蠶豆vfpp1c基因的植物表達載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蠶豆的基因的植物表達載體及其在提高植物甲醛吸收能力中的應用，屬于植物分子基因工程領域。
【背景技術】
[0002]甲醛被廣泛用于工業生產中，是膠粘劑工業應用最廣泛的化學原材料。隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內公共場所和家庭，使甲醛成為室內空氣污染公認最具代表性的化學物質。對新裝修住宅的調查結果表明室內空氣中污染的甲醛濃度是室外空氣的6.65倍，在門窗關閉時甲醛濃度超標100倍。甲醛具有活潑的化學性質和生物學活性，能與蛋白質、核酸和脂類產生非特異性反應，使它們喪失生物功能，長期接觸低劑量甲醛可引起多種疾病。
[0003]存在于板材內部的甲醛揮發期可長到3-15年，因此甲醛釋放是一個長期的過程，徹底治理室內空氣中甲醛的污染是個艱巨的任務。國內外學者對室內甲醛污染的治理進行了廣泛的研宄，開發了很多治理甲醛污染的方法。在眾多的凈化方法中，生物凈化法中的植物凈化法以其簡單、自然、經濟、徹底等特點，受到越來越多的關注。植物能凈化氣體甲醛污染是因為植物能將吸收的甲醛代謝為無毒的產物，植物吸收和代謝甲醛的能力越強，凈化作用就越大。然而，由于甲醛對所有的生物都有毒性，所以用植物凈化甲醛時環境中的甲醛也會對植物體本身產生脅迫，從而影響植物的生理生化特性，因此植物對甲醛的吸收和凈化能力還與植物對甲醛脅迫的反應有很大關系。
[0004]近年來，研宄人員通過在植物中過量表達甲醛代謝相關基因來提供植物吸收和代謝甲醛能力，并且取得了良好的效果。研宄表明在擬南芥中過量表達其內源性FALDH、黃金HEpipremnum atfrew?)和水稻FALDH均能提高轉基因擬南芥對HCHO的脫毒和吸收能力，其中轉黃金葛FALDH基因的效果最好；在煙草中過量表達來自短芽胞桿菌(
brevis-) VKLm增加轉基因煙草氧化HCHO為HCOOH的能力，轉基因煙草吸收HCHO的能力也強于WT煙草；在擬南芥、煙草的葉綠體中過量表達甲基營養菌的HCHO固定途徑關鍵酶
6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖異構酶(PHI )，利用HPS/PHI在卡爾文循環途徑上構建一條HCHO光合同化途徑，使轉基因植物同化和吸收HCHO的能力顯著增強；在野生型天竺襄i Pelargonium sp.Frensham，WT)的葉綠體中過量表達HPS-PHI融合蛋白證實這個策略在轉基因天竺葵中也起作用；在煙草葉綠體中過量表達來自甲基營養型酵母HCHO同化途徑(XuMP)的關鍵酶二羥基丙酮激酶(DAS)和二羥基丙酮合酶(DAK)，在轉基因煙草葉綠體中構建另一種HCHO光合同化途徑(DAS/DAK途徑)，結果也提高了轉基因煙草同化HCHO和修復HCHO污染的能力。這些結果說明利用基因工程手段能夠有效地提高植物的甲醛吸收能力。
[0005]絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶I(PPl)是由一個固定不變的催化亞基和幾十種不同的調節亞基組成的異二聚體全酶。PPl催化亞基(PPlc)的一級結構包含有約330個氨基酸殘基。擬南芥/λΓ5.77(ΡΡ1 regulatory subunit2_like protein)突變抑制藍光誘導的氣孔開放、氫泵活性及質膜H+-ATPase的磷酸化，但不影響PHOT的活性和FC調控的質膜H+-ATPase活性。PPlc的選擇性抑制劑Tautomycin抑制photl和phot2單突變體氣孔的藍光反應，說明PPlc介導藍光信號向H+-ATPase傳遞。Takemiya等(2013)的研宄從蠶豆保衛細胞中克隆了四種編碼PPl催化亞基(PPl)的cDNA，利用突變體及藥理學試驗證實，PPlc在蠶豆保衛細胞藍光信號途徑中，在向光素下游和質膜H+-ATPase上游之間起正調控作用，催化質膜H+-ATPase的磷酸化反應。然而目前有關PPlc是否參與甲醛脅迫應答的研宄未見報道。本發明是通過Gateway的技術構建植物表達載體PK_35S_為研宄蠶豆基因在植物應答甲醛脅迫的作用提供了有效的分子基因工程技術，有助于利用分子生物學的手段研宄蠶豆基因的功能以及通過該載體轉染野生型煙草所獲得的轉基因的煙草在提供植物吸收甲醛能力的應用，為利用基因工程的方法提供植物吸收甲醛能力奠定了理論基礎。同時，本發明中所獲得的結果能夠為我們通過基因工程手段提高植物吸收甲醛能力提供了更多的基因資源。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種蠶豆(Vicia faba.V) VFPPltM因的植物表達載體PK-35S-該載體是通過Gateway技術構建而成的，該載體中含有35S組成型啟動子和因，因來源于蠶豆，其GenBank登陸號為AB038648。
[0007]該載體中的基因在35S組成型啟動子的控制下表達，通過農桿菌介導的葉盤轉化法將該植物表達載體轉入野生型煙草后，外源基因在35S組成型啟動子的控制下能夠準確高效地表達，同時獲得的轉基因煙草吸收甲醛的能力也顯著地提高。為了實現本發明的目的，本發明提供如下的技術方法:
1、外源基因的獲得
根據GenBank上發表的蠶豆基因全長序列，其⑶S序列如序列表所示，設計如下特異性引物:
h游引物:5’ -GGATCCATGAGTGCACAAGGACAAC-3’ (含有 BamH I 酶切位點) VFPPlC^游引物:5 ’ - CTCGAGTCACATCTTGTTTGACATCAC-3 ’(含有 XhoI 酶切位點)
2、植物表達載體PK-35S-的構建
Gateway (通路克隆)技術的LR反應構建目的基因的表達載體時，通過重組過程將外源基因連入植物表達載體PK2GW7.0中，不需要經過復雜的限制內酶切的酶切和連接酶的連接過程，只需要把入門克隆載體和目的載體的質粒DNA混合并加入DNA整合或切離所需要的酶就能夠完成目的基因表達載體的構建，因此用Gateway技術構建目的基因的植物表達載體，構建策略如圖2所示，以蠶豆cDNA為模板，用基因的特異性引物，通過RT-PCR的方法擴增獲得VFPPlC基因的⑶S序列。然后通過Τ/Α克隆獲得pMD18T_ VFPPI C，對獲得的陽性克隆進行測序檢測外源基因是否發生突變，再經過BamHI和XhoI雙酶切pMD18T- VFPPim pENTR載體，將因片段亞克隆到pENTR載體上，形成入門克隆載體pENTR- VFPP 1C,最后，在LR Mix Enzyme的作用下，入門克隆載體pENTR- VFPP1CM植物表達載體PK2GW7.0進行LR反應，形成植物表達載體簡稱PK-35S- VFPPI C。
[0008]3、植物表達載體PK-35S- 轉化農桿菌及轉基因煙草篩選
通過電轉化法將植物表達載體PK-35S-K/^°7i轉入農桿菌pMP105菌中，經壯觀霉素(Spe)篩選得到陽性克隆，經菌液PCR檢測陽性克隆中是否含有外源植物表達載體PK-35S-粒，然后通過農桿菌介導的葉盤轉化法轉染野生型煙草，將轉染后的葉片在含有篩選因子Km(卡那霉素)和Cef (頭孢噻肟鈉)的芽誘導固體培養基MS4上誘導外植體發芽，約I個月繼代一次，待有芽生成后，將芽從外植體上切下轉入含有Km和Cef的生根培養基MS上，進行誘導生根，得到的能夠抗Km的煙草幼苗還需要在基因和蛋白水平上檢測外源基因是否正確表達。
[0009]4、轉基因煙草的檢測
經Km篩選得到的能夠抗Km的煙草植株，用CTAB法提取其基因組，分別以野生型煙草和轉基因煙草基因組為模板，用外源基因特異性引物，經過PCR分析檢測外源基因是否整合到野生型煙草基因組中。用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取野生型和轉基因煙草的RNA，再反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，用因特異性引物經RT-PCR法檢測外源基因C1是否能夠正確轉錄；最后，通過Western blot法在蛋白水平上分析外源基因在煙草中的表達情況。
[0010]5、轉基因甲醛吸收能力的分析
由于我們的研宄結果發現甲醛脅迫能夠抑制蠶豆的表達，因此我們在野生型煙草中過量表達來