專利名稱：人生長抑素受體2亞型和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及建立和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的分子克隆和基因治療，具體涉及構建人生長抑素受體2亞型與大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立和應用，利用“自殺”基因結合放射性顯像和內照射等多重作用殺傷腫瘤細胞。
背景技術：
腫瘤是當今社會威脅人類健康的最嚴重的疾病之一，臨床上常規多通過手術、放療、化療等方法進行治療，但在大多數情況下，這些治療方法不能從根本上治愈病痛，而且毒副作用大，因此療效不盡如人意。基因治療的出現給人們帶來了新的希望，所謂基因治療，就是將某種核酸物質(基因表達載體或其他)轉移到患者體內，實現特定基因的表達，或封閉特定基因的功能，以達到治療疾病目的的一種技術。它在治療腫瘤、病毒性疾病(如乙肝、HIV感染等)和一些遺傳、代謝類疾病等的嘗試中都取得了令人鼓舞的成效，顯示出良好的應用前景。
截至2003年12月，世界各國共批準基因治療臨床方案636項，涉及病人3496人，其中60％以上是針對腫瘤的。目前用于腫瘤基因治療的基因包括細胞因子基因，腫瘤抑制基因，“自殺”基因，以及外源毒素基因等。其中，包括胞嘧啶脫氨酶(CD)基因在內的“自殺”基因是少數在臨床上被證實具有確鑿療效的基因。美國食品與藥品管理局(FDA)批準了多項關于“自殺”基因的臨床治療方案，但是單一“自殺”基因治療的效果尚不令人滿意。
生長抑素受體(Somatostatin Receptor，SSTR)是一種G蛋白偶聯的膜受體，分布在下丘腦、腦垂體，以及胃腸道、胰腺、膽囊、腎上腺、及甲狀腺等部位。SSTR在大多數生長抑素起源的腫瘤中都有高密度的表達，如垂體腺瘤、胰島細胞瘤、類癌瘤、嗜鉻細胞瘤及小細胞肺癌等，另外在乳腺、腎、結腸的腺癌，以及腦膜瘤、高分化星形細胞瘤及淋巴瘤中已有一定的表達。
SSTR存在五種不同的分子亞型SSTR1，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5。20世紀90年代初五種亞型的SSTR分子被相繼克隆出來。在同一種類的腫瘤中還存在SSTR亞型表達的差異。如在肺癌中小細胞肺癌中以SSTR2為主，而肺腺癌、肺鱗癌這兩種非小細胞肺癌中以SSTR1為主。
生長抑素受體能夠與生長抑素(Somatostatin)及其類似物(Somatostatinanalog，SSA)發生高特異性、高親和力的結合，通過膜內信號傳遞機制產生生物活性，生長抑素的生物學活性不僅僅止于它對內外分泌腺的抑制作用，經研究還發現它可以通過多種途徑作用于腫瘤，抑制腫瘤生長1.直接抗增殖作用 通過與腫瘤部位的生長抑素受體結合上調腺苷酸環化酶、磷酸蛋白激酶的活性，降低Ca2+濃度，以及抑制磷脂酰肌醇-3-激酶途徑抑制促腫瘤細胞增殖的細胞因子和分子信號，并促進腫瘤細胞發生凋亡。
2.間接抗增殖作用 通過抑制促腫瘤生長的激素和生長因子如生長激素(GH)、表皮生長因子(EGF)等以及抑制血管內皮生長因子(VEGF)的促血管形成作用，抑制腫瘤的生長、修復、浸潤、和血行性轉移。
自上世紀80年代以來，人們開始進行SSTR腫瘤顯像以及放射性靶向性治療研究，即應用放射性核素標記SST或SSA，識別和結合SSTR陽性的腫瘤細胞，進行腫瘤的顯像診斷和放射性靶向治療，并可作為報告基因跟蹤目的基因的表達，這些研究均取得了理想的結果。1994年，FDA通過臨床應用111In-Octeotide進行全身顯像，目前又通過了99mTc標記配基可用于肺癌顯像。在SSTR家族成員中，SSTR2由于與多種配基結合時具有較高的親和力和特異性，因此應用最為廣泛。但是其應用范圍限于SSTR2陽性的腫瘤細胞，并不是在所有人類腫瘤中都表達SSTR2基因，這樣，SSA對SSTR2基因陰性的腫瘤不能起到抑腫瘤作用和靶向性放療作用。
胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase，CD)是一種轉換藥物前體的“自殺”基因，其表達產物可以將無毒性的藥物前體5-FC(5-fluorocytosine，5-氟胞嘧啶)，轉變為細胞毒性化療藥物5-FU(5-fluorouracil，5-氟尿嘧啶)。其優勢是人體可以耐受大劑量的5-FC而不產生明顯的毒副作用，在腫瘤局部產生高濃度的殺傷作用，同時引發較強的“旁觀者效應”-CD基因陰性靶細胞由于鄰近細胞帶有藥物轉變基因也被殺傷。但是單一的基因治療目前看來難以起到滿意的臨床治療效果，而且在實驗中難于定位治療轉基因、難于監控療效等問題，都限制了研究的進展。我們需要一種能夠良好監控目的基因轉移、表達的方法。

發明內容
本發明通過建立“自殺”基因-胞嘧啶脫氨酶(CD)與報告基因-人生長抑素受體(SSTR)2的共表達載體，利用“自殺”基因/前體藥物系統，并協同SSTR2靶向的放射性顯像和內照射殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。
人生長抑素受體2亞型與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體，其具有序列表<400>1的序列。
上述載體構建方法按以下步驟進行
(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培養含人SSTR2基因的細胞，待細胞生長至足夠數量時，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA第一鏈，以str5和str3為引物，PCR擴增人SSTR2 cDNA，PCR產物經電泳回收后，用EcoR I和NotI酶切，克隆入pcDNA3載體的相應位點，得到pcDNA3-SSTR2，并進行序列測定。RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaattc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gctcag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。
(2)基因拼接與載體構建以pIRES2-EGFP載體為模板，用引物ir5和si3進行PCR，獲得3’端帶有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同時以pcDNA3-SSTR2為模板，用引物ist5和str3進行PCR，獲得5’端帶有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述兩次PCR產物混合作為模板，以ir5和str3為引物進行PCR，獲得IRES-SSTR2序列串聯體，并經測序證實；該串聯體用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；進一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD載體，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相應位點，最終獲得CD和SSTR2雙順反子表達載體pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相關引物序列如下ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。
共表達載體在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
本發明將“自殺”基因CD和報告基因SSTR2通過IRES連接，內部核糖體進入位點(IRES)可以將2個基因串聯起來，在同一啟動子作用下使2個基因轉錄產生一條雙順反子mRNA，后者在翻譯時，核糖體分別識別5’端的翻譯起始位點和位于2個基因編碼序列之間的IRES，獨立地翻譯產生2種蛋白。通過上述方法構建了2個基因的共表達載體，進而建立了共表達上述基因的細胞系。本發明利用報告基因SSTR2可以良好監測“自殺”基因CD的表達，提供了一種非侵入性、可重復性、定量性顯像方法，將有助于人類基因治療試驗以及分子、細胞治療動物模型的研究；通過與SSTR2配基SSA標記核素的不同，實現顯像或治療的不同效果；SSA與SSTR2結合后的抑腫瘤作用、SSA標記治療核素起到的靶向治療作用、CD基因的殺傷作用，三者有機的結合起來，相互促進，起到單一治療不可達到的效果。體外和動物實驗證實了CD/5-FC“自殺”基因/前體藥物系統協同SSTR2介導的放射性顯像和殺傷對腫瘤生長的抑制作用，為“自殺”基因聯合放射性免疫殺傷和顯像治療腫瘤提供一種新途徑。


圖1CD和SSTR2雙順反子表達載體構建流程2RT-PCR獲得hSSTR2基因電泳照片；圖3pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鑒定；圖4間接免疫熒光檢測pCIS穩定轉染的SKBr3細胞；圖5 5-FC對pCIS穩定轉染的人乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)細胞的殺傷作用；圖6移植瘤長成的裸鼠動物模型；
圖7、圖8、圖9荷瘤小鼠注射99mTc-Octreotide后顯像結果。
具體實施例方式
人生長抑素受體2亞型(SSTR-2)與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶(CD)共表達載體，其具有序列表<400>1的序列。其構建方法按以下步驟進行(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培養含人SSTR2基因的細胞如人胚腎293(HEK293)細胞、小細胞肺癌細胞株NCI-H446，待細胞生長至約8×106時，棄去培養液，加入1ml TRIZOL，按照操作說明提取細胞總RNA，溶于DEPC處理的H2O中，應用SuperScriptTM試劑盒反轉錄成cDNA第一鏈，以str5和str3為引物，PCR擴增人SSTR2 cDNA，PCR產物電泳結果顯示有預期大小(1110bp)DNA片段出現，見圖2 RT-PCR獲得hSSTR2基因電泳照片左側條帶.DL2000 DNA markers(2000，1000，750，500，250，100bp)；右側條帶.PCR產物，可見hSSTR2在1000條帶偏上位置。產物經電泳回收后，克隆入pcDNA3載體的相應位點，得到pcDNA3-SSTR2，進行序列測定并與Genbank中的人SSTR2 mRNA比較，證實序列完全正確。
RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’。
(2)基因拼接與載體構建應用重疊延伸基因拼接(SOE)結合PCR的方法，獲得了IRES-SSTR2編碼序列串聯體，具體為以pIRES2-EGFP載體為模板，用引物ir5和si3進行PCR，獲得3’端帶有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同時以pcDNA3-SSTR2為模板，用引物ist5和str3進行PCR，獲得5’端帶有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列。上述兩次PCR產物混合作為模板，以ir5和str3為引物進行PCR，獲得IRES-SSTR2序列串聯體，并經測序證實。該串聯體用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2。進一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD載體，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相應位點，最終獲得CD和SSTR2雙順反子表達載體pCD-IRES-SSTR2(pCIS)，酶切鑒定結果見圖3 pCD-IRES2-SSTR2(pCIS)EcoRI/BamHI酶切鑒定MDL 2000 DNA marker，0pIRES2-EGFP空載體，1、2pCD-IRES2-SSTR2，可見酶切產物條帶位于1500左右的位置(CD大小1513bp)；測序結果見序列表<400>11-1513為CD序列；1514-2121為IRES序列；2122-3231為SSTR2序列。
ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtccat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atggcg gat gag cca-3’。
CD和SSTR2雙順反子表達載體構建過程參見圖1CD和SSTR2雙順反子表達載體構建流程圖。
CD和SSTR2共表達細胞系的建立轉染前24h，將人乳腺癌SKBr3細胞接種于6孔培養板中，使細胞生長至底面積60％。對于每孔細胞，將8μl脂質體和4μg pCIS載體分別溶于250μl無血清RPMI 1640培養液，并混合成為轉染液，靜置20min后加入進行轉染。
20h后換正常培養液培養48h，加入含400μg/mL G418培養液篩選，3周后獲得穩定轉染的細胞克隆，挑取10個單克隆，分別擴大培養和凍存。
腫瘤細胞體外殺傷實驗(1)MTT(噻唑藍)法測定5-FC對SKBr3-pCIS細胞克隆的殺傷作用pCIS穩定轉染的SKBr3細胞克隆和未經轉染的SKBr3細胞培養于96孔板中，分別于摻入200μg/ml 5-FC后的0h、36h和72h進行MTT檢測，每孔加入20μl 1.5mg/ml的MTT，繼續培養4h后吸去培養液，加入150μl DMSO溶解結晶，用酶聯免疫檢測儀測定各孔490nm光吸收值，并計算相同處理樣品的平均值。結果如表1所示。
表1 SKBr3-pCIS克隆200μg/mL 5-FC作用不同時間MTT檢測結果(OD490nm)；時間 Con1Con2CIS1CIS2CIS3CIS4CIS5CIS6CIS7CIS8CIS9CIS100h0.420.410.420.410.400.430.390.400.440.420.410.4236h 0.760.730.480.370.770.680.460.630.280.590.580.5572h 1.321.350.770.291.331.080.350.190.190.930.610.48表1 Con1、2為未經轉染的SKBr3細胞；CIS1-10為pCIS穩定轉染的SKBr3細胞克隆。表中可以看出CIS7、2的敏感度較高。
(2)間接免疫熒光檢測SSTR2的表達選擇對5-FC殺傷敏感的7號克隆，同時隨機選取1號克隆和未經轉染的SKBr3細胞進行對比研究。細胞培養于6孔板中的蓋玻片上，棄去培養液，PBS(pH7.4)洗2次，4％多聚甲醛固定30min，用0.01％Triton和0.3％雙氧水各處理30min，5％羊血清封閉30min后，依次與稀釋的兔抗人SSTR2抗體和FITC標記的羊抗兔IgG孵育，PBS洗滌，滴一滴PBS在載玻片中央，取出蓋玻片，細胞面朝下輕放于載玻片液滴上，熒光顯微鏡下觀察。間接免疫熒光結果見圖4間接免疫熒光檢測pCIS穩定轉染的SKBr3細胞SSTR2在建系的SKBr3-pCIS 7號細胞克隆(左圖)中有較高水平的表達，5號克隆(中圖)表達量較低，而未經轉染的SKBr3細胞(右圖)檢測不到SSTR2表達。
(3)5-FC對建系細胞的殺傷作用研究培養(2)中證實共表達CD和SSTR2的SKBr3細胞(SKBr3-pCIS克隆7)，分別加入10，50，150，500和1000μg/mL 5-FC，于作用后不同時間進行細胞計數，并按照下式計算細胞死亡率細胞死亡率(％)＝(SKBr3細胞數-SKBr3-pCIS細胞數)/SKBr3細胞數×100％結果顯示見圖5 5-FC對pCIS穩定轉染的入乳腺癌SKBr3(SKBr3-pCIS)細胞的殺傷作用在10-1000μg/mL藥物濃度范圍內，細胞均被有效殺傷，隨著藥物濃度的增加和作用時間延長，殺傷率逐步增高，但在5-FC濃度在150μg/mL以上變化時，細胞殺傷率變化不大，因此可將150-200μg/mL作為研究和體內應用的參考藥物濃度。
(4)hSSTR2/188Re-SSA與CD/5-FC系統的協同殺傷作用pCIS轉染建系細胞中加入188Re-SSA+5-FC，由于SSA的抑腫瘤作用、188Re的放射性殺傷和CD將5-FC轉化為5-Fu的化療作用三重相結合，腫瘤細胞的死亡率大大提高。
動物實驗
(1)顯像實驗已進行顯像實驗pCIS轉染建系SKBr3細胞接種裸鼠皮下建立腫瘤動物模型，瘤體長至1×1×1cm時尾靜脈注射99mTc-Octreotide進行腫瘤顯像，見圖6、圖7、圖8、圖9。圖7注射99mTc-Octreotide后12h，荷瘤小鼠肝臟、腸道顯像，移植腫瘤顯像(箭頭所指)；圖8注射后24h，荷瘤小鼠，腫瘤顯像最為明顯(箭頭所指)；圖9注射后17h、20h、24h、28h顯像結果，可以看出24h腫瘤部位顯像劑濃集程度最高，顯像效果最好。
(2)治療實驗裸鼠雙側臀部皮下接種SKBr3細胞，建立移植瘤動物模型，瘤體內直接注射Ad-hSSTR2-CD，經尾靜脈注射188Re-SSA+5-FC，由于上述的多重作用，腫瘤生長緩慢，部分瘤體出現縮小。
權利要求
1.人生長抑素受體2亞型與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體，其具有序列表<400>1的序列。
2.如權利要求1所述的共表達載體構建方法按以下步驟進行(1)RT-PCR克隆人SSTR2基因培養含人SSTR2基因的細胞待細胞生長至足夠數量時，提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA第一鏈，以str5和str3為引物，PCR擴增人SSTR2 cDNA，PCR產物經電泳回收后，用EcoRI和NotI酶切，克隆入pcDNA3載體的相應位點，得到pcDNA3-SSTR2，并進行序列測定；上述的RT-PCR所用引物如下str55’-ttt gaa ttc atg gac atg gcg gat gag cca ctc aat gga-3’；str35’-ttt gcg gcc gct cag ata ctg gtt tgg agg tct cca t-3’；(2)基因拼接與載體構建以pIRES2-EGFP載體為模板，用引物ir5和si3進行PCR，獲得3’端帶有SSTR2部分序列的IRES核苷酸序列，同時以pcDNA3-SSTR2為模板，用引物ist5和str3進行PCR，獲得5’端帶有IRES部分序列的SSTR2核苷酸序列；上述兩次PCR產物混合作為模板，以ir5和str3為引物進行PCR，獲得IRES-SSTR2序列串聯體，并經測序證實；該串聯體用BamHI/NotI酶切后，克隆入同酶切割的pIRES2-EGFP-CD，以取代其中的IRES-EGFP序列，得到pIRES-SSTR2；進一步以EcoRI和SmaI酶切pAd-CD載體，得到CD基因，并克隆入pIRES-SSTR2相應位點，最終獲得CD和SSTR2雙順反子表達載體pCD-IRES-SSTR2(pCIS)；相關引物序列如下ir55’-tca agc ttc gaa ttc tgc agt cga cgg tac-3’；si35’-cgc cat gtc cat ggt tgt ggc cat att atc atc-3’ist55’-atg gcc aca acc atg gac atg gcg gat gag cca-3’。
3.如權利要求1所述的共表達載體在制備用于腫瘤治療的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及人生長抑素受體2亞型與大腸肝菌胞嘧啶脫氨酶共表達載體及其建立與應用。利用內部核糖體進入位點(IRES)串聯SSTR－2與CD，使兩者同步表達，建立新的報告基因系統；利用生長抑素受體介導的抑制腫瘤增殖作用、放射性殺傷和顯像作用及CD的“自殺”效應，聯合殺傷腫瘤。三者有機的結合起來，相互促進，起到單一治療不可達到的效果，為“自殺”基因聯合放射性免疫殺傷和顯像治療腫瘤提供一種新途徑。
文檔編號A61K48/00GK1563390SQ20041002596
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月18日 優先權日2004年3月18日
發明者汪靜, 賈林濤, 王喆, 李國權 申請人:汪靜