OsPEX11基因及其蛋白在提高水稻耐鹽性中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種OsPEX11基因在提高水稻耐鹽性中的應用。本發明通過酵母雙雜交系統(in vivo)和GST pull?down(in vitro)技術篩選并驗證了與調控水稻耐鹽性重要功能蛋白OsCYP2互作的下游靶蛋白OsPEX11，利用RNAi技術證明了該基因參與調控水稻鹽脅迫耐受性；本發明旨在探索新的調控水稻耐鹽基因，豐富水稻耐鹽基因調控網絡及相關信號轉導途徑，為水稻鹽脅迫基因功能研究提供新的思路；與此同時，對揭示水稻鹽脅迫調控機制和提高水稻生產力有重要的意義。
【專利說明】
OsPEX11基因及其蛋白在提高水稻耐鹽性中的應用
技術領域
[0001] 本發明設及分子生物學領域，尤其設及Os陽Xll基因及其蛋白在提高水稻耐鹽性 中的應用。
【背景技術】
[0002] 農業用地的鹽潰化日趨嚴重，我國約有6.7X104km2的鹽潰±地(張建鋒，束玉民， 刑尚軍，等.鹽堿地改良利用與造林技術[J].東北林業大學學報，2002,30(6) :124-129),已 成為農業可持續發展的制約因素。
[0003] 在高鹽環境條件下，作物生長發育受到明顯的抑制，主要表現為光合速率低，營養 生長和生殖生長緩慢，有效干物質積累低，從而嚴重影響結實率。鹽脅迫是自然界中限制農 作物生長發育及產量的主要的非生物脅迫之一，隨著生物技術的發展及廣泛應用，植物耐 鹽生理及分子機制的研究已取得一定進展。通過對耐鹽調控途徑相關的功能基因進行克 隆，并利用遺傳轉化，獲得了一些耐鹽性的轉基因作物，不僅為作物抗逆育種提供了新的遺 傳資源，同時對農業用地鹽潰化環境有所改善，在農作物耐鹽性研究W及農業用地鹽潰化 改良方面展示了誘人的前景。作物抗逆研究一直是作物育種方向的一個重要目標，因此，挖 掘耐鹽功能基因資源，選育高耐鹽性的轉基因作物品種顯得尤為重要。
[0004] 植物在逆境下會積累過量的活性氧類物質，如也化等，破壞細胞膜和一些大分子， 對植物造成傷害。相應的，植物也會合成一些抗氧化酶和抗氧化劑來清除體內多余的活性 氧類物質，抗氧化酶主要包括過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氨酶(CAT)、 抗壞血酸過氧化物酶(APX)和谷脫甘膚還原酶(GR)等；抗氧化劑主要是還原型谷脫甘膚 (GSH)、抗壞血酸(AsA)、類胡蘿h素、2-生育酪(維生素 E)、和半脫氨酸等。
[0005] 研究發現，鹽脅迫下抗氧化酶活性顯著升高，表明抗氧化酶活性高低與耐受程度 存在相關性（Mittova V,Tal !,Volokita M,et al.Up-regulation of the leaf mitochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt-induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii[J] .Plant Cell and Environment[J],2003,26:845-856)。鹽脅 迫誘導下，擬南芥麟脂過氧化氨谷脫甘版過氧化物酶(PHGPX)表達水平較正常情況下升高 了3倍（Sugimoto M,Sakamoto W.Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene from Arabidopsis thaliana induced by oxidative stress[J] ? Genes Genetic Systems, 1997,72:311-316);在巧橘類中也發現了類似的5葬脂過氧化氨 谷脫甘版過氧化物酶受鹽脅迫誘導而大量表達，同時，超氧化物歧化酶、谷脫甘版過氧化物 酶和胞質中抗壞血酸過氧化物酶的活性也是上升的（Gueta-Dahan Y，Yaniv Z，Zilinskas BA，et al. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in citrus[J].Planta, 1997,203:460-469) dROS清除劑還 可清除膜脂過氧化作用產生的丙二酸，從而保護膜結構、緩解脅迫對植物造成的傷害（陳 瑤，鄭海雷，肖強，等.鹽度對互花米草氧化和抗氧化系統的影響[J].廈口大學學報，2005， 44(4): 576-579)。植物葉綠體中主要是利用抗壞血酸鹽過氧化物酶的催化作用來清除活性 氧物質（Shi QHjZhu ZJ,Khalid AA,et al .Effects of is〇-〇smotic salt stress on the activities of antioxidative enzymes，H+-ATPase and H+-PPase in tomato plants[J] .Acta Photophysiologica SiniCa,2004,30:311-316)，其他酶活性也能參與活 性氧的清除，但不同品種間存在一定的差別。稷稻耐鹽品種韭萊青在鹽脅迫下根中的POD和 CAT活性強于鹽敏感型品種武運稷8號，而SO巧日APX則沒有顯著差異，表明水稻品種之間存 在不同抗氧化酶鹽脅迫響應機制（陳海燕，崔香菊，陳熙，等.鹽脅迫及La 3+對不同耐鹽性水 稻根中抗氧化酶及質膜H+-ATPase的影響[J].作物學報，2007,33(7): 1086-1093)。
[0006] 鹽脅迫下細胞內積累過量的活性氧類物質，將導致酶類失活、蛋白質降解和膜脂 過氧化等，從而對植株造成傷害。抗氧化酶類物質能在鹽脅迫下誘導表達，清除活性氧物 質，緩解脅迫傷害，如番茄中編碼葉綠體內囊體膜抗壞血酸過氧化物酶基因化etAPX)受鹽 脅迫誘導。克隆編碼抗氧化酶基因通過遺傳轉化超表達后能顯著提高轉化植株的耐鹽性 (Alscher RG,Erturk N,Heath LS.Role of superoxide dismutases(SODs) in controlling oxidative stress in plants[J].Journal of Experimental Botany, 2002,53:1331-1341；Wang J,Zhang H,Allen RD.Overexpression of an Arabidopsis peroxisomal ascorbate peroxidase gene in tobacco increases protection against oxidative stress.Plant and Cell Physiology,1999,40:725-732)。
[0007] 在煙草中過表達番茄LetAK(基因有助于提高煙草的耐鹽能力，在鹽脅迫下轉基因 煙草的種子發芽率、植株的干鮮重、APX酶活性和清除此化能力都顯著高于對照（孫衛紅，李 風，束德峰，等.轉番茄正義抗壞血酸過氧化物酶基因提高煙草耐鹽能力[J].中國農業科 學，2009，42(4): 1165-1171)。煙草中編碼谷脫甘膚S轉移酶和谷脫甘膚過氧化物酶的基因 在過表達的情況下也能提高煙草的耐鹽性，有效清除過氧化物質，提高谷脫甘膚酶和抗壞 血酸酶代謝活性，降低鹽害產生的過氧化損傷（Roxas VP，Smith RK Jr，Allen ER，et 曰1.0 verexpression of glutathione S-tr曰nsfer曰se/glut曰thione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress.Nature Biotechnology,1997,15:988-991;Roxas VP,Lodhi SA,Garrett DK,et al.Stress tolerance in transgenic tobacco seedings that overexpress glutathione S-tr曰nsfer曰se/glut曰thione peroxid曰se[J].Pl曰nt Cell Physiology,2000,41:1229-1234)。從大腸桿菌中克隆的ka巧基因通過遺傳轉化能增強轉基因水稻耐鹽性，該基因編碼 的過氧化氨酶活性較對照高1.5-2.5倍，且能在IOOmM化Cl脅迫下開花結實(化gamiya K， Motohashi T,Nakao K,et al.Enhancement of salt tolerance in transgenic rice expressing an Escherichi曰 coli catalase gene ,k曰tE[J]. Plant Biotechnology Report,2007,1:49-55)。
[000引目前，水稻抗氧化酶系統在耐鹽生理生化方面的研究已有較多的報道，但抗氧化 酶類耐鹽基因發掘和抗氧化酶基因耐鹽分子機理W及相關信號轉導途徑的研究值得進一 步的深入研究。

【發明內容】

[0009]本發明提供了一種OsPEXII基因及其蛋白在提高水稻耐鹽性中的應用，該OsPEXII 基因能夠直接調控水稻耐鹽性，蛋白OsPEXl I能夠與功能蛋白OsCYP2互作，并提高水稻對鹽 脅迫的耐受性。
[0010] 本發明發現了OsPEXII基因在提高水稻耐鹽性中的應用，所述OsPEXII基因為 0s03g0302000〇
[0011] 具體地，所述的應用，包括:構建包含所述OsPEXl 1基因的過表達載體，通過農桿菌 介導將OsPEXII基因轉入水稻細胞，培養生成水稻耐鹽植株。
[0012] 所述過表達載體為pl300-Ubi。
[0013] 所述農桿菌為EHA105。
[0014] 本發明還發現了與水稻親環素蛋白CYP2互作的蛋白OsPEXII在提高水稻耐鹽性中 的應用，所述蛋白OsPEXII的編碼基因為0s03g0302000,所述親環素蛋白CYP2的編碼基因為 0s02g0121300〇
[0015] 本發明通過酵母雙雜交系統，從水稻cDNA文庫中篩選到一個與已知耐鹽功能蛋白 0SCYP2互作的下游祀蛋白，經序列同源性比對，鑒定為水稻過氧化物酶合成因子，所述蛋白 OsPEXII的編碼基因為0s03g0302000,所述親環素蛋白CYP2的編碼基因為0s02g0121300。
[0016] 然后，對互作祀蛋白進行分離，提取酵母細胞的表達載體，轉化大腸桿菌DH5a，利 用PGADT7載體的氨節青霉素抗性標記在LB+Amp的培養基中分離互作表達載體，送生物公司 測序，再進行序列比對，鑒定為水稻過氧化物酶合成因子(OsPEXl 1)。
[0017] 接著，通過體外pul 1-down和western blot檢測，驗證0sCYP2和Os陽Xll存在真實 互作，將0sCYP2和OsPEXII分別克隆至原核表達載體PGEX-4T-1和祀T28a，形成兩個融合表 達載體（PGEX-4T-1中GST蛋白與0SCYP2蛋白融合表達，pET28a中Hi S蛋白與OsPEXl 1蛋白融 合表達），經GST和Hi S純化磁珠提取GST-0SCYP2融合蛋白和Hi S-OsPEXl 1融合蛋白，利用 MagneGST Pull-Down System和His標簽偶聯HRP進行蛋白互作試驗，經DAB染色驗證GST-0SCYP2融合蛋白與化S-OsPEXl 1融合蛋白互作。
[0018] 然后，利用反向遺傳學的方法，驗證該基因調控水稻耐鹽功能。具體包括:在200mM 氯化鋼溶液處理下，觀察過表達轉化植株與干擾轉化植株相對于野生型的鹽脅迫耐受性； 結果表明，干擾轉化植株相對于野生型和過表達轉化植株表現出對鹽脅迫更敏感的表型。 相關鹽脅迫調控基因的表達結果與表型一致，其抗氧化酶活性結果也驗證運一結果。
[0019] 最后，對過表達轉化植株與干擾轉化植株進行細胞超微結構觀察。發現，在鹽脅迫 處理下，野生型植株的葉綠體形態結構發生變化，少量基粒片層和類囊體呈堆疊狀且不規 貝IJ;過表達植株的內囊體和葉綠體都保持相對的正常形態，而干擾植株的線粒體等細胞器 均呈現異常形態。
[0020] 本發明通過酵母雙雜交系統（in vivo)和GST pull-down(in viho)技術篩選并 驗證了與調控水稻耐鹽重要功能蛋白0sCYP2互作的下游祀蛋白OsPEXll，旨在探索新的調 控水稻耐鹽基因，豐富水稻耐鹽基因調控網絡及相關信號轉導途徑，為水稻耐鹽基因功能 研究提供新的思路;與此同時，對掲示水稻鹽脅迫機制和提高水稻生產力有重要的意義。
【附圖說明】
[0021] 圖1為酵母雙雜交篩選互作蛋白；
[0022] A:SD/-T 巧-Leu-Ade-His/X-a-gal/AbA 固體培養基篩選；B:SD/-T 巧-Leu/X-a-gal 固體培養基篩選。
[0023] 圖2為0sCYP2蛋白與OsPEXII蛋白的酵母一對一互作驗證；
[0024] DDO/X:SD/-hp-Leu/X-a-gal;QDO/X/A:SD/-hp-Leu-Ade-His/X-a-gal/AbA;
[00 巧]AD-OsPEXI1:pGADT7+0sPEXl1;BD:pG服T7;抓-0sCYP2:pG服T7+0SCYP2。
[00%] 圖3為SDS-PAGE凝膠電泳(A)及DAB染色(B)驗證GST-0SCYP2融合表達蛋白；
[0027] 1:GST 蛋白；2:GST-〇sCYP2 融合蛋白；M:預染蛋白 marker。
[00 巧]圖4為GST(Glutathione-S-transferase)pull-down;
[00 巧]GST:PGEX-4T-1;GST-〇sCYP2:pGEX-4T-l+0sCYP2;His-P邸11:pET28a+0sPEXl1。
[0030] 圖5為To代過表達和干擾轉化再生植株潮霉素篩選標記PCR檢測；
[0031] M:DNA Marker F;P:pl300-RNAi;WT:野生型植株;1-4:過表達轉轉化植株;5-8:干 擾轉化植株。
[0032] 圖6為OsPEXII基因過表達及干擾植株的鹽脅迫表型分析結果；
[0033] A:野生型；B :鹽脅迫處理野生型；C : OsPEXl 1基因過表達植株；D :鹽脅迫處理 OsPEXl 1基因過表達植株;E: OsPEXl 1基因干擾植株;F:鹽脅迫處理Os陽Xl 1基因干擾植株。
[0034] 圖7為過表達及干擾植株在對照(水處理)和鹽脅迫處理下OsPEXII基因表達情況；
[0035] WT:野生型；OsPEXl I-OEl，0E2: OsPEXl 1基因過表達植株；OsPEXl I-RNAi 1，RNAi2: OsPEXII基因干擾植株。
[0036] 圖8為鹽脅迫處理對過表達及干擾植株的鋼鐘離子積累和生理生化的影響；
[0037] A:鋼鐘離子比；B:超氧化物歧化酶活性;C:過氧化物酶活性;D:過氧化氨酶活性； E:丙二醒含量;F:脯氨酸含量。
[0038] 圖9為過表達及干擾植株鹽脅迫相關調控基因表達情況；
[0039] A:0s服t2;l;B:0s服tl;5;C:0sLti6a;D:0sLtim3;E:0sS0Sl;F:0sWlXl;G:0sAKTl。
[0040] 圖10為鹽脅迫處理下對過表達及干擾植株細胞超微結構的影響；PM:質膜;CW:細 胞壁;G:基粒;PG:質體小球;MTC:線粒體。
[0041 ] A:野生型化2〇處理）；B:過表達植株化2〇處理）；C:干擾植株化2〇處理）；D:野生型 (NaCl處理）；E:過表達植株(NaCl處理）；F:干擾植株(NaCl處理）。
【具體實施方式】
[0042] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細闡述。
[0043] 其中，下列實施例中的水稻品種'愛知旭'由杭州市農業科學研究院提供。
[0044] 實施例1
[0045] 一、酵母Y2H感受態細胞的制備和共轉化
[0046] 共轉化酵母表達載體pG服T7+0SCYP2和水稻pGADT7+cDNA文庫表達載體至酵母菌 株Y2H，酵母感受態細胞制備及轉化；
[0047] 具體步驟如下：
[004引 1)吸取化1酵母菌株Y2H菌液涂布于YPDA培養基，30°C培養3-5天；
[0049] 2)挑取2-3臟單克隆接種于31111￥?04液體培養基中，30°(：，250巧111培養8-12虹；
[00加]3)取化1轉接至50ml YPDA液體培養基中，30°C，250巧m培養至ODso日達到0.15-0.3; [0051 ] 4)700g室溫離屯、5min，棄上清，重懸于100mL YPDA液體培養基中，30°C，250巧m培 養至ODso日達到0.4-0.5;
[0化2] 5)700g室溫離屯、5min，棄上清，重懸于30ml滅菌dd出0;
[0化3] 6)700g室溫離屯、5min，棄上清，重懸于 1.5ml l.lXTE/LiAc;
[0化4] 7)菌液轉移至1.5ml離屯、管中，10000巧m離屯、15s，棄上清，重懸于60化1 1.1 XTE/ LiAc至冰上備用；
[0055] 8)在預冷的50ml滅菌離屯、管中依次加入化g酵母表達載體pGBKT7+0sCYP2，15iig pGADT7+cDNA文庫表達載體，200yg 化astmaker Carrier DNA，600iU酵母Y2H感受態細胞；
[0056] 9)加入2.5ml PEG/LiAc，混勻后3(TC解育45min，每隔15min搖勻混合一次；
[0057] 10)加入16化1 DMSO混勻，42°C水浴20min，每隔IOmin搖勻混合一次；
[005引 11 MOOOrpm離屯、5min，棄上清，重懸于3ml YPDA Plus Medium,30°C，150巧m培養 90min；
[0059] 12)4000巧m離屯、5min，棄上清，重懸于15ml 0.9%的氯化鋼溶液中；
[0060] 13)將15ml菌液按25化1/皿涂布于SD/-化p/-Leu/X-a-gal/AbA固體培養基，30°C 培養3-5天；
[0061 ] 14)挑取藍色單克隆接種于SDAlYpALeuAAdeAHisA-Q-SaVAbA固體培養基， 30 °C培養3-5天。
[0062] 在固體篩選培養基中能生長且呈藍色的酵母菌落，即為可能與0SCYP2蛋白存在互 作的祀蛋白（如圖IA所示）。
[0063] 二、分離及鑒定陽性互作祀蛋白（體內）
[0064] 挑取上述SD/-化p/-Leu/-Ade/-His/X-a-gal/AbA固體培養基中藍色單克隆，劃線 接種至SD/-Trp/-Leu/X-a-gal固體培養基，重復2-3次，分離藍色酵母單克隆（如圖IB所 示），采用小量法提取酵母質粒巧asy Yeast Plasmid Isolation Kit,Clontech,630467)， 具體步驟如下：
[0(?日]1)挑取酵母藍色單克隆重懸于50化1 IOmM的邸TA, IlOOOg離屯、Imin,去上清；
[0066] 2)加200iil ZYM溶液重懸菌體，再加入酶解液，輕微滿旋混勻，30°C振蕩培養 化r;
[0067] 3)2000g 離屯、lOmin，去上清；
[006引 4)加入25化1 YlBuffer/RNase Asolution重懸菌體；
[0069] 5)加入25化1 Y2Lysis Buffer,輕微顛倒混勻，室溫放置3min;
[0070] 6)加入30化1 Y3化utilization Buffer,輕微顛倒混勻，IlOOOg室溫離屯、5min;
[0071] 7)轉移上清液至新的離屯、管中aiOOOg室溫離屯、5min;
[0072] 8)將上清液轉移至化ast Plasmid Spin Column,IlOOOg室溫離屯、Imin，棄廢液；
[0073] 9)加450iU Y4Wash 8證'6'，11000邑室溫離屯、3111111，棄廢液；
[0074] 10)將空離屯、管IlOOOg室溫離屯、3min;
[00巧]11)吸附柱置于新的1.5ml離屯、管中，加入SOiil YE Elution Buffer,室溫靜置 Imin, IlOOOg 室溫離屯、Imin;
[0076] 12)回收質粒置于-20°C保存備用。
[0077] 將上述提取的質粒轉化大腸桿菌D冊a,涂布與含有氨節青霉素的LB固體培養基， 利用酵母表達載體PGAD17的氨節青霉素抗性標記篩選互作表達載體，小量法提取質粒，送 生物公司測序。利用NCBI數據庫進行序列同源性比對，鑒定上述序列編碼的蛋白為過氧化 物酶合成因子(Peroxisomal biogenesis factor 11)。
[0078] 將分離的pGADT7+0sPEXl I質粒，與pG服T7或pG服T7+0sCYP2分別共轉化酵母菌株 Y2H，酵母感受態制備及質粒轉化同步驟一。
[00 巧]取 1〇化1 轉化菌液涂布于 SDATrpALeuA-Q-Sa^PSDAlYpALeuAAdeAHisA-a-gal/AbA固體培養基中，30°C培養3天;結果顯示，共轉化酵母表達載體pG服T與PGADT7+ Os陽Xl 1的Y2H菌株只能在SD/-化p/-Leu/X-a-gal固體培養基中生長且無藍色信號，而共轉 化酵母表達載體 pG 服 T7+0SCYP2 與 pGADT7+0sPEXll 的 Y2H 菌株在 SDAlYpALeuA-Q-Sal 和 SD/-Trp/-Leu/-Ade/-Hi s/X-a-gal/AbA固體培養基中均能生長且呈藍色菌落（如圖2所 示），表明0SCYP2蛋白與OsZFP蛋白存在互作。
[0080] S、GST-〇sCYP2融合蛋白分離及Western Blot
[0081 ]將0sCYP2基因克隆至原核表達載體PGEX-4T-1多克隆位點，引物序列分別為GST-0sCYP2-F:CGGAATTCATGTCGAACACGAGGGTGTT(SEQ ID NO.1)和GST-〇sCYP2-R: CCGCTCGAGCTAGGAGAGCTGGCCGCAGT(SEQ ID N0.2);構建好的重組載體轉化至大腸桿菌 BL21，利用GST蛋白吸附磁珠（Ma即eGST PuU-Down System,Promega,V8870)分離純化GST 蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白，具體步驟如下：
[0082] 1)取37°C過夜培養的新鮮菌液11111，10000旨離屯、2111111，在-20°(：下冷凍15111111，室溫 下融化；
[0083] 2)加入20化1 Cell Lysis Reagent重懸混勻菌體；
[0084] 3)加入化 1 RQlRNase-Free Dnase,室溫下旋轉解育30min;
[00化]4)取GST磁珠至1.5ml離屯、管中，放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并棄 置；
[00化]5)取下離屯、管并加入25化1 Ma即eGST Binding/Wash Buffer重懸混勻GST磁珠；
[0087] 6)重復2次步驟4)和5);
[0088] 7)加入 10化1 Ma即eGST Binding/Wash Buffer(含 1%BSA)重懸混勻磁珠；
[0089] 8)將20化1細菌裂解液加入磁珠溶液，室溫下輕微振蕩旋轉解育30min;
[0090] 9)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并棄置；
[0091] 10)取下離屯、管并加入25化1 Ma即eGST Binding/Wash Buffer重懸混勻，室溫旋 轉解育5min;
[0092] 11)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并棄置；
[0093] 12)重復3次步驟10)和11);
[0094] 13)加入20iU Ma即eGST Binding/Wash Buffer重懸混勻備用；
[00巧]取化1上述純化的GST蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白點樣，經SDS-PGAE凝膠（濃度 12 % )電泳分離，在固定液(500ml甲醇，100mL乙酸和400ml dd此0)中固定化r;棄去固定液， 加入考馬斯亮藍染色液(450ml甲醇，1 OOml乙酸，450ml dd出0和1.6g考馬斯亮藍R-250)，常 溫下染色化r;棄去染色液，加入脫色液(50ml甲醇，70ml乙酸和880ml d地2〇)，常溫下脫色 3化r，觀察拍照，GST蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白純化結果如圖3A所示。
[0096] 通過Bio-Rad電轉儀將SDS-PAGE凝膠中蛋白轉至PDVF膜（轉膜液：3.03g Tris base，14.4g甘氨酸，200ml甲醇，880ml d地2〇)，轉膜條件為330mA化r;將PVDF膜置于IOml 封閉液中（100ml PBS Buffer,5g脫脂奶粉），37°C封閉化。加入偶聯HRP的GST抗體，用一抗 稀釋液（1 g BSA，1 OOml洗膜液，pH 7.4)按1:1000比例稀釋，常溫下解育Ihr;用洗膜液 (0.5ml Tween 20，1000ml PBS Buffer)洗膜3次，每次lOmin。最后，用辣根過氧化氨酶DAB 顯色試劑盒顯色，并觀察拍照，GST蛋白和GST-0SCYP2融合蛋白Western Blot結果如圖3B所 /J、- O
[0097] 四、His-P邸11融合蛋白分離及GST化Il-Down
[009引將OsPEXII基因克隆至原核表達載體pET28a多克隆位點，引物序列分別為化3-OsPEXlI-F:CGCGGATCCATGGCCGCCGCCGCCGCCGC(SEQ ID NO.3)和His-OsPEXll-R: CCGCTCGAGGCACGAATTCCAATTCTTGT(SEQ ID N0.4);構建好的重組載體轉化至大腸桿菌 BL21，利用His蛋白吸附磁珠（Ma即eGST Protein Purification System，P;romega，V8500) 分離純化化S蛋白和化s-OsPEXll融合蛋白，具體步驟如下：
[0099] 1)取37°C過夜培養的新鮮菌液Iml于1.5ml離屯、管中aOOOOg離屯、2min，在-20°C下 冷凍15min，室溫下融化；
[0100] 2)加入lOOul 1 XF'ast&reak Cell Lysis Reagent重懸混勻菌體；
[0101] 3)加入化1 Dnase I，室溫下旋轉振蕩20min;
[0102] 4)加入IOiU 5M NaCl，30iU MagneHis Ni-Particles顛倒混勻 10次，室溫靜置 2min;
[0103] 5)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并棄置；
[0104] 6)取下離屯、管并加入 15化1 Ma即細is Binding/Wash Buffer和 15iil 5M 化Cl重 懸混勻，室溫旋轉解育5min;
[0105] 7)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并棄置；
[0106] 8)重復2次步驟6)和7);
[0107] 9)加入10化1 Ma即eHis Elution Buffer重懸混勻，室溫解育2min;
[0108] 10)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液至新的1.5ml離屯、管中備用；
[0109] 11)分別取20山純化的His-Os陽Xl 1融合蛋白至扣1 GST蛋白和GST-〇sCYP2融合蛋 白的固化磁珠液中；
[0110] 12)加入 15化 1 Ma即eGST?Binding/Wash Buffer和20iU 10%BSA，室溫下旋轉解 育化r;
[0111] 13)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液并棄置；
[0112] 14)取下離屯、管并加入400]il MagneGST Binding/Wash Buffer重懸顛倒振蕩混 勻，室溫靜置5min;
[0113] 15)重復4次步驟13)和14);
[0114] 16)加入20iU IXSDS loading buffer重懸混勻，室溫靜置5min;
[0115] 17)將離屯、管放置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液至新的1.5ml離屯、管中備用。
[0116] 取扣1上述洗脫液點樣，SDS-PAGE凝膠電泳和轉膜方法同步驟S，封閉后加入偶聯 HRP的化S抗體，洗膜及DAB顯色反應方法同上，Western Blot檢測結果如圖4所示，表明 0sCYP2蛋白與Os陽Xl 1蛋白存在互作。
[0117] 實施例2
[0118] 一、OsPEXII基因過表達和干擾植株的鹽脅迫表型分析
[0119] 為了驗證Os陽Xll基因耐鹽功能，將Os陽乂11基因克隆至口1300-化巧化1300-3酷1， 成功構建了該基因過表達和干擾載體;遺傳表達載體導入農桿菌EHA105,水稻遺傳轉化試 驗方法參照文南犬化iei Y,0hta S,Komari T,et al.Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of 化 e T-DNA[J].Plant Journal ,1994,6:271-282),對轉化再生植株潮霉素 篩選標記進行PCR檢測驗證(如圖5所示），獲得過表達和干擾陽性轉化植株。
[0120] W野生型、OsPEXII基因過表達植株和干擾植株的10天幼苗為試驗材料，在添加 200mM NaCl的水培條件下，處理24小時后，野生型和Os陽Xll基因干擾植株的葉片表現出卷 縮的形態特征，且干擾植株的葉片出現部分失綠的現象;而相同條件下的OsPEXII基因過表 達植株則表現正常(如圖6所示）。
[0121] 同時，對S種基因型幼苗植株的OsPEXII基因的轉錄水平進行巧光定量PCR分析， 內參基因引物序列和OsPEXII基因引物序列如下：
[0122] Actin-F:GACCTTGCTGGGCGTGAT(沈Q ID N0.5)
[0123] Actin-R:GTCATAGTCCAGGGCGATGT(沈Q ID N0.6)
[0124] qRT-〇sPEXll-F：GCGTCTACTACTTCCTCG(SEQ ID NO.7)
[0125] qRT-〇sPEXll-R：GACTCCAGTTTGCCGATC(SEQ ID NO.8)
[0126] 結果顯示，OsPEXll基因在過表達植株和干擾植株中分別顯著高于和低于野生型； 在鹽脅迫誘導下，過表達植株中OsPEXII基因的轉錄水平顯著高于野生型（如圖7所示），表 明OsPEXII基因響應鹽脅迫，且該基因過表達能提高轉化植株鹽脅迫的耐受性。
[0127] 二、OsPEXII基因過表達和干擾植株的生理生化分析
[0128] W上述鹽脅迫處理下的幼苗植株為試驗材料，進行相關生理生化指標測定，包括 Na7K+離子比，丙二醒(MDA)、抗氧化酶活性(ROS)和脯氨酸(Proline)。主要測定方法參照文 南犬(Munns R,Wallace PA,Teakle NL,et al.Measuring soluble ion concentrations(Na + ,K+,Cr)in salt-treated plants.Plant Stress Tolerance,Humana Press,2010,371-382；Hodges DM,DeLong JM,Forney CF,et al. Improving the thiobarbituric acid-re曰ctive-subst曰nces assay for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and other interfering compounds[J].Planta,1999,207: 604-611;Dhindsa SR and Matowe !.Drought tolerance in two mosses: correlated with enzymatic defence against lipid peroxidation[J].Journal of Experimental Botany ,1981,32:79-91;Rao L,Perez D,White E.Lamin proteolysis facilitates nuclear events during 曰poptosis[J].Journ曰I of Cell Biology,1996,135:1441-1455;Aebi HXatalases[J].Journal of Clinical 化thology,1984,2:673-684;Bates L,Waldren R,Teare I.Rapid determination of free proline for water stress studies[J].Plant and Soil,1973,39:205-207)。
[0129] 在對照(水處理)條件下，化Vr離子比在野生型、OsPEXl I基因過表達和干擾植株 中沒有顯著差異。但在200mM化Cl脅迫處理下，野生型、過表達植株和干擾植株的鋼離子和 鐘離子含量均升高，且過表達植株化7K+比率顯著低于野生型和干擾植株(如表1和圖8A所 示)。
[0130] 表1不同處理條件下S種基因型植株中Na+和r含量
[01311
[0132] 注:相同字母代表5 %水平上無顯著差異。
[0133] 進一步的鹽脅迫下生理生化指標的測定，如圖8B-8F所示，兩個過表達植株丙二醒 的積累相對于野生型植株低了 15.39 % (OE1)和29.14% (0E2)，而SOD，POD，CAT的酶活性顯 著增加(0E1:5.00，1.35和1.78倍;0E2:6.88，1.39和1.85倍）。同時，過表達植株脯氨酸的積 累與抗氧化酶活性的變化趨勢一致，分別提高了 3.81倍(OEl)和4.46倍(0E2)。
[0134] W上結果從生理生化水平上表明Os陽Xll基因過表達能增加抗氧化酶活性W及脯 氨酸積累，從而降低膜脂的過氧化水平，提高轉化植株的耐鹽性。
[0135] =、0sPEXll基因過表達和干擾植株的相關耐鹽基因表達情況分析
[0136] W上述鹽脅迫處理下的幼苗植株為試驗材料，對=種基因型幼苗植株的鹽脅迫7 個相關基因的表達情況進行分析，內參基因引物序列同SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6,其它 基因引物序列如下：
[0137] qRT-0sWT2;l-F:TGCATTCATCACTGAGAGGAG(SEQIDN0.9)
[0138] qRT-Os服T2;1-R:GGTGCAGTTTCTGCAACCTC(SEQ ID N0.10)
[0139] qRT-Os服T1;5-F:CCCATCAACTACAGCGTCCT(沈Q ID NO.ll)
[0140] qRT-0sWTl;5-R:AGCTGTACCCCGTGCTGA(SEQIDN0.12)
[0141] qRT-〇sLti6a-F：CCTTCCAAGGTGATGGTGAA(SEQ ID NO.13)
[0142] qRT-〇sLti6a-R：CCGTCCAAAGAACCAGAAAA(SEQ ID NO.14)
[0143] qRT-OsLti化-F:GCTCCAAACCGCTTCATCTA(SEQ ID N0.15)
[0144] qRT-OsLti化-R:CAAGAATTGGAGCACTCAGGA(SEQ ID N0.16)
[0145] qRT-〇sSOSl-F:ATACTGAGTGGGGTTGTTATTGC(沈Q ID N0.17)
[0146] qRT-〇sSOSl-R：AAAGGTAAATTTCAAAAGGTACATGG(SEQ ID NO.18)
[0147] qRT-〇sNHXl-F：AATGATCACCAGCACCATCA(SEQ ID NO.19)
[014引 qRT-OsN冊1-R:AAGGCTCAGAGGTGACAGGA(SEQ ID N0.20)
[0149] qRT-〇sAKTl-F：GAAACGAGCAATGCGTCAG(SEQ ID NO.21)
[0150] qRT-〇sAKTl-R:CTTCTCACACAGCGCTTCC(沈Q ID N0.22)
[0151] 結果表明，相對于野生型，鋼離子轉運基因（Os皿T2; I和OsHKTl; 5)的轉錄水平在 過表達植株和干擾植株中分別顯著上調和下調（如圖9A和9B所示）；另外，細胞鋼離子外排 基因（OsLtiGa和OsLtiGb)，鋼氨離子逆向轉運基因 （OsSOSl )，液泡鋼鐘氨離子逆向轉運基 因（OsNHXl)和鐘離子轉運基因（OsAKTl)的轉錄水平在過表達植株和干擾植株中剛好相反 (如圖9C-9G所示），W上結果從分子水平上表明Os陽Xll基因具有耐鹽的生物學功能。
[0152] 四、過表達植株與干擾植株細胞超微結構觀察
[0153] 在對照（水處理)條件下，野生型與過表達植株的細胞器形態正常，葉綠體呈楠圓 形，基粒和基質內囊體有序排列，層狀結構緊湊，葉綠體外膜完整且含有大體積的淀粉粒 (如圖IOA和IOB所示）；干擾植株的葉綠體呈圓形，周圍線粒體腫脹(如圖IOC所示）。
[0154] 在鹽脅迫處理下，野生型植株的葉綠體形態結構發生變化，少量基粒片層和類囊 體呈堆疊狀且不規則(如圖IOD所示）；過表達植株的內囊體和葉綠體都保持相對的正常形 態(如圖IOE所示），而干擾植株的線粒體等細胞器均呈現異常形態(如圖IOF所示）。
【主權項】
1.OsPEXl 1基因在提高水稻耐鹽性中的應用，其特征在于，所述OsPEXl 1基因的堿基序 列為 0s03g0302000。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，包括:構建包含所述OsPEXl 1基因的過表達載 體，通過農桿菌介導將OsPEXll基因轉入水稻細胞，培養生成水稻耐鹽植株。3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述過表達載體為pi 300-Ubi。4. 如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述農桿菌為EHA105。5. 與水稻親環素蛋白CYP2互作的蛋白OsPEXll在提高水稻耐鹽性中的應用，其特征在 于，所述蛋白OsTOXll的編碼基因為0s03g0302000,所述親環素蛋白CYP2的編碼基因為 0s02g0121300〇
【文檔編號】A01H5/00GK105838722SQ201610317903
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月13日
【發明人】劉宏波, 崔鵬, 周偉軍, 阮松林, 李蘭
【申請人】浙江農林大學