一種人防御素蛋白的新用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種天然免疫效應分子人防御素蛋白的應用，即 在制備對非囊膜類病毒具有抗病毒活性藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 人防御素為人體天然免疫系統中的重要效應分子，是富含半胱氨酸的陽離子肽， 其空間構象中含有β折疊結構，半胱氨酸殘基連接形成的三個分子內二硫鍵使該β折疊 結構更為穩定。生物體內合成的人防御素具有廣譜、高效的抗微生物活性，在天然免疫中具 有重要作用。
[0003] 人β -防御素3 (human β-defensin，HBD3)是人防御素的一種，HBD3蛋白分子 量大約為5KDa，有三對二硫鍵，其cDNA可編碼一個含67個氨基酸的短肽，包含N端的信號 肽序列(共22個氨基酸）和其后的成熟肽序列(共45個氨基酸)。
[0004] 有研究證明，HBD3不僅對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌有抗性，而且還可以抑制 HIV-1的復制，抑制HSV-2吸附和進入細胞的過程（Hazrati E，ei a/ The Journal of Immunology, 2006，177(12): 8658-8666)，以及 IAV 與靶細胞融合的過程（LeikinaE, ei aJ. Nature immunology, 2005，6(10): 995-1001)，同時其對牛痕病毒（vaccinia virus)也具有抑制作用（Howell MD, ei aJ. The Journal of allergy and clinical immunology, 2007, 119(4): 1022 ；Howell MD, et al. The Journal of Immunology, 2004， 172(3): 1763-1767)。
[0005] 目前認為，防御素具有抗病毒作用主要在于其可作用于囊膜類病毒(大多數囊膜 類病毒是呼吸道病毒和血液感染病毒）的囊膜，破壞膜的完整性，并使膜產生穿孔現象，造 成病毒內容物溢出，病毒死亡。同時，某些防御素也可影響病毒的生活周期，如HNP1可以在 體外滅活HIV、HSV、VSV、CMV等；HD4、HD5、HD6、HBD2和HBD3等可以結合在病毒表面或囊膜 脂上，從而抑制病毒的吸附與細胞的融合和穿入，如HIV，HSV和RSV等。雖然目前也有關于 防御素抗非囊膜類病毒的報道，但是，這類防御素發現的較少。大多數非囊膜類病毒是腸道 病毒，如如腸道病毒71型、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒等， 目前對于此類病毒的感染沒有特效藥物治療。本發明提供了一種能夠抗非囊膜類病毒感染 的藥物--人β -防御素3。

【發明內容】

[0006] 本發明旨在提供一種人防御素蛋白的新用途，即其在抵抗非囊膜類病毒感染中的 應用，本發明人防御素蛋白為人β-防御素3 (HBD3)，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0 :2所示， 編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0007] 本發明蛋白是具有抗非囊膜類病毒的蛋白，即人體天然免疫系統中的效應分子人 β -防御素3,非囊膜類病毒包含了如腸道病毒71型、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎 病毒、脊髓灰質炎病毒等。
[0008] 本發明首先構建了 HBD3的真核表達載體pcDNA3. l-smHBD3,其中smHBD3表示 的是含有HBD3信號肽和成熟肽的cDNA序列。將構建好的載體轉染至HT29細胞中，通 過ELISA的方法檢測HBD3在HT29細胞中的分泌情況；最后將構建的HBD3真核表達載體 pcDNA3. l-smHBD3轉染至HT29細胞，獲得能夠短暫表達HBD3的HT29細胞或含有HBD3蛋白 的細胞培養上清；通過檢測EV71對能短暫表達HT29細胞的感染能力驗證HBD3對EV71具 有抗病毒作用；將含有HBD3蛋白的細胞培養上清與EV71相互作用后感染HT29細胞48h并 測定病毒滴度，驗證HBD3在細胞外發揮抗EV71作用。
[0009] 本發明人β -防御素3可以應用于制備抵抗非囊膜類病毒感染的藥物中。
[0010] 本發明通過以下技術方案實現發明目的： 本發明中人防御素蛋白HBD3的來源是從病毒感染了的細胞進行RT-PCR對HBD3基因 擴增，然后在細胞中表達HBD3蛋白，或者從Sigma公司購買HBD3蛋白。
[0011] (1)構建本發明人防御素蛋白HBD3的真核表達質粒PCDNA3. l-smHBD3 取本實驗室保存的PMD18-T-HBD3質粒，通過PCR的方法獲得HBD3的cDNA序列，并命 名為smHBD3 (該序列包含了信號肽和成熟肽的cDNA序列），將smHBD3片段切膠回收純化 后，再對其進行雙酶切及膠回收純化，最后連接至pcDNA3. 1載體，經酶切鑒定及測序驗證， 重組質粒pcDNA3. l-smHBD3構建成功； (2) ELISA檢測pcDNA3. l-smHBD3轉染HT29細胞后，HBD3在細胞中的表達情況 將構建的pcDNA3. l-smHBD3重組質粒轉染至HT29細胞，并分別于轉染后0h、12h、24h、 36h、48h、60h及72h收獲培養細胞的上清與細胞的混合物、上清及細胞，并用PBS將細胞懸 起，使三種樣品體積相等，最后通過ELISA的方法對上述三種樣品進行檢測，確定HBD3在 HT29細胞中的表達情況； (3) HBD3抗EV71作用的檢測 根據ELISA的結果通過三種方法檢測HBD3對EV71的抗病毒活性，方法I :獲得能夠 短暫表達HBD3的HT29細胞，并檢測EV71對該細胞的感染能力；方法II :獲得含有HBD3蛋 白的細胞培養物上清，并將EV71病毒（0. 01 Μ0Ι)加入其中，混勻，于37°C作用4h后，將該 混合物加入HT29細胞，于37°C、5% C02條件下培養48h，收獲病毒并測定病毒滴度；方法III : 用Hanks'液將生長至80%匯合度的HT29細胞清洗后，將收獲的培養基及EV71病毒（0. 01 Μ0Ι)同時加入其中，于37°C、5% C02條件下培養4h，4h后去除細胞表面的溶液，用Hanks' 液清洗細胞表面2次，向其中加入細胞維持液，37°C、5% C02條件下培養48h后收獲病毒并 測定病毒滴度，表明HBD3的抗病毒作用在細胞外發揮的。
[0012] (3) HBD3抵抗其他非囊膜類病毒對細胞的感染 將其它非囊膜類病毒與HBD3混合后，感染對應細胞，測定病毒滴度，確定了 HBD3對其 它非囊膜類病毒也有抗感染作用。
[0013] 與現有藥物相比，本發明具有以下有益效果： 1、 大多數非囊膜類病毒是腸道病毒，如：腸道病毒71型、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒等，目前對于此類病毒的感染沒有特效藥物治療。本發明中 提供的HBD3蛋白能夠對非囊膜類病毒產生明顯的抑制作用，而且是在病毒進入細胞前就 可以發揮抗病毒活性，所以，該蛋白具有作為治療腸道病毒感染人的特效藥物的潛力； 2、 HBD3作為人體天然免疫系統中防御素的一種，是人類本身的蛋白，不會引起人體對 該蛋白的免疫應答和耐藥性；而且作為藥物使用，可以同時抵抗細菌、囊膜類病毒和非囊膜 類病毒的感染。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發明中pcDNA3. l-smHBD3的酶切鑒定圖；A圖中泳道1 :DNA Marker DL2000 ;泳道 2 :pcDNA3. l-smHBD3 原質粒；泳道 3 :麗Ζ?/i單酶切質粒 pcDNA3. l-smHBD3 ;B 圖 中泳道4 :DNA Marker DL5000 ;泳道5 :pcDNA3. l-smHBD3原質粒；泳道6 :及wl:單酶切質粒 pcDNA3. l-smHBD3 ;泳道 7 :J5boRI::單酶切質粒 pcDNA3. l-smHBD3 ; 圖2是本發明ELISA檢測pcDNA3. l-smHBD3轉染HT29細胞不同時間后，人防御素蛋白 HBD3在細胞中相對表達情況； 圖3本發明ELISA檢測pcDNA3. l-smHBD3轉染HT29細胞不同時間后，人防御素蛋白 HBD3在細胞中絕對積累情況； 圖4是本發明中人防御素蛋白HBD3對EV71感染后不同時間的抗病毒作用檢測結果； 圖5是本發明中人防御素蛋白HBD3在細胞內外發揮抗EV71感染的鑒定結果； 圖6是本發明中人防御素蛋白HBD3對柯薩奇病毒A16、柯薩奇病毒B5、脊髓灰質炎病 毒I和呼吸道合胞病毒的抗病毒效應檢測結果。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于 所述的內容。實施例中主要采用常規基因工程、細胞培養、病毒培養及轉染的方法，這些方 法是本領域普通技術人員所熟知的，按照以下實施例，不難根據具體情況略做修改和變換 而成功實施本發明，這些修改和變換均落在本申請權利要求的范圍內。
[0016] 實施例1:構建HBD3的真核表達載體pcDNA3. l-smHBD3 (HBD3來源：從感染了非 囊膜類病毒的細胞中進行HBD3基因擴增，在細胞中表達HBD3蛋白） 使用腸道病毒71型（EV71)病毒(從手足口病患兒的糞便樣品中分離）接種HT29細 胞(來源于ATCC HTB-38)，在病毒感染細胞48h時，收集細胞，使用RNAiso Plus (購買自 TAKARA公司）裂解細胞，并提取細胞總RNA ;然后通過RT-PCR的方法，使用引物HBD3P3 : 5'-GG GAATTCA TGA GGA TCC ATT ATC TT-3'；HBD3P2 :5'-CGG AAT TCT TAG TGG TGG TGG TGG TGG TGT TTC TTT CTT CGG CAG CAT-3'（引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）， 該序列末端含有6 XHis標簽，方便實施例4的EL