一種TRβ基因突變檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測試劑盒及檢測方法，特別是設及一種ΤΚβ基因突變檢測試劑 盒及檢測方法，屬于生物技術及醫學領域。
【背景技術】
[0002] 甲狀腺激素抵抗綜合征(RTH)是由于甲狀腺激素受體(TR)基因突變，導致祀器官 對甲狀腺激素(ΤΗ)的敏感性降低，使得ΤΗ對全身組織器官作用障礙的一種綜合征。目前認 為該病是一種常染色體顯性或隱性遺傳性疾病，有家族發病傾向，也有散發病例。根據突變 受體亞型不同，分為TRa基因突變致RTH(RTHa)和ΤΚβ基因突變致RTH(RT郵）。1967年 Ref etoff首次報道RT冊，目前全世界共報道3000多RT冊病例，RT地是一類罕見的內分泌疾 病，其中80%由T祕基因突變所致，W家族性發病多見，呈常染色體顯性或隱性遺傳。T祕基 因突變是確診RT地的金標準。
[0003] RT冊臨床表現呈高度異質性，主要由于ΤΚβ基因缺陷的嚴重程度及各祀器官對TH 的依賴性和反應性不同。依據抵抗程度的組織分布，可分為全身型RT冊、垂體型RT冊。臨床 可表現為甲亢（甲狀腺高代謝癥狀）或甲減（乏力、怕冷和記憶力減退等）或無明顯甲功異 常，或同時合并甲亢和甲減癥狀。臨床醫師易誤診為甲亢，予W抗甲狀腺激素藥物、放射性 艦治療或合用kT4治療，導致疾病癥狀加重，因此正確診斷很重要。
[0004] 目前臨床診斷RT冊主要通過kT3抑制實驗和TRH興奮試驗，但由于國內不生產k T3和T畑，從國外購買困難，導致該疾病長期W來無法診斷。
[0005] 金婷等W31歲女患為研究對象，該患者W甲狀腺腫就診，伴屯、慌、出汗和月經減 少等甲亢癥狀；同時有血脂異常等甲減癥狀。停賽治1個月后甲狀腺功能顯示FT3和FT4升 高，而T甜不適當升高。心了3抑制試驗顯示垂體組織和外周組織均存在不同程度的??抵抗。 基因測序發現患者T祕基因出現M442T突變。診斷為全身型RT地(T祕基因 M442T點突變的散 發病例）。2004年Bayer在國際上首次報道一個M442T突變家系，先證者表現為結節性甲狀腺 腫和房顫(非屯、臟病因），FT3和FT4升高，TSH正常高限。目前國際上僅1例M442巧良道，國內尚 無該突變位點的報道。T祕的M442T突變導致其T3依賴性轉錄活性受損，同時突變的T祕干擾 正常T祕的功能，即顯性負效作用，運是M442T導致RT地發病的分子機制。
[0006] 綜上，建議臨床遇到血清FT3和FT4升高，而T甜正常或升高患者，或確診為甲亢后 抗甲藥治療甲狀腺功能一直不能恢復正常的患者，要警惕T祕基因突變，因此臨床迫切需要 一種檢測效率高，方法簡單，結果準確，成本低的T祕基因突變檢測試劑盒及檢測方法，用W 提高RT地的確診率。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的就在于解決現有技術存在的上述問題，提供一種檢測效率高，方法 簡單，結果準確，成本低的T祕基因突變檢測試劑盒及檢測方法，用W提高RT地的確診率。 [000引本發明給出的技術方案是：一種ΤΚβ基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖 液，酶溶液，10對1-10號外顯子特異性擴增引物。
[0009] 所述PCR緩沖液包括0.5mM的MgCl2，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP，dUTP， dGTP，dCTP。
[0010] 所述酶溶液為高保真化q酶和UNG酶。
[0011] 所述10對1-10號外顯子特異性擴增引物編號為沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2、SEQ 10側：3和沈910側：4、56910側：5和沈910側：6、56910側：7和沈910側：8、56910 NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:20。
[0012] 本發明還提供一種T祕基因突變檢測方法，包括W下步驟。
[001引（1)制備本發明的T祕基因突變檢ii試劑盒。
[0014] (2)提取待測樣品，進行PCR反應。
[001引 （3 )PCR產物純化測序，獲得了祕基因突變檢測結果。
[0016] 其特征在于，利用T祕基因1-10號外顯子特異性擴增引物對待測樣品進行點突變 檢測，包括。
[0017] 利用所述擴增引物和待測樣本建立PCR擴增反應體系和程序，獲得PCR產物，純化 后測序。
[001引所述PCR擴增反應體系如下。
[0019]
[0020] 所述PCR擴增反應程序如下。
[0021]
[0022] 所述PCR產物純化處理所用試劑可W為市面上任何一款PCR產物純化試劑。
[0023] 所述PCR產物純化處理后測序，經過對測序圖譜的分析來確定ΤΚβ基因的突變與 否。
[0024] 與現有技術相比，本發明的有益效果是。
[0025] 本發明Τ祕基因突變檢測試劑盒引物通過專業設計和多次篩選，保證了引物特異 性，同時引入UNG酶防污染系統，能夠更加準確，穩定地對樣品進行監測。本發明的檢測試劑 盒及檢測方法具有檢測效率高，方法簡單，結果準確，成本低等特點，因此本發明具有實質 性的技術效果，便與推廣。
【附圖說明】
[0026] 圖1:患者Τ祕基因第10外顯子部分測序圖。患者Τ祕基因第10外顯子的第442位密 碼子處存在點突變，密碼子由ATG改變為ACG，編碼的蛋白質由蛋氨酸變為蘇氨酸(Μ442Τ)。 進一步分析其基因測序圖，該突變為雜合子突變。患者父母的ΤΚβ基因未發現該突變。
[0027] 圖2.對實施例2的患者Τ祕全長外顯子1-10進行PCR擴增及測序，Α:患者，Β:患者父 親，C:患者母親，D:患者姐姐，測序結果顯示，患者第10號外顯子的第453位密碼子存在點突 變，密碼子從CCT突變為ACT,導致其所編碼的蛋白質由脯氨酸變為蘇氨酸。而患者父母和姐 姐均未發現該突變。
【具體實施方式】
[0028] W下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書 所掲露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可W通過另外不同的具體實 施方式加 W實施或應用，本說明書中的各項細節也可W基于不同觀點與應用，在沒有背離 本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0029] 在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數形式"一個"、"一"和"運個"包括復數形式。
[0030] 當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和 科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可W使用與本 發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實 現本發明。
[0031] 除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領 域的常規技術。
[0032] 本發明實施例提供一種ΤΚβ基因突變檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液，酶溶 液，10對特異性擴增引物，其中10對特異性引物序列分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2、 569 10側：3和沈9 10顯：4、569 10側：5和沈9 10顯：6、沈9 10側：7和569 10顯：8、 沈Q ID Ν0:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18、沈Q ID NO: 19和沈Q ID N0:20〇
[0033] 具體地，所述PCR緩沖液含有0.5mM的MgCb，0.5mM的dNTPs，其中dNTPs表示dATP， dUTP，dGTP，dCTP。
[0034] 具體地，所述10對特異性引物序列如表1所示。
[00巧]表1 10對特異性引物序列。
[0036]
[0037]
[003引優選地，本發明TR β基因突變檢測特異性引物針對Τ祕基因1-10號外顯子設計且 通過多次篩選，保證了引物特異性。
[0039] 優選地，本發明實施例中的酶溶液中含有化q酶，其為PCR反應所必需，且該酶溶液 還含有UNG酶，在PCR反應中，使用UNG酶可防非特異性PCR擴增污染。
[0040] 本發明還提供一種TR β基因突變檢測方法，包括W下步驟（1)制備TR β基因突變 檢測試劑盒；（2)取10只PCR管，分別向其中加入步驟（1)中的PCR緩沖液、酶溶液；向所述10 只PCR管中分別加入步驟（1)中的10對特異性引物；（3)提取待測樣品DNA，分別加入至所述 10只PCR管中，進行PCR反應。
[0041 ] 具體地，上述步驟(2)中的PCR緩沖液包括1.0-5. OmM的MgCb，1.0-5. OmM的dNTPs， 良P dATP，加 TP，dGTP，dCTP各1.0-5.OmM。
[0042] 優選地，Κ50μ1反應體系為例，向步驟(2)中加入待測樣品后得到的混合物中各組 分終濃度及含量如下。
[0043]
[0044]
[0045] 上述體系僅為例證性，在實際應用中可按照比例擴大或縮小該混合物體積及其中 各組分含量。
[0046] 具體地，在上述50μ1反應體系中，所述各對引物包括步驟（1)中的10對特異性引 物，所述樣品為基因組DNA。
[0047] 具體地，在步驟(3)中的PCR反應條件為。
[004引
[0049] 在上述PCR反應后，對結果進行分析，所得結果可分為W下二種。
[0化0] (1)測序結果比對后與野生型一致，無突變。
[0051] (2)測序結果比對后出現突變，如圖1所示。
[0化2] 實施例1。
[0053] 制備本發明的Τ祕基因突變檢測試劑盒，包括W下步驟：
[0054] 1.引物合成:針對人類Τ地基因1-10號外顯子序列設計并合成10對特異性引物，序 列分別為沈Q ID NO:巧Ρ沈Q ID N0:2、SEQ ID Ν0:3和沈Q ID N0:4、SEQ ID Ν0:5和沈Q ID NO:6、SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8、SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 10、沈Q ID NO:11和沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO:18、沈Q ID NO:19和沈Q ID NO:20。
[0055] 將上述各對引物