，半衰期增強的突變體因子VIII含有一種或多種上文所述的突變(例 如，在位置 287、302、519、665 和 / 或 1984)。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第七個實例為由以下核苷 酸序列編碼的修飾的因子VIII，該核苷酸序列經過修飾編碼在已知的現有的表位中的氨 基酸以在天冬酰胺殘基處產生糖基化的識別序列(參見，例如授予Lollar的美國專利第 6，759，216號，通過引用將其整體并入本文)。此實例的突變體因子VIII可用于提供逃離 存在的抑制抗體檢測(低抗原性因子VIII)和降低發展抑制抗體的可能(低免疫原性因子 VIII)的修飾的因子VIII。在這個實例的一個具體的實施方式中，修飾的因子VIII被突變 為具有N-連接的糖基化的共有氨基酸序列。這種共有序列的實例為N-X-S/T，其中N為天 冬酰胺，X為任一氨基酸，并且S/T代表絲氨酸或蘇氨酸(參見授予Lollar的美國專利第 6，759，216號，通過引用將其整體并入本文)。優選地，糖基化位點被修飾的因子VIII含有 一種或多種上文所鑒定的突變(例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。可以根據本發明被修飾的合適的突變體因子VIII的第八個實例為修飾的因 子VIII，該修飾的因子VIII為具有多種突變的促凝血活性的因子VIII (參見，例如授予 Kaufman等人的美國專利申請公布第2004/0092442號，通過引用將其整體并入本文)。這 種實施方式的一個實例涉及被進行如下修飾的修飾的因子VIII :(i)缺失馮維勒布蘭德因 子結合位點；(ii)在Arg 740處添加突變；和(iii)在A2和A3結構域之間添加氨基酸序列間隔區，其中所述氨基酸間隔區具有足以在激活后使促凝血活性因子VIII蛋白變為異 源二聚體的長度(參見授予Kaufman等人的美國專利申請公部第2004/0092442號，通過引 用將其整體并入本文)。優選地，促凝血活性的因子VIII還被修飾以含有一種或多種上文 所述的突變(例如，在位置287、302、519、665和/或1984)。此外，突變體因子VIII可以被修飾以具有通常關于重組凝血因子的多種優勢(參 見，例如 Saenko 等人,"The Future of Recombinant CoagulationFactors (重組凝血因子 的前景)，” J. Thrombosis and Haemostasis 1 :922_930 (2003)，通過引用將其整體并入本 文)。本發明的重組因子VIII可以在使A1A2或A2A3結構域界面不穩定的任何帶電荷 的殘基(包括位置87、302、519、665或1984)處被修飾；以及被修飾為無B結構域、嵌合的、 具有增強因子VIIIa活性的修飾的鈣結合位點(例如，在位置113處)、具有改變的滅活裂 解位點、具有增強的因子IXa和/或因子X親和力、具有增強的分泌、具有增加的循環半衰 期、或具有突變體糖基化位點；或除對帶電荷的殘基的一個或多個修飾外再進行任何一種 或多種此類修飾，包括改善重組因子VIII的活性的修飾的鈣結合位點。實施例中描述了許 多示例性的無B結構域、比活增強、高穩定性的重組因子VIII蛋白。重組因子VIII優選以基本上純的形式制備。在具體的實施方式中，基本上純的重 組因子VIII為至少約80%純的，更優選至少90%純的，最優選至少95%純的。基本上純的 重組因子VIII可以通過本領域內熟知的常規技術獲得。通常，基本上純的重組因子VIII 是被分泌到重組宿主細胞的生長培養基中的。可選擇地，制備了基本上純的重組因子VIII， 但是其并不分泌到生長培養基中。在這種情況下，為了分離基本上純的重組因子VIII，繁殖 攜帶重組質粒的宿主細胞，通過超聲、加熱或化學處理將其裂解，并將勻漿物離心以去除細 胞碎片。然后對上清液進行硫酸銨分級沉淀。將含有基本上純的重組因子VIII的級分在 合適尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中進行凝膠過濾以分離重組因子VIII。如果需要，蛋白 級分(含有基本上純的重組因子VIII)可以進一步通過高效液相色譜(“HPLC”)來純化。本發明的另一方面涉及編碼本發明的重組因子VIII的分離的核酸分子。編碼重 組因子VIII的分離的核酸分子可以為RNA或DNA。在一個實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼增強因子VIII的比活的位置 113處的突變，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如，在SEQ ID N0:2的位 置287、302、519、665、1984和/或332-340)修飾的核苷酸序列。在另一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼上文所述類型的無B結構域因 子VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如，在SEQ ID NO :2的位置287、 302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在另一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼上文所述類型的嵌合的人/豬 因子VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如，在SEQ ID N0:2的位置 287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在另一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼滅活位點被如上文所述修飾的 因子VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如，在SEQ ID N0:2的位置 287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在又一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼對因子IXa和/或因子X的親
19和力增強了的因子VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如，在SEQ ID NO 2的位置287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在再一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼對多種血清結合蛋白的親和力 被改變以增加其循環半衰期的因子VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種 (例如，在SEQ ID NO 2的位置287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在另一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼在培養物中分泌增加的因子 VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如，在SEQ ID NO :2的位置287、 302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在另一實施方式中，分離的核酸分子可以具有編碼具有一個或多個非天然存在的 糖基化位點的因子VIII，同時還被帶電荷的殘基的取代中的一種或多種(例如在SEQ ID NO 2的位置287、302、519、665和/或1984)修飾的核苷酸序列。在又一實施方式中，分離的核酸分子編碼在任何一個或多個如上文所描述的帶電 荷的殘基處被修飾并且還被修飾以具有下列的任何兩個或更多個的分離的核酸分子被修 飾為無B結構域、被修飾為嵌合的、被修飾為具有改變的滅活裂解位點、被修飾為具有增強 的因子IXa和/或因子X親和力、被修飾為具有增強的分泌、被修飾為具有增加的循環半衰 期、被修飾為具有一個或多個非天然存在的糖基化位點、以及在鈣結合位點內(例如，在位 置113)被修飾以便改善重組因子VIII的比活。本發明的另一方面涉及包含本發明的分離的DNA分子的重組DNA表達系統，該表 達系統編碼重組因子VIII。在一個實施方式中，DNA分子相對于啟動子在有義方向上。本發明的另一方面涉及包含編碼本發明的重組因子VIII的分離的核酸分子的宿 主細胞。在具體的實施方式中，宿主細胞可以含有DNA分子形式的分離的核酸分子，所述 DNA分子形式為穩定的質粒或在宿主細胞基因組中的穩定的插入序列或整合序列。在另一 實施方式中，宿主細胞可以含有在表達系統中的DNA分子。合適的宿主細胞可以為但不限 于動物細胞(例如，幼倉鼠腎(“BHK”)細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌(E. coli))、昆 蟲細胞(例如，Sf9細胞)、真菌細胞、酵母細胞(例如，酵母菌(Saccharomyces)或裂殖酵母 屬(Schizosaccharomyces))、植物細胞(例如，擬南芥(Arabidopsis)細胞或煙草細胞)、 或藻類細胞。重組DNA表達系統和宿主細胞可以使用本領域內熟知的多種重組技術來制備，如 下文所進一步討論的。可以使用常規的重組DNA技術將編碼本發明的重組因子VIII的DNA分子整合到 細胞中。一般地，這包括將DNA分子插入到該DNA分子為異源(即，不是正常存在的)的表 達系統中。異源DNA分子以有義方向和正確的閱讀框插入表達系統或載體中。載體含有 用于插入的編碼蛋白的序列的轉錄和翻譯的必需元件。因此，本發明的一個實施方式提供 含有本發明的分離的核酸的DNA構建體，所述分離的核酸與5’啟動子和3’調節區(即，轉 錄終止子)兩者可操作連接，所述5’啟動子和3’調節區能夠使本發明的編碼的重組因子 VIII在宿主細胞或宿主生物體中轉錄和表達。關于本發明的重組表達系統，含有編碼本發明的重組因子VIII的DNA分子的表達 載體可以使用本領域內的常見技術制備。可以使用本領域內所熟知的試劑將本發明的核酸 分子插入到許多可用的表達載體的任一種中。在制備用于表達的DNA載體中，可以將DNA序
20列正常地插入到或取代到細菌質粒中。可以采用任何方便的質粒，它們的特征為具有細菌 復制系統、容許在細菌中進行選擇的標志物和方便定位的一個或多個獨特的限制位點。載 體的選擇取決于優選的轉化技術和用于轉化的靶宿主。可以采用多種宿主-載體系統來表達編碼重組因子VIII的序列。主要地，載體 系統必須與所用的宿主細胞相容。宿主-載體系統包括但不限于下列用噬菌體DNA、質粒 DNA或粘粒DNA轉化的細菌；微生物，如含酵母載體的酵母；用病毒(例如，痘苗病毒、腺病 毒、腺伴隨病毒等)感染的哺乳動物細胞系統；用病毒(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞 系統；和用細菌(例如，土壤桿菌屬(Agrobacterium))感染的植物細胞。這些載體的表達 元件在它們的強度和特異性方面不同。依據所采用的宿主-載體系統，可以使用大量合適 的轉錄和翻譯元件的任一種。當以重組方式制備時，在重組的宿主細胞中表達因子VIII蛋白或多肽(或它們的 片段或變體)，所述重組的宿主細胞通常但不排他地為真核細胞。用于實施本發明的合適的載體包括但不限于下列病毒載體，如λ載體系統 gtll、gtffES. tB、Charon 4 ；和質粒載體，如 pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、 pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-或 pBluescript II KS+/-(參見"Stratagene Cloning Systems (Stratagene 克隆系統)，， 目錄(I"3))、pQE、pIH82l、pGEX、pET 系列(Studier 等人，"Use of T7RNA Polymerase to DirectExpression of Cloned Genes (使用T7RNA聚合酶來指導克隆的基因的表 達)，”Methods in Enzymology 185 :60_89 (1990)，通過引用將其整體并入本文)；以及它 們的任何衍生物。現在已知的或今后描述的用于遺傳轉化的任何合適的載體適用于本發 明。可以經由轉化，尤其是轉導、接合、動員或電穿孔將重組分子引入細胞。使用本 領域內標準的克隆方法將DNA序列克隆到載體中，如Maniatis等人在下面文獻中所描述
Molecular Cloning :A Laboratory Manual () Cold Springs
Harbor, N. Y. =Cold Springs Laboratory, (1982)，通過引用將其整體并入本文。通過引用整體并入本文的授予Cohen和Boyer的美國專利第4，237，224號描述了 使用限制酶裂解和用DNA連接酶連接制備重組質粒形式的表達載體。然后通過轉化方法引 入這些重組質粒并在單細胞培養物中復制，所述單細胞培養物包括原核生物體和以組織培 養物生長的真核細胞。不同的遺傳信號和加工事件控制著許多水平的基因表達(例如，DNA轉錄和信使 RNA (mRNA)翻譯)。DNA轉錄依賴于啟動子的存在，所述啟動子為指導RNA聚合酶結合并從而促進 mRNA合成的DNA序列。真核啟動子的DNA序列與原核啟動子的DNA序列不同。此外，真核 啟動子和伴隨的遺傳信號在原核系統中可能不被識別或可能不起作用；并且，另外，原核啟 動子在真核細胞中不被識別并且不起作用。類似地，原核細胞中的mRNA翻譯依賴于適當的原核信號的存在，該原核信 號與真核細胞的信號不同。mRNA在原核細胞中的有效翻譯需要在mRNA上的稱為 Shine-Dalgarno ( “SD”)序列的核糖體結合位點。這個序列為位于起始密碼子前的短的 mRNA核苷酸序列，所述起始密碼子通常為AUG，它編碼蛋白氨基末端的蛋氨酸。SD序列與16S rRNA(核糖體RNA)的3’末端互補并且可能通過與rRNA形成雙鏈體來促進mRNA與 核糖體的結合從而容許核糖體正確定位。對于使基因表達最大化的綜述，參見Roberts和 Lauer, Methods in Enzymology 68 :473 (1979)，通過引用將其整體并入本文。啟動子在它們的“強度”(即，它們促進轉錄的能力)方面不同。為了表達克隆 的基因的目的，通常希望使用強啟動子以獲得高水平的轉錄和因此的高水平基因表達。依 據所采用的宿主細胞系統，可以使用大量合適的啟動子的任一種。例如，當在大腸桿菌 (Escherichia coli)中克隆時，它的噬菌體或質粒啟動子，如T7噬菌體啟動子、Iac啟動 子、trp啟動子、recA啟動子、核糖體RNA啟動子、大腸桿菌噬菌體λ的Pk啟動子和P^啟 動子以及包括但不限于lacUV5、ompF、bla、Ipp等的其他啟動子可用于指導鄰近的DNA區 段的高水平轉錄。此外，雜合的trp-lacUV5 (tac)啟動子或由重組DNA或其他合成DNA技 術所制備的其他大腸桿菌啟動子可用于提供插入的基因的轉錄。可以選擇在不特異性誘導的時候抑制啟動子作用的細菌宿主細胞株系和表達載 體。在某些操作中，特異性誘導物的添加是插入的DNA有效轉錄所必需的。例如，Iac操縱 子通過添加乳糖或IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)誘導。諸如trp、pro等的許多其 他操縱子處于不同的控制下。特異性起始信號也是原核細胞中有效的基因轉錄和翻譯所需的。如分別由合成的 基因特異性信使RNA和蛋白的量所測量的，這些轉錄和翻譯起始信號強度可以不同。含有 啟動子的DNA表達載體還可以含有多種“強”轉錄和/或翻譯起始信號的任何組合。例如， 大腸桿菌中的有效翻譯需要距起始密碼子(“ATG”)的5’端約7-9個堿基的SD序列以提 供核糖體結合位點。因此，可以采用宿主細胞核糖體可以利用的任何SD-ATG組合。這種組 合包括但不限于來自大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因或來自大腸桿菌色氨酸Ε、 D、C、B或A基因的SD-ATG組合。此外，可以使用通過重組DNA或包括整合合成的核苷酸的 其他技術制備的任何SD-ATG組合。在一個實施方式中，本發明的核酸分子以有義方向整合到合適的載體中以便使開 放閱讀框正確地確定方向以便編碼的蛋白在所選擇的啟動子的控制下表達。這包括將合適 的調節元件引入DNA-載體構建體。這些包括載體的非翻譯區、有用的啟動子和5’和3’的 非翻譯區，它們與宿主細胞蛋白相互作用以實現轉錄和翻譯。這些元件在它們的強度和特 異性方面可以不同。依據所利用的載體系統和宿主，可以使用任何數目的合適的轉錄和翻 譯元件，包括組成型的和誘導型的啟動子。組成型的啟動子為在生物體的整個發育和生命中指導基因表達的啟動子。誘導型啟動子為能夠響應于誘導物直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因 的轉錄的啟動子。在不存在誘導物的條件下，DNA序列或基因將不被轉錄。本發明的DNA構建體還可以包括可操作地連接至編碼所選擇的蛋白的DNA分子的 3’調節區，該3’調節區選自能夠提供在所選的宿主細胞中表達的正確的轉錄終止和mRNA 多聚腺苷酸化的那些。可以使用如下列文獻中所描述的熟知的分子克隆技術將所選擇的載體、啟動子 和合適的3’調節區連接在一起以制備本發明的DNA構建體=Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版，Cold Spring Harbor Press, NY (1989)；禾口 Ausubel，F. Μ.等人 Current Protocols in Molecular Biology (現代分子生物學實驗技術)，New York，N. Y John Wiley&Sons (1989)，通過引用將它們每一個 整體并入本文。如所注意到的，使用原核宿主細胞的一個替代方案為使用真核宿主細胞，如哺乳 動物細胞，真核宿主細胞也可用于重組制備本發明的重組因子VIII。適于實施本發明的哺 乳動物細胞包括，但不限于:C0S(例如，ATCCNo. CRL 1650或1651)、BHK(例如，ATCC No. CRL 6281)、CHO(例如，ATCC No. CCL 61)、HeLa(例如，ATCC No. CCL 2)、293(ATCC No. 1573)、 CHOP、和 NS-I 細胞。用于在哺乳動物細胞中指導表達的合適的表達載體通常包括啟動子以及本領域 內已知的其他轉錄和翻譯控制序列。常見的啟動子包括SV40、MMTV、金屬硫蛋白-1、腺病毒 Ela、CMV、極早期(immediate early)、免疫球蛋白重鏈啟動子和增強子和RSV-LTR。一旦制備了本發明的DNA構建體，其便可容易地被整合到宿主細胞中。因此，本發 明的另一方面涉及制備重組細胞的方法。基本地，此方法通過在有效地在宿主細胞中產生 DNA分子轉錄的條件下用本發明的DNA構建體轉化宿主細胞來進行。可以經由轉化，尤其是 轉導、接合、動員或電穿孔將重組分子引入細胞。根據本文所討論的重組技術，本發明的另一方面涉及制備本發明的重組因子VIII 的方法。此方法包括將本發明的宿主細胞在使宿主細胞表達重組因子VIII的條件下培養。 然后分離重組因子VIII。在一個實施方式中，宿主細胞在生長培養基中體外生長。在具體 的實施方式中，合適的生長培養基可以包括但不限于含有馮維勒布蘭德因子(在本文中稱 為“VWF”)的生長培養基。在這個實施方式中，宿主細胞可以含有編碼VWF的轉基因或VWF 可以作為補充物被引入生長培養基。生長培養基中的VWF將容許重組因子VIII的較高表 達水平。一旦重組因子VIII被分泌到生長培養基中，隨后便可以使用相關的重組DNA和蛋 白領域內的那些普通技術人員所熟知的技術(包括本文所描述的那些技術)將其從生長培 養基中分離。在另一實施方式中，制備本發明的重組因子VIII的方法還包括在分離重組因 子VIII之前破壞宿主細胞。在這個實施方式中，重組因子VIII是從細胞碎片中分離的。位置287、302、519、665和/或1984處的修飾是尤其優選的，因為他們導致因子 VIII和因子VIIIa兩者的穩定性增強。這種增加的穩定性對于因子VIII的循環半衰期和 血液凝集期間因子VIIIa的活性是很重要的。此外，這種特性在用于治療用途的蛋白的純 化和制備期間增強可用因子VIII的回收方面很重要。當表達載體用于體內轉化以誘導靶細胞中的因子VIII表達的目的時，可以依據 所需的增強程度采用不同強度的啟動子。本領域的技術人員可以根據哺乳動物啟動子作為 啟動子的強度而容易地選擇合適的哺乳動物啟動子。可選擇地，可以為了在需要表達或抑 制因子VIII時進行控制的目的而采用誘導型啟動子。本領域的技術人員可以從本領域內 已知的那些誘導型哺乳動物啟動子中選擇合適的啟動子。最后，可以選擇組織特異性哺乳 動物啟動子以將任何基因轉化系統的效力限制在特定的組織中。組織特異性啟動子是本領 域內已知的并且可以根據要治療的組織或細胞類型選擇。本發明的另一方面涉及治療動物的諸如血友病尤其是血友病A的血液疾患的方 法。這種方法包括給表現血友病A的動物施用有效量的本發明的重組因子VIII，從而使動 物在血管損傷后表現出有效的血液凝集。合適的有效量的重組因子VIII可以包括但不限 于約10至約50單位/千克動物體重之間。所述動物可以為任何動物，但是優選為人、大鼠、小鼠、豚鼠、狗、貓、猴、黑猩猩、猩猩、牛、馬、綿羊、豬、山羊或兔。本發明的重組因子VIII可用于在具有和不具有抑制抗體的血友病患者中和由于 抑制抗體的顯現所引起的獲得性因子VIII缺乏的患者中治療由因子VIII缺乏所致的不受 控的出血(例如，關節內、顱內或胃腸出血)。在具體的實施方式中，根據與用于人或動物 因子VIII相同的方法將單獨的重組因子VIII或藥物組合物形式(即，與穩定劑、遞送溶媒 (delivery vehicles)和/或載體組合)的重組因子VIII靜脈內輸注給患者。可選擇地，或除此之外，可以如下來施用重組因子VIII 通過施用如腺伴隨病毒 的病毒載體(Gnatenko 等人，"Human Factor VIII Can BePackaged and Functionally Expressed in an Adeno-associated VirusBackground !Applicability to Hemophilia A Gene Therapy (人因子VIII可以在腺伴隨病毒背景中被包裝并功能性表達血友病A基 因治療的適用性).”Br. J. Haematol. 104 :27_36 (1999)，通過引用將其整體并入本文)； 或通過移植遺傳工程化以制備重組因子VIII的細胞，通常經由含這種細胞的裝置進行移 植。這種移植通常包括使用重組皮膚成纖維細胞，一種非病毒方法(Roth等人，“Nonviral Transfer of the Gene Encoding Coagulation FactorVIII in Patients with Sever Hemophilia(在患重度血友病的患者中編碼凝血因子VIII的基因的非病毒轉移)."New Engl. J. Med. 344 1735-1742 (2001)，通過引用將其整體并入本文)。應施用給需要這種治療的患者的重組因子VIII的治療劑量依據因子VIII缺乏的 嚴重程度而不同。一般地，在頻率、持續時間和單位方面調節劑量水平以與各患者的出血發 作的嚴重程度和持續時間一致。因此，如標準的凝集測定所測量的，重組因子VIII以足以 遞送給患者治療有效量的蛋白以停止出血的量包含在藥物上可接受的載體、遞送溶媒或穩 定劑內。因子VIII經典地被定義為存在于正常血漿中糾正由患血友病A的個體所獲得的 血漿中的凝集缺陷的物質。純化的和部分純化的形式的因子VIII的體外促凝血活性被 用于計算輸注到人患者中的重組因子VIII的劑量并且是從患者血漿中恢復活性和體內 出血缺陷糾正的可靠指示物。根據Lusher等人，“Recombinant Factor VIII for the Treatment of Previously UntreatedPatients with Hemophilia A-Safety, Efficacy, and Development of Inhibitors (用于治療之前未被治療的患血友病A的患者的重組 因子VIII-抑制劑的安全性、效力和開發)”New Engl. J. Med. 328:453-459(1993); Pittman 等人，"A2Domain of Human Recombinant-derived Factor VIII is Required forProcoagulant Activity but not for Thrombin Cleavage (人重組衍生的因子 VIII 的A2結構域是促凝血活性所需的但不是凝血酶裂解所需的).”Blood79 =389-397(1992)； 禾口 Brinkhous 等人，"Purified Human Factor VIIIProcoagulant Protein-Comparative Hemostatic Response After Infusions intoHemophilic and von Willebrand Disease Dogs (純化的人因子VIII促凝血蛋白輸注到患血友病的狗和患馮維勒布蘭德疾病的狗中 之后的比較性止血反應)，” Proc. Natl. Acad. Sci. 82 =8752-8755 (1985)，通過引用將它們 整體并入本文，在新的因子VIII分子的體外標準測定和他們在狗輸注模型或人患者中的 行為之間沒有報道差異。通常，通過施用重組因子VIII在患者中實現的期望的血漿因子VIII活性水平在 正常的30-100%的范圍內。在一個實施方式中，治療性重組因子VIII的施用以靜脈內給予，優選的劑量在約5至50單位/kg體重的范圍內，具體在10-50單位/kg體重的范圍內， 更具體為20-40單位/kg體重的劑量；頻率間隔為約8至24小時(重度感染的血友病患 者)的范圍內；治療持續時間天數在1至10天的范圍內或直至出血發作消退。參見，例如， Roberts 禾口 Jones,"Hemophilia and Related Conditions—CongenitalDeficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)(血友病禾口相關病癥疑血 酶原(因子II、因子V和因子VII至XII)先天性的缺乏)，”Ch. 153，1453-1474，1460，in Hematology (血液學)，Williams，W. J.等人，編輯(1990)，通過引用將其整體并入本文。 具有抑制劑的患者可能需要與它們先前的因子VIII形式不同的重組因子量。例如，患者可 能需要較少的重組因子VIII，因為該重組因子VIII比野生型VIII具有更高的比活和降低 的抗體反應性。對于使用人或血漿來源的因子VIII的治療，輸注的治療性重組因子VIII 的量通過一期因子VIII凝血測定來界定，并且在選擇的情況下，通過測量在輸注后患者血 漿中的因子VIII來測定體內恢復。應了解對于任何具體的受試者，應根據個體的需要和施 用或監督組合物施用的人員的專業判斷隨時間調整特定的劑量方案，并且本文所列出的濃 度僅為示例性的，不旨在限制所要求保護的重組因子VIII的范圍或實施。根據需要，治療形式可以為重組因子VIII的單次靜脈內施用或在長期的時間階 段內的定期施用或連續施用。可選擇地，治療性重組因子VIII可以與脂質體一起以不同時 間間隔內的一個或幾個劑量皮下或口服施用。重組因子VIII還可以用于治療在顯示出人因子VIII抗體的血友病患者中由于因 子VIII缺乏所致的不受控的出血。本文證明了本發明的重組因子VIII的比活可以與野生型因子VIII不同。具有比 野生型因子VIII高的促凝血活性的因子VIII可用于治療血友病，因為將需要較低的劑量 來糾正患者的因子VIII缺乏。這不僅降低了患者和保險公司的醫療費用，還降低了發展針 對因子VIII的免疫反應的可能(因為施用了較少的抗原)。
實施例提供了下列實施例來說明本發明的實施方式，但是它們不意欲限制本發明的范圍。材料與方法試劑M^lSi VIII(Kogenate ) ^Bayer Corporation (Berkeley, CA) ^ LisaRegan 博士慷慨贈送的。含有20%磷脂酰膽堿(PC)、40%磷脂酰乙醇胺(PE)和40%磷脂酰絲氨 酸(PS)的磷脂囊泡如先前所述使用辛基葡糖苷制備(Mimms等人，“Phospholipid Vesicle Formation and TransmembraneProtein Incorporation Using Octyl Glucoside (使用辛 基葡糖苷的磷脂囊泡形成和跨膜蛋白整合)，"Biochemistry20 :833_840 (1981)，通過引用 將其整體并入本文)。試劑α-凝血酶、因子Vila、因子IXa β、因子X和因子Xa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN)、蟲至素禾口憐月旨(DiaPharma, West Chester, OH)、發 色的 Xa 底物 Pefachrome Xa (Pefa-5523，CH30C0-D-CHA-Gly-Arg-pNA · AcOH ；Centerchem Inc. Norwalk CT)、重組人組織因子(rTF)、Innovin(Dade Behring, Newark, DE)、熒光底物 Z-Gly-Gly-Arg-AMC(Calbiochem, San Diego, CA)和凝血酶校準物(Diagnostica Stago,Parsippany, NJ)購自所指示的賣主。野生型和變體因子VIII的構建、表達和純化將Ala 突變體(在 D27、H281、R282、E287、D302、S313、H317、T522、S524、R531、 N538、E540、S650、S654、D666、E683、N684、S695、D696、S1791、D1795、Q1820、E1829、S1949、 N1950 和 R1966 處)；Phe 突變體(在 Y476、Y664、Y1786 和 Y1792 處)；Ala 和 Val 突變體 (在帶電荷的殘基E272、D519、E665和E1984處)；和野生型因子VIII形式分別構建為在B 結構域中缺乏殘基Gln744-Serl637的無B結構域的因子VIII (Doering等人，“Expression and Characterization of Recombinant MurineFactor VIII (重組鼠因子 VIII 的表達禾口 表征)，”Thromb Haemost. 88 :450_458 (2002)，通過引用將其整體并入本文)。克隆和表達 構建體是Pete Lollar博士和John Healey博士慷慨贈送的。如先前所描述的在BHK細胞 中穩定地表達重組野生型和變體因子VIII形式并將其純化(Wakabayashi等人，“Residues 110-126in the A IDomain of Factor VIII Contain a Ca2+BindingSite Required for Cofactor Activity (因子VIII的Al結構域中的殘基110-126含有輔因子活性所需的Ca2+ 結合位點)，”J Biol Chem. 279 12677-12684 (2004)，通過引用將其整體并入本文)。轉染 后，變體之間因子VIII分泌的量沒有顯著差異。如通過SDS-PAGE判斷的，來自兩個750cm2 培養瓶的變體蛋白產量范圍在大于IOyg至約100 μ g，純度為約85%至大于95%。因子 VIII制劑中的主要污染物為白蛋白并且其在因子VIII中存在的濃度顯示對活性參數的穩 定性沒有影響。因子VIII的濃度使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)測量，并且因子VIII的 活性通過一期凝集測定和二期發色的因子Xa生成測定來確定，如下文所述。SDS-PAGE和蛋白質印跡將因子VIII蛋白(0.77 μ g用于凝膠染色并且0.34 μ g用于蛋白質印跡)在8% 聚丙烯酰胺凝膠上以恒定電壓(100V)電泳。將凝膠用Gelcode Blue (Thermo Scientific, Rockford, IL)染色；或將凝膠轉移到聚偏氟乙烯膜上并用生物素化的抗A2抗體(R8B 12， Green Mountain Antibodies, Burlington, VT)探測，然后用過氧化物酶軛合的鏈霉親 和素(Calbiochem，San Diego, CA)孵育。使化學發光底物(ECF 底物，GE Healthcare, Piscataway, NJ)反應，并且使用磷光影象分析儀(Storm 860，GE Healthcare)掃描熒光 信號。單鏈因子VIII形式(170kDa)和重鏈(HC，90kDa)的密度使用ImageQuant軟件(GE Healthcare)定量并且計算了量的比率。ELISA如先前所描述的進行夾心ELISA以測量因子VIII蛋白的濃度(Wakabayashi 等人，"A Glu 113Ala Mutation within a Factor VIIICa2+-Binding Site Enhances Cofactor Interactions in Factor Xase (因子 VIIICa2+結合位點內的 Glull3Ala 突變增 強因子Xase中的輔因子相互作用)，"Biochemistry 44 10298-10304(2005)，通過引用將 其整體并入本文)，使用純化的商業重組因子VIII (Kogenate，Bayer Corporation)作為標 準物。因子 VIII 的捕獲使用抗 C2 抗體(ESH-8，American Diagnostica Inc.，Stamford, CT)，并采用生物素化的R8B12抗體來進行因子VIII檢測。一期凝集測定(One-stage Clotting Assay)使用化學消除了因子VIII的基質血漿進行一期凝集測定(參見，“Methodology of the One-stage Assay of Factor VIII (VIII :C)(因子 VIII (VIII :C) 一期測定的方法)，”Scand J Haematol Suppl. 41 13-24 (1984)，通過引用將其整體并入本文)并使用 Diagnostica Stago 凝集儀器進行測定。在 37°C下用 APTT 試劑(General Diagnostics) 孵育血漿6分鐘，然后添加稀釋的因子VIII至杯皿中。1分鐘后對混合物進行復鈣，測定凝 集時間并將其與混合的正常血漿標準物比較。二期發色因子Xa生成測定根據先前所描述的方法(Wakabayashi等人，“Metal Ion-independentAssociation of Factor VIII Subunits and the Roles of Calcium and Copper Ionsfor Cofactor Activity and Inter-subunit Affinity(金屬離子非 依賴性的因子VIII亞基締合以及鈣離子和銅離子對輔因子活性和亞基間親和力的作 用),"Biochemistry 40:10293-10300(2001) ；Wakabayashi 等人，"Ca2+Bindingto Both the Heavy and Light Chains of Factor VIII Is Required for CofactorActivity (Ca2+ 與因子VIII的重鏈和輕鏈二者的結合是輔因子活性所需的)，”Bi0ChemiStry 41 8485-8492 (2002)，通過引用將它們每一個整體并入本文)，在純化的系統(Lollar等人， "Factor VIII and Factor VIIIa(因子 VIII 和因子 Villa)，”Methods Enzymol. 222 128-143 (1993)，通過引用將其整體并入本文)中監測因子X向因子Xa轉化的速率。用20nM α-凝血酶激活在含有20mM N_[2_羥乙基]哌嗪_N，-[2_乙烷磺酸](HEPES)，pH 7.2,0. IM NaCl、0. 01% 吐溫 20、0. 01% BSA、5mM CaCl2 和 10 μ M PSPCPE 囊泡的緩沖液(緩沖液 Α)中 的因子VIII (InM)I分鐘。通過添加蛭素(10U/ml)來終止反應并使所得的因子VIIIa與因 子IXa(40nM)反應1分鐘。添加因子X(300nM)以開始反應，1分鐘后通過添加50mM EDTA 來淬滅反應。與發色底物Pefachrome Xa(0. 46mM的終濃度)反應后測定生成的因子Xa。 所有反應都在23°C下進行。凝血酶生成測定血漿中生成的凝血酶的量通過自動校準的凝血酶生成圖象法測量(Hemker等人， “Calibrated Automated Thrombin Generation Measurement inClotting Plasma(凝集 的血漿中自動校準的凝血酶生成測量),” PathophysiolHaemost Thromb. 33 4-15(2003)； Hemker 等人，"Thrombin Generation inPlasma :Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential (血漿中的凝血酶生成經由內源凝血酶潛能的凝血酶生成評 估)，” Thromb Haemost. 74 134-138 (1995)，通過引用將他們每一個整體并入本文)。在 96孔板中，將來自缺乏因子VIII抑制劑的重度血友病A患者的80 μ 1缺乏因子VIII (小 于 的殘余活性，血小板貧乏)的血漿(George King Bio-Medical, OverlandPark, KS) 與在含有下列物質的 HEPES-BSA 緩沖液(20mM HEPES, pH7. 35、0. 15M NaCl,6% BSA)中的 因子VIII樣品(20 μ 1 ；6ηΜ)混合3pMrTF(rTF儲液的濃度通過因子Xa生成測定使用已 知濃度的因子VIIa測定)、PSPCPE囊泡(24 μ M)，或與20 μ 1凝血酶校準物(630ηΜ)混 合，并且立即通過與在含有0. IM CaCl2的HEPES-BSA緩沖液中的20 μ 1熒光底物(2. 5mM, Z-Gly-Gly-Arg-AMC)混合來開始反應。在37°C下將所有試劑預熱。試劑的終濃度為 InM因子VIII (除非另外指明)、0· 5pM rTF、4 μ MPSPCPE囊泡、433 μ M熒光底物、13. 3mM CalCl2和105nM凝血酶校準物。使用微板熒光分光光度計(Spetramax Gemini,Molecular Devices, Sunnyvale, CA)用355nm(激發)/460nm(發射)的濾光設置以8秒鐘的間隔監 測37°C下的熒光信號的顯現。熒光信號通過來自熒光酶校準物樣品的參考信號來校正
27(Hemker 等人，"Calibrated Automated ThrombinGeneration Measurement in Clotting Plasma (凝集的血漿中自動校準的凝血酶生成測量)，"Pathophysiol Haemost Thromb. 33 4-15 (2003)，通過引用將他們每一個整體并入本文)并且如先前所述計算以nM表示的實 際凝血酶生成(Hemker 等人，"Thrombin Generation in Plasma :Its Assessment via theEndogenous Thrombin Potential (血漿中的凝血酶生成經由內源凝血酶潛能的凝血 酶生成評估)，” Thromb Haemost. 74 134-138 (1995)，通過引用將其整體并入本文。在較高的溫度下的因子VIII活性在52_60°C下孵育在緩沖液A中的野生型因子VIII或因子VIII變體(4nM)。在所 指示的時間取出等分試樣并使用二期發色因子Xa生成測定來測定殘余的因子VIII活性。因子VIIIa活性的時程在23°C下用20nM凝血酶激活在含有10 μ M PSPCPE囊泡的緩沖液A中的野生型和 突變體因子VIII(4nM)l分鐘。立即用蛭素(10U/ml)淬滅反應，在所指示的時間取出等分 試樣并在添加因子IXa(40nM)和因子X(300nM)后使用因子Xa生成測定來測定活性。對于 在存在因子IXa的條件下進行的衰退測量，在添加凝血酶之前將因子IXa(40nM)添加至反 應物中。血漿中的因子VIII穩定性將野生型或變體因子VIII (InM)添加到來自缺乏因子VIII抑制劑的重度血友病 A患者的缺乏因子VIII (小于的殘余活性)的血漿(GeorgeKing Bio-Medical)中。對 血漿補充0. 02% NaN3以防止微生物的生長，并在37°C下孵育樣品。在所指示的時間取出 等分試樣并使用一期凝集測定來測定殘余的活性。數據分析通過非線性最小二乘回歸使用如下的等式將因子VIIIa的活性值作為時間的函 數與單指數衰退曲線擬合A = A0Xe^klt其中A為殘余的因子VIIIa活性(nM/分鐘/nM因子VIII)，A0為初始活性，k為 表觀速率常數，并且t為在較高的溫度下因子VIII的反應時間(分鐘)(對于因子VIII 衰退實驗)或在淬滅凝血酶激活后的反應時間(分鐘)(對于因子VIIIa衰退測量)。通 過Kaleidagraph (Synergy，Reading, PA)進行非線性最小二乘回歸分析。通過Student t 檢驗進行平均值的比較。使用Swiss PDB Viewer分析了因子VIII A結構域的模制結構 (Pemberton等人,“A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIIIBased on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin(基于人血菜銅藍蛋白 的晶體結構的人因子VIII的三個A結構域的分子模型)，”Blood89 =2413-2421 (1997)， 通過引用將其整體并入本文)以鑒定定位在A2結構域界面的帶電荷的殘基和根據分離 互補結構域的極性原子的大于2.8人的閾值顯示出極小的氫鍵相互作用可能的帶電荷 的殘基(Weiner 等人，"ANew Force Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic AcidsProteins(核酸蛋白的分子機械模擬的新力場)，”J Am Chem Soc. 106 765-784(1984)，通過引用將其整體并入本文)。實施例1 靶向氫鍵相互作用的因子VIII突變體的活性值目前仍然不夠了解的涉及因子VIII中的A2結構域的鍵合相互作用代表了調節輔因子活性的主要機制。因子VIII同源性模型(Pemberton等人，“A Molecular Model for the Triplicated A Domains of Human Factor VIIIBased on the Crystal Structure of Human Ceruloplasmin (基于人血漿銅藍蛋白的晶體結構的人因子VIII的三個A結構 域的分子模型)，"Blood89 :2413-2421 (1997)，通過引用將其整體并入本文)鑒定了許多氫 鍵連接A2結構域中的殘基與Al或A3結構域中的那些殘基的可能。使用氫供體和受體原 子之間的空間間隔小于2.8人這一標準(Weiner等人，“A NewForce Field for Molecular Mechanical Simulation of Nucleic Acids Proteins (核酸蛋白的分子機械模擬的新力 場)，”J Am Chem Soc. 106 :765_784 (1984)，通過引用將其整體并入本文)，鑒定出30個殘 基具有可能參與與來自互補的A結構域的原子氫鍵鍵合的側鏈原子(參見下表1)。在所鑒 定的殘基的約一半中，側鏈原子與骨架的羰基氧或酰胺氫原子并置，而剩余的則表現相鄰 側鏈之間可能有相互作用。除了用Phe取代Tyr之外，將因子VIII A結構域中的靶殘基分 別突變為Ala，點突變以無B結構域的因子VIII穩定地表達。使用一期凝集測定和(二期)因子Xa生成測定測量純化的蛋白的因子VIII活性。 來自一期測定(圖1)的結果表明30個點突變體中9個顯示出相對于野生型因子VIII小 于50%的活性。這些變體中的5個表現出一期/ 二期測定差異(大于1.5倍的差異)，其 中3個突變體(S524A、H281A和E287A)僅在二期測定中顯示出降低。在幾個被靶向的殘基 中突變的活性值降低與那些側鏈對因子VIII和/或因子VIIIa的結構穩定性的作用一致。表1 能夠氫鍵鍵合的氨基酸殘基
29
權利要求
一種重組因子VIII，包含導致因子VIII和因子VIIIa二者的穩定性增強的一種或多種突變，其中所述一種或多種突變包括在A1A2或A2A3結構域界面的任一界面或者兩個界面用疏水性氨基酸殘基取代一個或多個帶電荷的氨基酸殘基。
2.根據權利要求1所述的重組因子VIII，其中所述帶電荷的氨基酸殘基為Glu或Asp， 并且所述疏水性氨基酸殘基取代為Ala、Val、lie、Leu、Met、Phe或Trp之一。
3.根據權利要求1所述的重組因子VIII，其中所述一種或多種突變包括野生型因子 VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子VIII的Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的 Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的Glu665殘基的取代、野生型因子VIII的Glul984 殘基的取代或它們的組合。
4.根據權利要求3所述的重組因子VIII，其中所述Asp302殘基的取代為D302A。
5.根據權利要求3所述的重組因子VIII，其中所述Glu287殘基的取代為E287A。
6.根據權利要求3所述的重組因子VIII，其中所述Glu665殘基的取代為E665A或 E665V。
7.根據權利要求3所述的重組因子VIII，其中所述Asp519殘基的取代為D519A或 D519V。
8.根據權利要求3所述的重組因子VIII，其中所述Glul984殘基的取代為E1984A或 E1984V。
9.根據權利要求3所述的重組因子VIII，其中所述一種或多種突變包括選自下列的兩 種或更多種取代Glu665殘基、Asp519殘基和Glul984殘基。
10.根據權利要求9所述的重組因子VIII，其中所述兩種或更多種取代包括 D519VE665V、D519AE665V、D519VE1984A, E665VE1984A, E665AE1984V, D519AE665VE1984A, D519VE665VE1984A 或 D519VE665VE1984V。
11.根據權利要求1所述的重組因子VIII，其中所述重組因子VIII由結構域Al、A2、 A3、Cl和C2、或它們的部分組成。
12.根據權利要求11所述的重組因子VIII，其中結構域Al和A2存在于重鏈上并且結 構域A3、Cl和C2存在于輕鏈上。
13.根據權利要求1所述的重組因子VIII，其中所述重組因子VIII包含來自人因子 VIII的一個或多個結構域或其部分，和來自非人哺乳動物的因子VIII的一個或多個結構 域或其部分。
14.根據權利要求1所述的重組因子VIII，其中所述重組因子VIII為基本上純的。
15.根據權利要求1所述的重組因子VIII，其中所述重組因子VIII還包含下列的一種 或多種(i)經修飾以增強重組因子VIII對因子IXa和因子X中的一種或兩種的親和力的 因子IXa和/或因子X結合結構域；(ii)增強在培養物中的分泌的修飾的位點；(iii)增強 其循環半衰期的修飾的血清蛋白結合位點；(iv)有效降低其抗原性和/或免疫原性的至少 一個糖基化識別序列；和(ν)改善重組因子VIIIa的比活的修飾的鈣結合位點。
16.根據權利要求1所述的重組因子VIII，還包含野生型因子VIII的Glull3殘基的 取代，所述Glull3殘基的取代增強激活的因子VIIIa的活性。
17.根據權利要求16所述的重組因子VIII，其中所述一種或多種突變包括野生型因子 VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子VIII的Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的Glu665殘基的取代、野生型因子VIII的Glul984 殘基的取代或它們的組合。
18.根據權利要求17所述的重組因子VIII，其中所述取代包括E113AD519A、 E113AD519V,E113AE665A,Ell3AE665V 或 E113AE1984V。
19.一種藥物組合物，包含根據權利要求1所述的重組因子VIII。
20.根據權利要求19所述的藥物組合物，還包含穩定劑。
21.根據權利要求19所述的藥物組合物，還包含遞送溶媒。
22.根據權利要求19所述的藥物組合物，還包含藥物上可接受的載體。
23.一種分離的核酸分子，編碼根據權利要求1所述的重組因子VIII。
24.根據權利要求23所述的分離的核酸分子，其中所述一種或多種突變包括野生型因 子VIII的Glu287殘基的取代、野生型因子VIII的Asp302殘基的取代、野生型因子VIII的 Asp519殘基的取代、野生型因子VIII的Glu665殘基的取代、野生型因子VIII的Glul984 殘基的取代或它們的組合。
25.根據權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述Asp302殘基的取代為D302A。
26.根據權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述Glu287殘基的取代為E287A。
27.根據權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述Glu665殘基的取代為E665A或 E665V。
28.根據權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述Asp519殘基的取代為D519A或 D519V。
29.根據權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述Glul984殘基的取代為E1984A 或E1984V。
30.根據權利要求24所述的分離的核酸分子，其中所述一種或多種突變包含選自下列 的兩種或更多種取代Glu665殘基、Asp519殘基和Glul984殘基。
31.根據權利要求30所述的分離的核酸分子，其中所述兩種或更多種取代包括 D519VE665V、D519AE665V、D519VE1984A, E665VE1984A, E665AE1984V, D519AE665VE1984A, D519VE665VE1984A 或 D519VE665VE1984V。
32.根據權利要求23所述的分離的核酸分子，其中所述重組因子VIII還包含下列的 一種或多種(i)經修飾以增強重組因子VIII對因子IXa和因子X中的一種或兩種的親和 力的因子IXa和/或因子X結合結構域；(ii)增強在培養物中的分泌的修飾的位點；(iii) 增強其循環半衰期的修飾的血清蛋白結合位點；(iv)有效降低其抗原性和/或免疫原性的 至少一個糖基化識別序列；和(ν)改善重組因子VIIIa的活性的修飾的鈣結合位點。
33.根據權利要求23所述的分離的核酸分子，其中所述核酸為RNA。
34.根據權利要求23所述的分離的核酸分子，其中所述核酸為DNA。
35.一種重組DNA表達系統，包含根據權利要求34所述的DNA分子。
36.根據權利要求35所述的重組DNA表達系統，其中所述DNA分子相對于啟動子在有 義方向上。
37.一種宿主細胞，包含根據權利要求23所述的核酸分子。
38.一種宿主細胞，包含根據權利要求34所述的DNA分子。
39.根據權利要求38所述的宿主細胞，其中所述DNA分子在表達系統中。
40.根據權利要求38所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞為動物細胞、細菌細胞、昆蟲 細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞或藻類細胞。
41.一種制備重組因子VIII的方法，包括將根據權利要求38的宿主細胞在使該宿主細胞表達所述重組因子VIII的條件下培 養；和分離所述重組因子VIII。
42.根據權利要求41所述的方法，其中所述培養在生長培養基中體外進行。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述生長培養基包含馮維勒布蘭德因子。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述宿主細胞包含編碼馮維勒布蘭德因子的轉基因。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述重組因子VIII被分泌到生長培養基中，所 述分離包括將重組因子VIII從生長培養基中分離。
46.根據權利要求41所述的方法，還包括在所述分離之前破壞所述宿主細胞，其中所述分離包括從細胞碎片中分離所述重組因 子 VIII。
47.一種治療動物血友病A的方法，所述方法包括給表現血友病A的動物施用有效量的根據權利要求1所述的重組因子VIII，從而使動 物在血管損傷后表現出有效的血液凝集。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述有效量包括約10至約50單位/kg動物體 重之間。
49.根據權利要求47所述的方法，其中所述動物為哺乳動物。
50.根據權利要求47所述的方法，其中所述動物選自由下列組成的組人、大鼠、小鼠、 豚鼠、狗、貓、猴、黑猩猩、猩猩、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔和雞。
51.根據權利要求47所述的方法，還包括周期性地重復所述施用。全文摘要
本發明涉及重組因子VIII，所述重組因子VIII包括導致因子VIII和因子VIIIa兩者的穩定性增強的一種或多種突變。還公開了制備和使用所述重組因子VIII的方法和含有所述重組因子的藥物組合物。本發明還涉及編碼所述重組因子VIII的分離的核酸分子以及含有所述分離的核酸分子的DNA表達系統和宿主細胞。
文檔編號C12P21/06GK101965409SQ200880123751
公開日2011年2月2日 申請日期2008年7月25日 優先權日2007年11月1日
發明者H·瓦卡巴亞施, P·J·費伊 申請人:羅切斯特大學