來自煙草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因的制作方法
【技術領域】
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[0001]本發明涉及來自煙草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，屬分子生物學應用技術領域。
【背景技術】
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[0002]煙草是我國重要的經濟作物，在生長過程中易受到病蟲害的侵染，病害的發生嚴重影響了煙草的產量和質量。
[0003]近年來，煙草黑脛病的發生愈加嚴重，危害程度僅次于煙草病毒病，是煙草生產上最具毀滅性的病害之一。
[0004]煙草疫霉(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)是引起煙草黑胚病的病原菌，其在侵染煙草時，首先分泌多聚半乳糖酸酸酶(Polygalacturonases, PGs),降解煙草的細胞壁，引起病害；煙草在受到病原物的侵染后，啟動自身的防御系統，抵抗侵染；其中，多聚半乳糖酸酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-1nhibiting Proteins, PGIPs)能夠特異性與PGs結合，降低其水解活性，提高植物的抗病性。
[0005]PGIPs最初在1971年由Albersheim等在菜豆下胚軸、番爺莖和桐葉槭懸浮培養細胞中發現，隨后在蘋果、豌豆、黃瓜、小麥、馬哈利櫻桃、棉花、桃等植物上分離到了能夠抑制PGs活性的PGIPs。
[0006]研究發現，PGIPs可以特異性抑制病原真菌和昆蟲分泌的PGs，可引起高濃度長鏈寡聚半乳糖酸酸(oligogalacturonides, OGs)的積累，激活寄主的防御系統,調控基因的表達，有效地阻斷病菌侵染和抑制相應病程的發生與發展，增強寄主的抗病性。
[0007]研究表明，PGIPs蛋白的一級結構具有LRRs結構域，存在不同程度的糖基化，并在N端和C端存在4個高度保守的半胱氨酸殘基。PGIPs的含量和分布，在時間、空間、品種和組織細胞中存在較大差異，并受到病原物、昆蟲、機械損傷及水楊酸等因子的影響。
[0008]數據表明，PGIPs由復雜的多基因家族組成，且PGIPs家族的不同成員具有幾乎相同的生化性質，但與不同真菌的PGs相互作用的能力不同。隨后研究發現將外源PGIPs基因整合到植物基因組中，可提高植物的抗病性。
[0009]目前，PGIPs基因作為抵抗真菌病害的有效抗病基因，受到了國內外學者的青睞。將PGIPs基因轉入目的植物，增強植物的抗病性，抑制病害的發生，減少農藥的使用，已成為世界各國亟待解決的問題。

【發明內容】

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[0010]為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種來自煙草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，并誘導其表達提高植物的抗病性。
[0011 ] 本發明是通過如下技術方案來實現上述目的的。
[0012]1、煙草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因的克隆
[0013]煙草NtPGIP基因的克隆過程為:煙草品種為小黃金，采用CTAB法提取其基因組DNA ;按照Trizol試劑說明書提取其總RNA，利用M-MLV反轉錄酶合成cDNA ;根據GenBank已報道植物的PGIPs基因設計簡并引物，PCR擴增獲得NtPGIP基因片段；然后采用3’ RACE和5’ RACE技術獲得NtPGIP全長基因。
[0014]對所克隆的NtPGIP基因進彳丁 DNA測序，其DNA序列如下:
[0015]序列表SEQ ID NO:1
[0016]〈110〉長江大學
[0017]〈120〉來自煙草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因
[0018]〈130〉2014
[0019]〈160〉14
[0020]〈170〉PatentIn vers1n 3.3
[0021]〈210〉I
[0022]〈211〉1412
[0023]〈212〉DNA
[0024]〈213〉 Nicotiana tabacum
[0025]〈400〉I
[0026]ccattaatag aagtattgaa tttgcttcta agttccctga tattatcacc aataagaccc60
[0027]agcttcaaca attcctagga agcttaaatt atatttctccctttataaag gatttagcca 120
[0028]aagatacttc tcttctttat gatggattga agaagaatccgaaagcttgg actgatagtc 180
[0029]atacaaatgc ttcataaaat gaaaacctct gtagtttcccttctttattt ttcgttcttc 240
[0030]ttcctttctc aattctccac atctctctct gaaagatgca atccaaatga caaaaaagcc 300
[0031]ctcctagaaa tcaagaaagg cctaggcaat ccctatgacttgatcacatg ggatccaaaa 360
[0032]accgattgtt gtactgattg ggttgaagcc actctctcatgtgatgacaa aaacaatcgt 420
[0033]gttacttcct taaacctctt taaaattgaa gacgttggctacctctcgcc cgcgttcgga 480
[0034]gacttgccgt atctccaaag tttggacatc aataatgtgcgcaatctctc aggtccaatt 540
[0035]ccgcccacaa ttgccaaact ctcaaagctc acattcttga gaattagtca aacaaacatt 600
[0036]tcaggaccag tccctggatt tcttagtaag ttgaaaaaactaacatacat caacttgtca 660
[0037]tacaataaac tcgttggtac tatccctcct ccactttctcagctgtcaaa tctcgagttc 720
[0038]cttggtttag acaggaacaa acttactgga ccaatcccag aatccttcgg taactttgct 780
[0039]ggaaaactca cgtatcttta ccttggccac aaccaattaa ccgggtctgt gcctaaatct 840
[0040]tttggtggtt ggagtcttga gacaattgac ttgtctggaa acatgcttga aggagatatt 900
[0041]tctttcttgt ttggcaaaga taagacaaca tttcaaatgcttttagatca taataagttt 960
[0042]gcattcgact tctcgaaggc aaagtttggg aaaagattatggaggttgga cttgaaccat 1020
[0043]aataaaattt atgggaatct tccagcagct ataacgaaacaaccatggca gcttttcaac 1080
[0044]gtgagttata acaggctttg tgggaagatt ccacaaggtg gggaaataaa gaattatgat 1140
[0045]atttatgttt atctccacaa caaatgcttg tgtgactctccgttgccacc ttgtaaatcg 1200
[0046]tgatgatttg ctgtcatttc tttgagaaat aagagtggatagtctactcc gtgtttttgt 1260
[0047]ggtcctaaat ctatttatgt atttgaacct ttctctttgtatgtcaatag gccagcaaac 1320
[0048]ttaagatgag gctgcctaat aagtcaagat gtgatttaag aatgacaaag ctcattgtgt 1380
[0049]
[0050]煙草NtPGIP基因cDNA全長1412 bp，包含一個長186 bp的5’UTR和長209bp的3’ UTR區域，其開放閱讀框從187bp-1200bp，長1017bp。
[0051]NtPGIP基因編碼蛋白質的氨基酸序列如下:
[0052]序列表SEQ ID NO:2
[0053]〈210〉2
[0054]〈211〉 338
[0055]〈212〉PRT
[0056]〈213〉 Nicotiana tabacum
[0057]<400> 2
[0058]Met Leu His Lys Met Lys Thr Ser Val Val Ser Leu Leu Tyr Phe Ser
[0059]151015
[0060]Phe Phe Phe Leu Ser Gln Phe Ser Thr Ser Leu Ser Glu Arg Cys Asn
[0061]202530
[0062]Pro Asn Asp Lys Lys Ala Leu Leu Glu He Lys Lys Gly Leu Gly Asn
[0063]3540 45
[0064]Pro Tyr Asp Leu He Thr Trp Asp Pro Lys Thr Asp Cys Cys Thr Asp
[0065]5055 60
[0066]Trp Val Glu Ala Thr Leu Ser Cys Asp Asp Lys Asn Asn Arg Val Thr
[0067]6570 7580
[0068]Ser Leu Asn Leu Phe Lys He Glu Asp Val Gly Tyr Leu Ser Pro Ala
[0069]859095
[0070]Phe Gly Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ser Leu Asp He Asn Asn Val Arg
[0071]100105110
[0072]Asn Leu Ser Gly Pro He Pro Pro Thr He Ala Lys Leu Ser Lys Leu
[0073]115120 125
[0074]Thr Phe Leu Arg He Ser Gln Thr Asn He Ser Gly Pro Val Pro Gly
[0