一種AFP/HBsAg雙靶向Dexosome抗肝癌瘤苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤生物免疫治療領域，具體涉及AFP/HBsAg雙革E1向Dexosome抗肝癌 瘤苗的制備。
【背景技術】
[0002] 原發性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，流 行病學資料顯示乙型肝炎表面抗原陽性人群肝癌發病率是其他人群的12-300倍。我國人 群HBV的攜帶率在10%左右，而90%的原發性肝癌患者發現HBsAg陽性。盡管目前對原發 性肝癌的治療已取得一些進展，但對于晚期患者的治療和預防復發及轉移效果仍不理想。 因此，有必要探索一種新的、有效治療途徑。隨著人類腫瘤抗原以及腫瘤抗原基因的發現和 確認，為腫瘤的免疫治療尤其是主動性免疫治療提供了新的手段。
[0003] 既往樹突狀細胞瘤苗已進行相關抗肝癌免疫治療的研宄，其策略是在體外以肝 癌抗原沖擊樹突狀細胞（dendriticcell，DC)使其致敏并活化，活化的DC在體內可有 效地攝取、提呈抗原，從而有效地激活肝癌抗原特異性殺傷性T淋巴細胞（CytotoxicT Lymph〇Cyte，CTL)反應。但是存在DC的體外培養繁瑣、數量擴增有限、制備復雜、技術要求 高、難以質控、激發的免疫效應弱等問題。
[0004]DC細胞來源的Dexosome，其表面富含MHC分子和腫瘤抗原，在免疫細胞間的物質 轉運中發揮獨特作用。研宄發現DC來源的Exosome可通過MHC-I/II類分子同時結合抗原 肽，既可活化CD8+細胞毒性T細胞，亦可活化CD4 +輔助T細胞，且其性質穩定，可長期保存， 宜臨床上大量應用，已成為目前的研宄熱點。
[0005]Dexosome是活細胞分泌的亞細胞成份，目前己明確了其組成蛋白，主要包括非特 異性和特異性兩類蛋白質分子。（1)非特異性的蛋白分子：在所有的Dexosome上都有分 布，主要包括細胞溶質蛋白、參與細胞內信號轉導的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白（HSP)、 四跨膜蛋白（tetraspains)等。這些普遍存在的蛋白與抗原提呈相關，可結合抗原多肽 并攜帶至MHC分子。（2)特異性的蛋白分子：DC來源的Dexosome其表達DC的蛋白分子， 與Dexosome生物學功能密切相關。DC來源的Dexosome目前受到較多的研宄和關注。 Dexosome上含有向T細胞進行抗原呈遞的所有生化物質，包括MHC-I和II類分子、熱休克 蛋白（HSP)、乳合素以及重要的T細胞共同刺激物CD86。MHC-I和II類分子參與抗原處理與 T/B細胞限制性識別抗原。HSP73可能具有直接將分子運輸至Dexosome的功能，推測HSP73 與抗原肽結合并運輸至內吞小體的MHC-I類分子上。
[0006]Dexosome含有豐富的MHC-I、MHC-II、CD86等重要的免疫分子。Hsu等檢測了不同 環境下Dexo的MHC分子結合的肽段數量并評價其活化T細胞的能力，發現在無DC存在時， Dexo的MHC-I分子直接負載的肽段比DC存在時間接負載的肽段數量多。此外還發現Dexo 的MHC-II分子也可直接負載肽段。因此，Dexo具有通過MHC-I和MHC-II分子同時結合抗 原肽的特點，既可活化CD8+細胞毒性T細胞（CTL)，亦可活化CD4+輔助T細胞（Th)，從而 增強免疫應答效應。
[0007] 與DC比較，Dexosome為非細胞成分，具有可長期凍存、抗原性弱、穩定高效等優 點，更宜于臨床應用。美國Anosys公司于2002年建立了DC來源Dexosome的提取方法，并 建立GMP(GoodManufacturingPractice)標準。有報道Dexo已用于I期臨床，對12例均 表達MAGE-3抗原的晚期惡性黑色素瘤患者進行了試驗性治療，獲得了良好的效果。先將患 者的MD-DC體外培養7天后分離Dexo。第一組6例患者MD-DC負載MAGE-3抗原；第2組6 例患者MAGE-3抗原直接負載在Dexo上，冰凍保存，連續4周皮下或皮內注射，發現此組患 者治療后病情穩定或腫瘤消退，在治療過程中未出現3-4級毒性反應（毒性反應按NCICTC 標準分級）。第一組只有1例在治療后病情獲得穩定。第二組在注射小劑量Dexosome的患 者中，1例皮下轉移灶消退，另1例在淋巴結部位有部分反應。在注射大劑量Dexosome的6 例患者中，3例在皮膚和淋巴結部位有腫瘤消退和長期的病情穩定，證實注射Dexosome是 安全的，并能獲得腫瘤消退和長期穩定。
[0008]目前認為，DC來源的Dexosome可能是免疫細胞之間相互傳遞信息的一種方式。但 是Dexosome在免疫網絡中具體擔負的角色及其生理意義仍不知道。從其表達MHC分子和共 刺激分子來看，Dexosome可能是APC呈遞抗原肽和刺激T細胞活化的一種途徑。目前公認 的是，APC質膜表面的MHC分子結合抗原肽以后，通過內吞形成多囊體，然后多囊體再向胞 外釋放Dexosome。這些Dexosome攜帶了結合抗原的MHC復合物，能夠被效應細胞捕獲，或 者通過某種機制定向于效應細胞，然后和效應細胞的質膜融合而將抗原呈遞給效應細胞。 同時Dexosome上存在的共刺激分子（⑶80,⑶86)將輔助淋巴細胞的活化。ChoJA等設計 了一個實驗巧妙的證明了上述理論。作者將人腫瘤抗原MUC-1導入兩種MHC類型完全不同 的小鼠細胞系中，然后發現小鼠細胞分泌的Dexosome攜帶上了導入的人腫瘤抗原，而且這 種攜帶人抗原的Dexosome能夠激活小鼠的免疫系統，有效抑制表達MUC-1的腫瘤生長。因 此Dexosome能夠成為投送腫瘤抗原的一個良好工具。
[0009] 甲胎蛋白（&1口1^-€61:〇口1'(^6；[11，六??）在70%-80%的原發性肝癌（}1(工）中有較 高的表達水平。研宄證實將表達mAFP基因的小鼠肝癌細胞株H印a1-6接種C57BL/6J小 鼠，再用插入AFP基因的質粒DNA免疫小鼠，結果發現這種治療性的免疫AFP質粒DNA能誘 發較強的特異性CTL免疫反應，部分小鼠產生了抗AFP抗體反應，并且表達AFP基因小鼠的 腫瘤出現消退，用AFP質粒DNA免疫的小鼠的生存期比其它小鼠也明顯延長。由此說明， AFP能夠作為一種潛在的誘導特異性的CTL反應的腫瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性 免疫治療。
[0010] 已有多家報道利用AFP轉染DC制備DC瘤苗，可以在體外誘導出特異性CTL反應。 但是其臨床應用效果被證實遠遠低于體外實驗，對已形成肝癌的治療效果欠佳。那如何提 高AFP轉染DC來源Dexo的抗腫瘤療效至關重要。目前在提高Exosome的呈遞效果和激活 作用方面，主要集中研宄如何使DC能夠負載更多腫瘤抗原，發揮更大免疫治療效應，人們 研宄了DC負載多種抗原的制備方法，包括：經照射的腫瘤細胞與DC共培養，腫瘤細胞來源 的RNA轉染DC，腺病毒介導多種腫瘤相關抗原感染DC以及多種腫瘤相關抗原肽沖擊致敏 DC等方法。在這些方法中以腫瘤細胞來源的RNA轉染DC以及腺病毒介導多種腫瘤相關抗 原感染DC最為有效，但腫瘤細胞來源的RNA具有生物活性不穩定等缺點。

【發明內容】

[0011] 本發明的目的是提供一種AFP/HBsAg雙靶向Dexosome抗肝癌瘤苗的制備方法， 利用乙肝病毒表面抗原可作為HBV相關肝癌患者免疫治療的相對特異的腫瘤相關分子，以 腺病毒為載體將AFP和HBsAg基因導入DC，提取Dexosome，制備新型雙靶向性抗肝癌瘤苗。 這種具有雙靶向性的亞細胞成份，可長時間保存、省卻了長期培養腫瘤抗原致敏DC的困 難，且誘導的免疫效應優于單一肝癌抗原制備的瘤苗，可控性更強。
[0012] 本發明的技術方案是：一種AFP/HBsAg雙靶向Dexosome抗肝癌瘤苗的制備方法， 其特征在于所述的方法包括以下步驟：
[0013] (1)制備表達人AFP、HBsAg基因的重組腺病毒載體；
[0014] (2)外誘導培養肝癌患者外周血單個核細胞來源的樹突狀細胞；
[0015] (3)含有人AFP、HBsAg基因的重組腺病毒載體體外共感染樹突狀細胞；
[0016] (4)提取共感染的樹突狀細胞來源Dexosome ;
[0017] ⑶制備AFP/HBsAg雙革巴向性Dexosome肝癌瘤苗。
[0018] 含有人AFP、HBsAg基因的重組腺載體，包含人HBsAg、AFP基因片段，其所述的基因 片段分別可見〇. 63kb，1. 8kb片段。
[0019] 含有人AFP、HBsAg基因的重組腺載體，在HEK293細胞進行包裝，培養10天后，出 現細胞病理性變化。
[0020] 體外誘導分化的人樹突狀細胞來源于肝癌患者富集外周血單個核細胞，在電鏡下 樹突狀細胞可以顯示出典型的細胞形態。
[0021] 肝癌患者富集外周血單個核