血清rbp4蛋白作為肝癌病人血清標志物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，涉及一種血清標志物的應用，具體為一種血清RBP4蛋白作為肝癌病人血清標志物及其應用。
【背景技術】
[0002]肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數的45 %。原發性肝癌早期一般無任何癥狀，一旦出現臨床表現，病情大多已進入中、晚期，而且惡性程度高、進展快、預后差、侵襲性強，至今對肝癌的發病機制不清。因此，開發新的疾病標志物，對肝癌的防治具有重要意義。近年來，隨著質譜技術的飛速發展和蛋白質組學研究的深入，產生了血清定量蛋白組學新技術，常用的幾種方法有:ICAT-MS/MS、iTRAQ-MS/MS、2-D以及蛋白芯片等。其中，iTRAQ-MS/MS是一種檢測靈敏度好、蛋白序列的覆蓋率高以及重復性、可靠性好的實驗手段。iTRAQ有如下優點:(1)標記過程簡單，反應速度快，標記效率可高達97%以上，質譜檢測較為靈敏。(2)能夠和多肽的氨基端或多肽鏈賴氨酸殘基上的氨基基團發生共價反應。(3)同一種多肽的離子化程度十分接近，標記后在RPHPLC上的峰位相同。(4)8種同位素標記的相同多肽在進行第一級質譜檢測時，分子量完全相同，這種在同一峰位上的疊加效應可以增強了離子的強度，提高檢測的靈敏性。(5)在碰撞誘導解離(collis1n induced dissociat1n, CID)后，進行二級質譜分析時，帶不同同位素標簽的同一多肽產生質量為113、114、115、116、117、118、119和121Da的報道離子(reporter 1n)。由于低分子量區是質譜定性(質量確定)和定量(豐度比較)較為準確的區域，在此區域比較8種報道離子的豐度，可以較為準確的獲得不同樣品間相同多肽的豐度差異。(6)代表多肽豐度報道離子的比較以及多肽前體的序列等信息，可在一次MS/MS串聯質譜過程中同時獲得。iTRAQ-MS/MS技術已經廣發應用于多種疾病標志物的研究。為進一步揭示疾病的致病機制，引導新的藥物靶標的發現提供了重要的線索。
[0003]轉錄組測序是發現功能基因和標志物的一種可行方法。20世紀70年代誕生第一代化學降解法測序，到二代測序技術已經具備高通量、高度并行等特點，但昂貴的費用成本成為其大范圍應用的姅腳石，新發展起來的第三代測序技術以較低成本、長讀長及高堿基識別率為測序技術發展帶來廣闊的前景，高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，已經廣泛應用于多種腫瘤標志物研究。本發明就是血清定量蛋白組學技術結合新一代轉錄組測序技術在肝癌研究中的新發現。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種血清RBP4蛋白作為肝癌病人血清標志物及其應用，適用于肝癌血清輔助檢測，發病機制研究和抗癌癥藥物開發。
[0005]本發明的技術方案是:一種血清RBP4(Retinol binding protein 4)蛋白作為肝癌病人血清標志物，是利用 iTRAQ(isobaric tags for relative and absolutequantitat1n，iTRAQ)結合MALD1-TOF/MS技術檢測肝癌病人和正常人的血清，和利用1nProton?基因測序儀測序肝癌細胞Smmc-7721及對照組正常肝細胞L-02，共同發現的生物標志物，RBP4蛋白在肝癌病人血清中表達水平明顯低于正常人的血清中表達水平，同時其mRNA水平上也是在肝癌細胞表達水平明顯低于正常人的細胞中表達水平。RT-PCR、免疫組織化學和質譜多反應監測(multiple react1n monitoring,MRM)也驗證RBP4蛋白在肝癌細胞、組織和病人血清中表達降低。
[0006]所述RBP4蛋白在肝癌血清和組織中的表達降低是指以下3個肽段表達水平降低:FSGTWYAMAK, YWGVASFLQK, QEELCLAR。
[0007]本發明的顯著效果在于:
[0008]采用基于iTRAQ標記的定量蛋白質組學和基于二代測序的轉錄組學技術，整合蛋白質組學和轉錄組學數據實現對肝癌的全面系統的研究，得到一種血清RBP4蛋白作為肝癌病人血清標志物，該標志物經過RT-PCR、免疫組織化學和質譜MRM驗證，結果更為可靠，可為臨床應用提供有價值的信息。
【附圖說明】
[0009]圖1 RBP4蛋白肽段FSGTWYAMAK的iTRAQ標記相對定量。
[0010]A:RBP4蛋白的肽段FSGTWYAMAK的二級圖譜；B，肽段FSGTWYAMAK的定量結果，顯示與正常人相比，該肽段在肝癌血清中的表達明顯降低。
[0011 ] 圖2.免疫組織化學檢測RBP4的表達水平。
[0012]免疫組化法驗證RBP4不同表達等級在癌與非癌的分布，與正常細胞株相比，RBP4在肝癌組織中表達明顯下降。
[0013]圖3.質譜MRM檢測血清RBP4的表達水平。
[0014]質譜MRM驗證RBP4在血清中的表達，與正常對照和肝炎相比，RBP4的表達水平在肝癌病人血清中明顯低表達。圖中正常對照以Normal表示，肝炎以Hepatitis表示，肝癌以HCC表示。
【具體實施方式】
[0015]以下通過具體實施例對本發明的技術方案作進一步描述。
[0016]實施例1
[0017]血清定量蛋白組技術檢測RBP4蛋白在肝癌病人血清中表達降低
[0018]1.檢測樣本:
[0019]肝癌病人、肝硬化病人、肝炎病人和正常對照血清各10例。清晨空腹采集2mL全血，4°C靜置l_2h待血液凝固析出血清，3000g離心lOmin，收集上清液，冰上分裝后存至-80 °C備用。
[0020]2.檢測方法:
[0021](1)采用安捷倫多重親和去除系統humanl4色譜柱去除血清中的高豐度蛋白；
[0022](2)每組血清定量100 μ g，按照iTRAQ試劑盒說明書進行胰蛋白酶酶解、分別用iTRAQ試劑113、114、115、116標記健康對照組、肝炎組、肝硬化組、肝癌組，然后混合、凍干；
[0023](3)混合干燥的iTRAQ標記樣品用緩沖液A復溶，緩沖液A由lOmmol/LKH2P04, 25% CAN, pH 2.7組成，通過強陽離子交換色譜柱將混合樣品分20個餾份；
[0024](4)每個餾份分別進行cl8反相分離、點靶和質譜鑒定；
[0025](5)質譜數據采用ProteinPilot 3.0軟件，對人類Uniprot數據庫進行檢索并定量分析；
[0026](6)統計學處理應用SPSS14.0軟件進行統計學分析.計量數據以mean 土 SD表示，兩樣本均數間的比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
[0027]3.檢測結果:質譜共鑒定到RBP4蛋白包含FSGTWYAMAK、YWGVASFLQK、QEELCLAR在內的共10個唯一肽段。總體覆蓋率33.8%，其中116/113 = 0.3481，P < 0.05，RBP4蛋白在肝癌病人血清中表達水平明顯降低。結果如圖1所示。
[0028]實施例2
[0029]RBP4蛋白包含FSGT