專利名稱：通過樹突細胞凝集素樣氧化型ldl受體-1(lox-1)激活人抗原呈遞細胞的制作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及免疫細胞活化領域，更具體而言，涉及用于通過 LOX-l受體激活免疫細胞的組合物和方法。
背景技術：
不限制本發明的范圍，對與樹突細胞活化相關的背景進行描述。 樹突細胞通過提供可溶性的細胞間信號然后病原體識別而在控制先天 性和獲得性免疫之間的界面中起關鍵作用。樹突細胞的這些功能極大地依賴 于特定的表面受體"模式識別受體"(PRR),最顯著的代表為toll樣受體(TLR) 和C型凝集素或凝集素樣受體(LLR)的表達(2-4)。
在當前模式中，TLR的主要作用是提醒DC產生白細胞介素12 (IL-12) 和其他炎癥性細胞因子以起始免疫應答。C型LLR作為巨噬細胞和樹突細 胞中強大的抗原捕獲和攝取機制的組成部分起作用(2)。然而，與TLR相比， LLR可能具有更為廣闊的生物學功能，包括細胞遷移(5)和細胞間相互作用 (6)。 LLR具有這些多重功能可能是由于不同于TLR， LLR能夠識別自身和 非自身的事實。LLR的復雜性，包括在免疫細胞中表達大量LLR的冗余性， 這些已經成為了解各個LLR的詳細功能的主要障礙之一。此外，大部分這 些受體的天然配體仍然未被確定。雖然如此，最近研究的證據表明，在微生 物感染過程中，LLR與TLR協作，對激活免疫細胞產生作用(7-15)。
發明概述
本發明包括用于靶向和使用抗人LOX-l單克隆抗體(mAb)的新的組合 物和方法，并表征了其生物學功能。證明所述抗LOX-l mAb及其片段對于 靶向、表征和活化免疫細胞是有用的。本發明的發明人認識到，盡管LOX-l 能夠指導替代抗原內在化入人DC中，但是本發明鑒定并使用LOX-l的新生 物活性以在免疫系統中產生特別期望的變化， 一些改變在抗原4聶取(例如接 種疫苗)方面，其他通過LOX-l效應器的獨特作用(單獨或與其他免疫調節分 子一起)，該效應器能夠通過DC、 B細胞、單核細胞上的該受體引發信號傳 導。本發明公開了開發能夠活化具有LOX-l的細胞的獨特試劑(agent)的方法，以及在接受這些信號的細胞中產生的變化關于對免疫系統中其他細胞的 作用的影響。這些影響[單獨或與其他信號一起(即共刺激)]對于某些疾病狀 態的治療結果或對于增強疫苗相關的保護性結果是高度預測的。
LOX-l最初作為內皮細胞上的氧化型低密度脂蛋白(OxLDL)受體被鑒 定，其與動脈粥樣硬化的關系已被廣泛研究。OxLDL介導的內皮活化、功 能異常和損傷在動脈粥樣硬化的非常早期階段的發展中起重要作用。已報道 LOX-l介導OxLDL信號傳導，誘導活性氧物質產生，NF-kB活化介導的內 皮素-1、 MCP-1和粘附分子的表達上調以及細胞凋亡。雖然LOX-l被分類 為D型清道夫受體，但是已經表明，OxLDL通過巨噬細胞的胞吞作用，導 致泡沫細胞形成，主要由其他清道夫受體介導。已報道LOX-l能內化入細 胞凋亡/衰老細胞。LOX-l也能識別細菌成分。已在未成熟髓樣DC以及單 核細胞衍生的DC、單核細胞、巨噬細胞和B細胞中觀察到LOX-l的表達。
DC能交叉呈遞蛋白抗原(Rock KL Immunol Rev. 2005 Oct; 207: 166-83)。 在體內，DC通過大量的受體攝取抗原，并呈遞I類和II類兩類抗原肽。具 體而言，LOX-l是"模式識別"受體，其有效:懾取抗原并交叉呈遞抗原肽 (Delneste Y Immunity 2002 17:353)。實際上，在小鼠才莫型中，與抗LOX-l 結合的抗原足以誘導針對攻擊腫瘤的免疫應答。然而，僅通過LOX-l (l)不 能觀察到細菌成分的活化，已表明共定位的TLR2負責活化信號傳導。在 LOX-l中，已知胞質酪氨酸殘基和跨膜陽離子氨基酸均不具有信號傳導功 能。 '
本發明包括用于增加LOX-l表達性抗原呈遞細胞抗原呈遞效力的組合 物和方法，包括分離能激活抗原呈遞細胞的LOX-l特異性抗體或其片l^, 和使所述抗原呈遞細胞與抗LOX-l特異性抗體或其片段接觸，其中所述抗 原呈遞細胞被活化。所述抗原呈遞細胞可以是分離的樹突細胞、外周血單核 細胞、單核細胞、髓樣樹突細胞及其組合。所述抗原呈遞細胞可以是已在體 外與GM-CSF和IL-4、干擾素a、抗原及其組合一起培養的分離的樹突細胞、 外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、髓樣樹突細胞及其組合。所述方法還 可包括與GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸抗原呈遞細胞活化的步驟，其中 與LOX-l特異性抗體或其片段接觸增加抗原呈遞細胞上的CD86和HLA-DR 的表面表達。例如，所述抗原呈遞細胞可以是樹突細胞，所述樹突細胞已與 LOX-l特異性抗體或其片段、GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸以活化該樹 突細胞，其中活化的樹突細胞增加CD86、 CD80和HLA-DR的表面表達。 在另一個實例中，所述抗原呈遞細胞可以是樹突細胞，所述樹突細胞已與 LOX-l特異性抗體或其片段、GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸以活化該樹 突細胞，其中活化的樹突細胞增加IL-12p40、 MCP-1、 IL-8、 TNFa、 IL-6、MIP-la和IL-lb及其組合的分泌，和/或可增加其與通過CD40信號傳導有關 的活化。還已發現，所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突細胞已與 GM-CSF和IL-4或千擾素a接觸，且LOX-l特異性抗體或其片段增加了樹 突細胞的共刺激活性。在暴露于本發明的LOX-l特異性抗體或其片段時表 達譜(expressionprofile)改變的基因的特定實例包括圖4中所示的一個或多個 基因。LOX-l特異性抗體或其片段的非限制性實例可選自克隆9D7-10-4、 8B4-10-2、 11C8-B7、 13B11-A8及其組合。LOX-l特異性抗體或其片段通過 LOX-l活化的樹突細胞能夠激活B細胞、T細胞及其組合。
本發明還包括重組抗體(rAb),其中LOX-l特異性抗體或其片段與 Cohesin/Dockerin對的一半結合。作為rAb —部分的LOX-l特異性抗體或其 片段可與Cohesin/Dockerin對的一半結合，該對的另一半可與一種或多種細 胞因子結合，所述細胞因子選自白細胞介素，轉化生長因子(TGF)，成纖維 細胞生長因子(FGF),血小板衍生生長因子(PDGF)，表皮生長因子(EGF),結 締組織活性肽(CTAP),成骨因子，以及這些生長因子的生物活性類似物、片 段和衍生物，B/T細胞分化因子，B/T細胞生長因子，促有絲分裂細胞因子， 趨化細胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a, IFN-(3, IFN畫y, IL1， IL2， IL3， IL4， IL5, IL6, IL7, IL8， IL9, ILIO， IL11, IL12, IL13, IL14, IL15， IL16, IL17, IL18等，瘦素(leptin),肌肉生長抑制素 (myostatin)，巨噬細胞刺激蛋白，血小板衍生生長因子，TNF-a， TNF-(3, NGF， CD40L, CD137L/4-lBBL，人淋巴毒素-p, G-CSF， M畫CSF， GM-CSF, PDGF, IL-la， ILl-(3， IP-10, PF4， GRO， 9E3,促紅細胞生成素，內皮抑 素(endostatin),血管抑素(angiostatin), VEGF,包括卩轉化生長因子(例如 TGF-卩1、 TGF-卩2、 TGF-(33)在內的轉化生長因子(TGF)超基因家族；骨形態 發生蛋白(例如BMP隱1、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP隱6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結合生長因子(成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長 因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF));抑制 素(例如抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例 如活化素A、活化素B、活化素AB)。
本發明還包括表達LOX-l特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述 LOX-l特異性抗體或其片段激活抗原呈遞細胞以表達新的表面標記物、分泌 一種或多種細胞因子或表達新的表面標記物和分泌一種或多種細胞因子兩 者。雜交瘤的非限制性實例包括克隆9D7-10-4、8B4-10-2、11C8-B7、13B11-A8 及其組合。
本發明還包括通過在抗原存在下用LOX-l特異性抗體或其片段觸發樹 突細胞上的LOX-l受體來增強B細胞免疫應答的方法，其中已與LOX-l活化的樹突細胞接觸的B細胞增加抗體產生、分泌細胞因子、增加B細胞活化表面標記物表達及其組合。使用本發明活化的B細胞可分泌IL-8、MIP-la、 IL-6、 TNFa及其組合，可以是漿細胞，活化B細胞以表達LOX-l,和/或觸 發B細胞以增加IgG、 IgM、 IgA及其組合的產生。在另一種方法中，本發明包括通過用LOX-l特異性抗體或其片段觸發B 細胞上的LOX-l受體來增強B細胞免疫應答，其中所述B細胞增加抗體產 生，分泌IL-8、 MIP-la、 IL-6、 TNFa及其組合，和/或增加IgG、 IgM、 IgA 及其組合的產生。本發明還包括通過用LOX-l特異性抗體或其片段觸發樹突細胞上的 LOX-l受體，并使T細胞與該LOX-l活化的樹突細胞接觸來增強T細胞活 化的方法，其中T細胞的活化被增強。所述樹突細胞可與GM-CSF和IL-4、 干擾素a、抗原及其組合接觸，并引起CD8十T細胞的活化。在一個實施方 案中，T細胞暴露于用抗LOX-l抗體或其片段活化的樹突細胞時增殖。本發明還包括由哺乳動物細胞分泌的抗LOX-l免疫球蛋白或其部分和 與該免疫球蛋白結合的抗原，其中所述免疫5求蛋白耙向所述抗原至抗原呈遞 細胞。該免疫球蛋白可包含一個或多個抗原特異性結構域，所述結構域選自 全長抗體、抗體可變區結構域、Fab片^:、 Fab，片革史、F(ab)2片段、和Fv片 段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段。該抗體或其片段可 用于生產疫苗，該疫苗包含用LOX-l特異性抗體或其片段活化的樹突細胞。本發明還包括單獨或與共激活劑一起結合(engage)免疫細胞上的LOX-l 受體，組合活化抗原呈遞細胞的試劑用于治療性應用的用途；免疫細胞上的 LOX-l結合劑用于制備疫苗的用途，所述LOX-l結合劑與或不與激活劑一 起與一個或多個抗原連接；抗LOX-l劑作為免疫細胞共激活劑用于增強通 過免疫細胞上表達的除LOX-l外的細胞表面受體引起的免疫應答的用途； 能夠通過LOX-l受體結合并活化免疫細胞的抗LOX-l抗體V區序列的用途 和/或與一種或多種毒性劑連接的DC-LOX-l結合劑用于在已知或懷疑由經病理(pathogenic)細胞或組織的情況下的治療性目的的用途。本發明還包括模塊式rAb載體，其包含LOX-l特異性抗體結合結構域， 該結合結構域與一個或多個包含cohesin-dockerin結合對的一半的抗原載體 結構域連接。rAb的抗原特異性結合結構域包含抗體的至少一部分，例如， 抗原特異性結合結構域可以包含與cohesin-dockerin結合對的一半構成融合 蛋白的抗體的至少一部分。所述rAb可包含與抗原結合的cohesin-dockerin 結合對的互補性一半(complementary half)，其中該抗原與模塊式rAb載體形 成復合物，或與抗原構成融合蛋白的cohesin-dockerin結合對的互補性一半。該抗原特異性結合域可以是全長抗體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab， 片段、F(ab)2片段、和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的 Fab片段。附圖的簡^^說明為了更完整地理解本發明的特征和優點，現在參考發明詳述以及附圖， 在附圖中

圖1A、 1B和1C:體內和體外培養的DC均表達LOX-l。圖1A:來自 正常供體的PBMC用抗CDllc、 CD14、 CD19和CD3以及抗LOX-l mAb 染色。對用各個抗體染色的細胞作門用于測量LOX-l的表達水平。圖1B: 在GM-CSF與IL-4 (IL-4DC)或IFNa (IFNDC)存在下培養來自正常供體的單 核細胞，細胞用抗LOX-l mAb染色。髓樣DC (Lin-HLA-DR+CD1 lc+CD123-) 通過FACS分選儀從血中純化，并用抗LOX-l mAb染色。圖1C顯示在溶液中捕獲LOX-l胞外結構域的結合等級次序 15C4〉10F9〉1G6》商購的抗LOX畫l。 15C4-10畫l是15C4.1來自最初15C4雜 交瘤的兩個亞克隆的兩個獨立的抗體制備物。圖2A和2B顯示抗LOX-l mAb激活DC。將IFNDC在包凈皮有不同克隆 的mAb的培養板中培養18小時。圖2A:細胞用抗CD86染色。圖2B:分 析培養物上清液，通過Luminex測定細胞因子和趨化因子。圖3A和3B顯示抗LOX-l mAb激活DC。圖3A:用抗L0X-1刺激IL-4DC 24小時，隨后細胞用抗CD86和HLA-DR染色。圖3B:髓樣DC通過FACS 分選從血中純化，細胞用抗CD-86、 CD80和HLA-DR染色。圖4顯示基因表達譜，用抗L0X-1或對照mAb刺激IL-4DC 10小時。 用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA,用2100生物分析器(Agilent)分析。使用 Illumina totalprep標記試劑盒(Ambion)制備生物素標記的cRNA草巴標，雜交 至Sentrix Human6 BeadChips (46K轉錄物)上。這些微陣列由50mer寡核香 酸探針組成，該寡核苷酸探針附著于位于在硅片表面上蝕刻的微孔內的3um 珠上。用鏈霉抗生物素-Cy3染色后，用Illumina制造的亞微米分辨掃描儀 (Beadstation 500X)對陣列表面成像。使用基因表達分析軟件程序GeneSpring, 7.1版本(Agilent)進行數據分析。圖5A和5B顯示用抗LOX-l活化的DC產生的細胞因子和趨化因子的 量增加。體外培養的IL-4DC和純化的mDC(lxl05/200ul)，分別如圖1A和 1B所示，在包被有抗LOX-l mAb(2ug/孑L)的平板中孵育18小時。分析培養 物上清液，通過Luminex測定細胞因子和趨化因子。圖6A和6B顯示抗LOX-l抗體和CD40配體協同激活DC。在可溶性 CD40L (20 ng/ml)存在或不存在下，在包被有抗L0X-1的96孔板中培養 IL-4DC (2xl05/200 ul/孔)18小時。還測試了對照mAb。 18小時后，細胞用 抗-CD83染色，分析培養物上清液，并通過Luminex測定細胞因子和趨化因子。圖7A至7F顯示在DC上表達的L0X-1有助于增強體液免疫應答。將 6天GM/IL-4 DC, 5xl0V孔，在包^皮有抗L0X-1或對照mAb的96孔板中培 養16-18小時，隨后與用CFSE染色的lx105自體CD19+B細胞在20單位/ml IL-2和50 nM CpG的存在下共培養。圖7A顯示第6天用熒光標記的抗體染 色的細胞的染色。作門除去(gateout)CD3+和7-AAD+細胞。通過FACS分選 儀純化CD38+和CFSE-細胞，并進行吉姆薩染色。圖7B顯示通過夾心ELISA 分^f第13天的培養物上清液的總IgM。圖7C顯示用5moi熱滅活的流感病 毒(PR8)脈沖刺激，并與B細胞培養的DC。在第13天分析培養物上清液的 流感病毒特異性免疫球蛋白(Ig)。圖7D顯示在mAb包被的平板中在含50 nM CpG(下組)或不含(上組)下培養的來自血沉棕黃層的CFSE標記的5xl05 PBMC的結果。第7天用抗CD38染色細胞。作門除去CD3+和7-AAD+細胞。 圖7E顯示在第13天通過ELISA分析來自PBMC培養物的培養物上清液測 定總Ig。圖7F是6天GM/IL-4 DC在mAb包被的平4反中培養48小時的結 果，APRIL的表達水平通過細胞的胞內染色測定。虛線是用對照抗體染色的 細胞。細和粗線分別代表在包被抗LOX-l或對照mAb的平板中孵育的細胞。 數據是每次使用來自3個不同正常供體的細胞進行的兩個單獨實驗的代表。圖8A到8C顯示在B細胞上表達的LOX-l有助于B細胞活化和生產免 疫球蛋白。圖8A顯示來自血沉棕黃層的PBMC用抗CD19、抗CD3和抗 LOX-l或對照mAb染色。對CD19+細胞作門，通過流式細胞4義測定CD19+ B 細胞上的分子表達水平。圖8B顯示在包被mAb的平板中培養CD19+ B細 胞16-18小時，隨后通過Luminex分析培養物上清液的細胞因子和趨化因子。 圖8C顯示lx105 CD19+ B細胞在包被有mAb的平板中培養13天。通過 ELISA測定總Ig水平。數據是使用來自3個不同正常供體的細胞進行的兩 個單獨實驗的代表。圖9A到圖9D顯示在DC上表達的LOX-l有助于增強細胞免疫應答。 圖9A顯示了 5xl03 6天GM/IL-4 DC在包被有抗LOX-l或對照mAb的平板 中培養16-18小時，隨后與純化的同種異源T細胞共培養。細胞用3[司脫氧 胸腺嘧啶核苦l uCi/孔脈沖18小時后收集。通過(3計數器測量s[H]-脫氧胸 腺嘧咬核香的吸收。圖9B和9C顯示在20 uM Mart-肽(A)或27 ug/ml Mart-l 重組融合蛋白(B)存在下，6天GM/IL-4 DC (5xl0"孔)在包被mAb的平板中孵育16小時。與2xl(^純化的自體CD8T細胞共培養10天。在第2天，向 培養物中加入20單位/ml IL-2和10單位/ml IL-7。細胞用抗CD8和Mart-l 四聚體染色。圖9C顯示來自血沉椋黃層的5xl05PBMC,其在用mAb包被 的平板中與0.1 uM Flu Ml肽培養一周。細胞用抗CD8和Mart-l四聚體染色。 D.將IL- 4DC與10或1 nM抗LOX-l -Flu Ml或對照Ig-FIu Ml融合蛋白混 合2小時，與2xl04屯化的自體CD8T細胞共培養7天。細胞用抗CD8和 Flu Ml特異性四聚體染色。圖IO顯示來自非人靈長類(食蟹猴)的PBMC用抗L0X-1 mAb和細胞表 面標記物的抗體染色。圖11顯示典型rAb.抗原融合蛋白的還原型SDS-PAGE分析，所述蛋白 包括抗LOX-U5C4.PSA,其能指導前列腺特異性抗原(加亮的灰色)至抗原 呈遞細胞的表面，用于針對前列腺癌的疫苗接種。圖12顯示抗LOX-l.Doc:Coh.Flu Ml復合物將Flu Ml遞送至用LOX-l cDNA轉染的CHO細胞表面。1 ug/ml (紅點)的抗LOX-l.Doc rAb或對照 hlgG4.Doc rAb (綠點)與生物素化的Coh.Flu Ml (2 ug/ml)于室溫下一起孵育 l小時，加入轉染的CHO細胞，繼續在冰上孵育20分鐘。隨后洗滌細胞， 用PE標記的鏈霉抗生物素染色。細胞隨后進行PE焚光分析(X軸為強度)。 抗LOX-l.Doc復合物對未轉染的CHO細胞數做圖顯示為黃色。圖13顯示人扁桃體切片的抗LOX-l mAb染色。染色為紅色的細胞是生 發中心周圍區域中的特定的含LOX-l細胞群。該組織和抗LOX-l mAb染色明開發^]于例如抗原乾向的mAb i特異性的，以及具有LOX-l的;田胞在體 內存在-是治療性抗LOX-l劑的現成耙標。圖14A和14B顯示通過用抗LOX-l mAb活化的DC的B細胞的粘膜歸果。圖15顯示抗LOX-l mAb有助于提高IgAl和IgA2的產生。圖18顯示抗LOX-l疫苗能引起DC亞型特異性的免疫應答。圖19顯示抗LOX-l抗體對短尾猴LOX-l的交叉反應性。圖20顯示來自短尾猴的4個序列變體(5U1-5U4)與人LOX-1的Clustal W比對。圖21A至21D顯示通過LOX-l遞送的抗原導致抗原特異性的CD4 T細 胞應答。發明詳述盡管以下詳細討論本發明的不同實施方案的制備及使用，但是應該理解 本發明提供了許多可以在多種特定情況下具體實施的可應用的發明構思。本 文討論的特定實施方案僅僅是說明制備和使用本發明的特定方法，而不限定 本發明的范圍。為便于理解本發明，許多術語定義如下。本文定義的術語具有與本發明 相關的領域中的普通技術人員通常理解的含義。術語諸如"一個"、"一種"、" 該"等不意欲僅僅指單數實體，而是包括其中特定實例可以用于例證的總的 類別。本文術語用于描述本發明的特定實施方案，但是它們的用法并不限制 本發明，除非在權利要求中概述的。如本文所用，術語"模塊式rAb載體"用于描述重組抗體系統，該系統被 工程化以提供不同的抗原、活化蛋白質或其它抗體以受控的模塊式方式加入 單一重組單克隆抗體(mAb),在本案中，抗LOX-l單克隆抗體。rAb可以是 使用標準雜交瘤技術、重組抗體展示、人源化單克隆抗體等制備的單克隆抗 體。模塊式rAb載體可用于，例如，(通過一種針對例如人樹突細胞受體的 內在化受體的原發重組抗體)靶向多個抗原和/或抗原與活化的細胞因子至樹 突細胞(DC)。模塊式rAb載體還可以用于以受控且確定的方式首尾相連地連 才妾兩種不同的重組mAb。"模塊式rAb載體"的抗原結合部分可以是一種或多種可變結構域、 一種 或多種可變結構域與第一恒定結構域，Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片^殳和 Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段，同源的模塊 式結合部分添加到氨基酸序列和/或與其結合。模塊式rAb載體中使用的抗 體可以是任何同型或類別、亞類或者來自任何來源(動物和/或重組體)。在一個非限制性實施例中，模塊式rAb載體被工程化為具有一種或多種 模塊式cohesin-dockerin蛋白質結構域，用于制備在工程化的重組mAb情況 下的特異且明確的蛋白質復合物。mAb是包括一種或多種來自mAb的抗原 結合結構域的模塊式cohesin-dockerin蛋白質結構域羧基的融合蛋白的一部 分。cohesin-dockerin蛋白質結構域甚至可以在翻譯后，例如使用化學交聯劑 和/或二硫鍵連接。本文使用的術語"抗原"指的是可以在該抗原的接受者中啟動體液和/或 細胞免疫應答的分子。抗原可以用于本發明的兩種不同情況中作為抗體或 rAb的其它抗原識別結構域的靶標或者作為分子，該分子通過模塊式rAb載 體的dockerin/cohesin-分子補體的一部分的rAb運送到和/或進入細月包或輩巴 標。抗原通常是引起疾病的試劑，對于該疾病，疫苗接種可能是有益的治療。 當抗原被呈遞在MHC上時，該肽通常是約8到約25個氨基酸。抗原包括任 何類型的生物分子，包括，例如，筒單的中間代謝物、糖、脂質和激素以及大分子諸如復合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白質。抗原的常見種類包括但 不限于病毒抗原，細菌抗原，真菌抗原，原生動物及其他寄生蟲抗原，腫瘤 抗原，自身免疫性疾病、過敏癥和移植排斥中涉及的抗原，及其他各種抗原。
模塊式rAb載體能夠運載許多活化劑，例如抗生素、抗感染藥、抗病毒
藥、抗胂瘤藥、解熱藥、鎮痛藥、抗炎藥、骨質疏松癥的治療劑、酶、細胞 因子、抗凝血藥、多糖、膠原、細胞及兩種或更多前述活化劑的組合。使用 本發明遞送的抗生素的實例無限制地包括四環素、氨基糖苷類、青霉素、頭 孢菌素、磺胺類藥物、氯霉素琥珀酸鈉、紅霉素、萬古霉素、林可霉素、克
林霉素、制霉菌素、兩性霉素B、金剛烷胺、碘苷、對氨基水楊酸、異煙肼、 利福平、放線菌素D、光輝霉素、道i若霉素、阿霉素、博來霉素、長春^^、 長春新堿、曱基千肼、咪唑曱酰胺等等。
使用本發明遞送的抗腫瘤藥的實例無限制地包括阿霉素、柔紅菌素、紫 杉醇、氨曱喋呤等等。解熱藥和鎮痛藥的實例包括阿司匹林、美林(Motrin⑧) 布洛芬(Ibuprofen⑧)、萘普生、醋氨酚等等。
使用本發明遞送的抗炎藥的實例無限制地包括NSAIDS、阿司匹林、甾 族化合物、地塞米松、氫化可的松、潑尼爭>龍、雙氯芬酸鈉等等。
使用本發明遞送的治療骨質疏松癥的治療劑和作用于骨和骨骼的其它 因子的實例無限制地包括鉤，阿侖膦酸鹽，骨GLa肽，曱狀旁腺激素及其活 性片段，組蛋白H4相關骨形成和增殖肽及其突變體、衍生物和類似物。
使用本發明遞送的酶和酶輔因子的實例無限制地包括胰酶(pancrease)、 L-天冬酰胺酶、透明質酸酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、鏈激酶、尿 激酶、胰酶制劑、膠原酶、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、血纖維蛋白溶酶 原、鏈激酶、腺苷酸環化酶、過氧化物歧化酶(SOD)等等。
使用本發明遞送的細胞因子的實例無限制地包括白細胞介素，轉化生長 因子(TGF),成纖維細胞生長因子(FGF),血小板衍生生長因子(PDGF),表皮 生長因子(EGF),結締組織活化肽(CTAP)，成骨因子及這些生長因子的生物 活性類似物、片段和衍生物。細胞因子可以是B/T細胞分化因子、B/T細胞 生長因子、促有絲分裂細胞因子、趨化細胞因子、集落刺激因子、血管生成 因子、IFN-a、 IFN-卩、IFN畫y、 IL1 、 IL2、 IL3、 IL4、 IL5、 IL6、 IL7、 IL8、 IL9、 ILIO、 ILll、 IL12、 IL13、 IL14、 IL15、 IL16、 IL17、 IL18等、瘦素、 肌肉生長抑制素、巨噬細胞刺激蛋白、血小板衍生生長因子、TNF-a、 TNF-卩、 NGF、 CD40L、 CD137L/4畫1BBL、人淋巴毒素畫卩、G隱CSF、 M-CSF、 GM-CSF、 PDGF、 IL-la、 ILl-卩、IP-IO、 PF4、 GRO、 9E3、促紅細胞生成素、內皮抑 素、血管抑素、VEGF或其任何片段或組合。其它細胞因子包括轉化生長因 子(TGF)超基因家族成員，包括卩轉化生長因子(例如TGF-pi、 TGF-P2、TGF-P3);骨形態發生蛋白質(例如，BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結合生長因子(例如成纖維細胞生 長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣 生長因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如， GDF-1);以及活化素(例如，活化素A、活化素B、活化素AB)。
來源諸如^Mv哺乳動物細胞分離的，或可以合成地制備諸如通過重組DNA l支 術或通過多種化學方法制備的生長因子。此外，可以使用這些因子的類似物、 片段或衍生物，只要它們顯示天然分子的至少一些生物活性。例如，可以通 過表達位點特異性突變或其它遺傳工程技術改變的基因來制備類似物。
使用本發明遞送的抗凝血藥的實例無限制地包括華法林、肝素、水蛭素 等等。使用本發明遞送的作用于免疫系統的因子的實例無限制地包括控制炎 癥和惡性贅生物的因子以及攻擊感染性微生物的因子，諸如趨化肽和緩激 肽。
病毒抗原的實例包括但不限于，例如，逆轉錄病毒抗原，諸如來自人免 疫缺陷病毒(HIV)的逆轉錄病毒抗原，諸如gag、 pol和env基因的基因產物， Nef蛋白，逆轉錄酶及其他HIV元件；肝炎病毒抗原，諸如乙型肝炎病毒的 S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒和其它肝炎例如曱、乙和丙型肝炎病毒的pre-S 抗原，病毒元件諸如丙型肝炎病毒RNA;流感病毒抗原，諸如血球凝集素 和神經氨酸酶及其他流感病毒元件；麻滲病毒抗原，諸如麻滲病毒融合蛋白 及其他麻滲病毒元件；風滲病毒抗原，諸如蛋白El和E2及其他風滲病毒元 件；輪狀病毒抗原，諸如VP7sc及其他輪狀病毒元件；巨細胞病毒抗原，諸 如包膜糖蛋白B及其他巨細胞病毒抗原元件；呼吸道合胞體病毒抗原，諸如 RSV融合蛋白、M2蛋白及其他呼吸道合胞體病毒抗原元件；單純性皰滲病 毒抗原，諸如立即早期蛋白質、糖蛋白D及其他單純性皰滲病毒抗原元件； 水痘帶狀皰瘆病毒抗原，諸如gpl、 gpll及其他水痘帶狀皰滲病毒抗原元件； 日本腦炎病毒抗原，諸如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS1、 NS1-NS2A、 80% E及其他日本腦炎病毒抗原元件；狂犬病病毒抗原，諸如狂犬病糖蛋白、狂 犬病核蛋白及其他狂犬病病毒抗原元件。關于病毒抗原的其他實例，參見 Fundamental Virology,第二版，編著Fields, B. N.和Knipe, D. M.(Raven Press, New York, 1991)。
可以使用本發明的rAb-DC/DC-抗原疫苗遞送的抗原靶標包括編碼抗原 諸如病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原的基因。病毒包括微小核 jf唐才玄酸病毒、冠一犬病毒、4皮蓋病毒、黃病毒、^HM犬病毒、副粘病毒、正粘病 毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸孤病毒、逆轉錄病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰滲病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和海綿狀病毒。其它病毒靼標包
括流感、單純皰滲病毒1和2、麻滲、登革熱、天花、脊髓灰質炎或HIV。
病原體包括錐蟲、絳蟲、蛔蟲、蠕蟲、瘧疾。腫瘤標記物諸如胚胎抗原或前
列^^特異性抗原可以以這個方法靶向。其它實例包括HIVenv蛋白和乙型 肝炎表面抗原。根據本發明用于疫苗接種目的的載體的給予可能要求載體結 合的抗原是足夠非免疫原性的以使得轉基因能夠長期表達，對此可期望強烈 的免疫應答。在一些情況下，個體的疫苗接種可僅是不經常地需要，諸如每 年或每兩年一次，并提供對傳染物的長期免疫保護。本發明用于載體中并最 終作為抗原的生物體、過敏原及核酸和氨基酸序列的特定實例可以在美國專 利6,541,011中找到，該專利的相關部分引入本文作為參考，尤其是可以用 于本發明的匹配生物體和特定序列的表格。
用于本文公開的rAb疫苗的細菌抗原包括但不限于，例如，細菌抗原， 諸如百曰咳毒素、絲狀血球凝集素、百曰咳桿菌粘附素、FIM2、 FIM3、腺 苷酸環化酶及其他百日咳細菌抗原元件；白喉細菌抗原，諸如白喉毒素或類 毒素及其他白喉細菌抗原元件；破傷風細菌抗原，諸如破傷風毒素或類毒素 及其他破傷風細菌抗原元件；鏈球菌細菌抗原，諸如M蛋白及其他鏈球菌 細菌抗原元件；革蘭氏陰性桿菌細菌抗原，諸如脂多糖及其他革蘭氏陰性細 菌抗原元件；結核分枝桿菌細菌抗原，諸如霉菌酸、熱-沐克蛋白65(HSP65)、 30 kDa主要分泌性蛋白、抗原85A及其他分枝桿菌抗原元件；幽門螺桿菌 細菌抗原元件；肺炎球菌細菌抗原，諸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多 糖及其他肺炎球菌細菌抗原元件；流感嗜血桿菌細菌抗原，諸如莢膜多糖及 其他流感嗜血桿菌細菌抗原元件；炭疽細菌抗原，諸如炭疽保護性抗原及其 他炭疽細菌抗原元件；立克次氏體細菌抗原，諸如rompA及其他立克次氏 體細菌抗原元件。本文描述的細菌抗原還包括任何其它細菌、分枝桿菌、支 原體、立克次體或衣原體抗原。部分或完整的病原體還可以是流感嗜血桿 菌；鐮狀疾原蟲；腦膜炎奈瑟氏球菌；肺炎鏈球菌；淋病奈瑟氏菌；傷寒沙 門氏菌血清型；志賀氏菌；霍亂弧菌；登革熱；腦炎；日本腦炎；萊姆病； 鼠疫耶爾森氏菌；西尼羅河病毒；黃熱病；兔熱病；肝炎(病毒性；細菌性)； RSV(呼吸道合胞病毒)；HPIV 1和HPIV 3;腺病毒；天花；過敏物和癌癥物 質。
用于本發明的組合物和方法的真菌抗原包括但不限于，例如，念珠菌屬 真菌抗原元件；組織胞漿菌屬真菌抗原，諸如熱休克蛋白60(HSP60)及其他 組織胞漿菌屬真菌抗原元件；隱球菌真菌抗原，諸如莢膜多糖及其他隱球菌 真菌抗原元件；球孢子菌真菌抗原，諸如小球體抗原及其他球孢子菌真菌抗 原元件；以及痺真菌抗原，諸如發癬菌素及其他球孢子菌真菌抗原元件。原生動物及其他寄生蟲抗原的實例包括但不限于，例如，惡性瘧原蟲抗 原，諸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、環子孢子抗原、配子母細胞/
配子表面抗原、紅內期抗原pfl55/RESA及其他痦原蟲抗原元件；弓形體屬 抗原，諸如SAG-1、 p30及其他弓形體屬抗原元件；血吸蟲屬抗原，諸如谷 胱甘肽-S轉移酶、副肌球蛋白及其他血吸蟲屬抗原元件；利什曼原蟲主要及 其他利什曼原蟲抗原，諸如gp63、磷脂聚糖及與其相關的蛋白質及其他利什 曼原蟲抗原元件；以及克氏4,蟲抗原，諸如75-77 kDa抗原、56kDa抗原及 其他錐蟲抗原元件。
可以使用本發明的rAb靶向的抗原通常基于許多因素選擇，所述因素包 括內在化的可能性、免疫細胞特異性的水平、靶向的免疫細胞種類、免疫 細胞成熟的水平和/或活化等等。用于樹突細胞的細胞表面標記物的實例包括 但不限于，MHCI類、MHCII類、B7-2、 CD18、 CD29、 CD31、 CD43、 CD44、 CD45、 CD54、 CD58、 CD83、 CD86、 CMRF-44、 CMRF-56、 DCIR和/或 DECTIN-1等等；而在一些情況下還缺失CD2、 CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD15、 CD16、 CD 19、 CD20、 CD56和/或CD57。抗原呈遞細月包的細月包表 面標記物的實例包括但不限于，MHCI類、MHCII類、CD40、 CD45、 B7-l、 B7-2、 IFN-y受體及IL-2受體、ICAM-1和/或Fcy受體。用于T細胞的細胞 表面標記物的實例包括但不限于，CD3、 CD4、 CD8、 CD14、 CD20、 CDllb、 CD16、 CD45和HLA-DR。
用于遞送的細胞表面上的耙標抗原包括通常來源于肺瘤組織細胞的細 胞表面、細胞質、細胞核、細胞器等的腫瘤抗原特征性的那些抗原。用于本 發明的抗體部分的肺瘤靶標的實例無限制地包括血液癌諸如白血病和'淋巴 瘤；神經肺瘤諸如星形細胞瘤或惡性膠質瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭和 頸癌；胃腸腫瘤諸如胃或結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖器腫瘤如宮頸、 子宮、卵巢癌，陰道癌，睪丸癌，前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤； 或唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直腸、膽嚢、膽道、喉、肺和支氣管、膀胱、 腎、腦及神經系統的其他部分、曱狀腺的癌癥；霍奇金氏病；非霍奇金氏'淋 巴瘤；多發性骨髓瘤和白血病。
實例i"腫瘤蛋白，例如i變的癌基因':與;中:相關的病毒;白:'以及月中瘤
粘蛋白和糖脂。抗原可以是與腫瘤相關的病毒蛋白，其可以是來自上文指出 的各類別病毒的病毒蛋白。某些抗原可以是腫瘤特征性的(一個亞集，是腫 瘤前體細胞通常不表達的蛋白質)，或者可以是腫瘤前體細胞中通常表達的 蛋白質，但是具有腫瘤特征性的突變。其它抗原包括具有改變的活性或亞細 胞分布的正常蛋白質的突變型變體，例如，產生腫瘤抗原的基因突變。腫瘤抗原的特定的非限制性實例包括CEA，前列腺特異性抗原(PSA), HER-2/neu， BAGE， GAGE, MAGE 1-4、 6和12, MUC(粘蛋白)(例如MUC-1 、 MUC-2等)，GM2和GD2神經節苷脂，ras, myc，酪氨酸酶，MART(黑色 素瘤抗原)，Pmel 17(gpl00), GnT-V內含子V序列(N-乙酰葡糖氨基轉移酶 V內含子V序列)，前列腺Capsm, PRAME(黑色素瘤抗原)，(3-連環蛋白， MUM-1-B(黑色素瘤遍在突變基因產物)，GAGE(黑色素瘤抗原)l, BAGE(黑 色素瘤抗原)2-10， c-ERB2(Her2/neu), EBNA(EB病毒核抗原)1-6, gp75，人 乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7， p53,肺抗性蛋白(LRP), Bcl-2，以及Ki-67。此 外，免疫原性分子可以是自身免疫性疾病的起始和/或進展中涉及的自身抗 原，該自身免疫性疾病的病理學主要是由于相關靶標器官、組織或細胞表達 的分子特異性的抗體的活性所引起，例如SLE或MG。在這些疾病中，可能 期望將進行中的針對相關自身抗原的抗體介導的(即Th2型)免疫應答指向細 胞(即Thl型)免疫應答。或者，可能期望在沒有感染，但是疑似易感染相關 自身免疫性疾病的受試者中通過預防性誘導針對適當的自身抗原的Thl反 應來防止針對自身抗原的Th2反應的起始或降低其水平。耙標自身抗原無限 制地包括(a)對于SLE, Smkh蛋白、RNP核糖核蛋白、及SS-A和SS-B蛋 白；以及(b)對于MG，乙酰膽堿受體的抗原。在一種或多種類型的自身免疫 應答中涉及的其它各種抗原的實例包括，例如，內源性激素，諸如黃體生成 素、卯泡刺激素、睪丸激素、生長激素、催乳素及其他激素。
在自身免疫疾病、過每丈癥和移植排斥中涉及的抗原可被用于本發明的組 合物和方法。例如，在任何一種或多種下列自身免疫疾病或障礙中涉及的抗 原可被用于本發明糖尿病(diabetes、 diabetes mellitus)，關節炎(包括類風濕 性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎)，多發性硬 化，重癥肌無力，系統性紅斑狼齊，自身免疫性曱狀腺炎，皮炎(包括特應 性皮炎和濕滲性皮炎)，銀屑病，斯耶格倫氏綜合征，包括繼發于斯耶格倫 氏綜合征的干燥性角膜結膜炎，斑禿，由于節肢動物叮咬反應的過敏反應， 克羅恩氏病，口瘡性潰瘍，虹膜炎，結膜炎，角膜結膜炎，潰瘍性結腸炎， 哮喘，過敏性哮喘，皮膚紅斑狼療，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥滲，麻瘋 病逆向反應，麻風結節性紅斑，自身免疫性葡萄膜炎，過敏性腦脊髓炎，急 性壞死性出血性腦病，特發性雙側累進性感覺神經性聽力喪失，再生障礙性 貧血，單純性紅細胞貧血，特發性血小板減少，多軟骨炎，韋格納氏肉芽腫 病，慢性活動型肝炎，斯-約二氏綜合征，自發性口炎性腹瀉，扁平苔癬， 克羅恩氏病，格雷夫斯眼病，結節病，原發性膽汁性肝硬化，后葡萄膜炎和 間質性肺纖維化。在自身免疫性疾病中涉及的抗原的實例包括谷氨酸脫羧酶 65(GAD 65)、天然DNA、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂蛋白脂質蛋白、乙酰膽堿受體元件、曱狀腺球蛋白和促曱狀腺激素(TSH)受體。在過敏癥中涉及的抗
原的實例包括花粉抗原諸如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麥草花粉抗原，動物來源的抗原諸如灰塵螨抗原和貓科抗原，組織相容性抗原和青霉素及其他治療性藥物。在移植排斥中涉及的抗原的實例包括移植入移植物接受者的移植物的抗原性元件，諸如心臟、肺、肝臟、胰、腎和神經的移植物元件。抗原可以是對治療自身免疫性疾病有用的改變的肽配體。
如同本文使用的，術語"表位"指的是包括與位于由病原體DNA或RNA編碼的多種病原體多肽之任何一種中的表位相似的一級、二級或三級結構的肽或蛋白質抗原。相似性的水平通常達到這樣的程度，即針對上述多肽的單克隆或多克隆抗體也會與該肽或蛋白質抗原結合、反應或識別該肽或蛋白質抗原。多種免疫測定方法可以和上述抗體一起使用，例如蛋白質印跡法、ELISA、 RIA等，所有這些都為本領域技術人員所知。適于在疫苗中使用的病原體表位和/或它們的功能等價物的鑒定是本發明的一部分。 一旦分離和鑒定，可以容易地獲得功能等價物。例如，可以使用如美國專利號4,554,101中講授的Hopp的方法，其教導根據親水性從氨基酸序列鑒定和制備表位，該文獻S1入本文作為參考。其它 一些論文中描述的方法及基于其的軟件程序也可以用于鑒定表位核心序歹'J(參見，例如，Jameson和Wolf， 1988; Wolf等，1988;美國專利號4,554,101)。然后可以容易地通過運用肽合成或重組技術把這些"表位核心序列"的氨基酸序列引入肽中。
可以把包含編碼本發明的抗原的核酸作為活性成分的疫苗組合物制劑制備為注射劑，為液體溶液或懸浮液；也可以制備適于在注射之前溶解或懸浮于液體中的固體形式。可以把制劑乳化，包封在脂質體中。通常把活性免疫原性成分與藥學上可接受并與活性成分相容的載體混合。
術語"藥學上可接受的載體"指的是在給予的受試者中不引起過敏反應或其它副作用的載體。合適的藥學上可接受的載體包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合中的一種或多種。此外，如果需要，疫苗可以包含少量的輔助性物質，諸如潤濕或乳化劑、pH緩沖劑和/或增強疫苗效力的佐劑。可能有效的佐劑的實例包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、 MTP-PE和RIBI，其包含在2。/。鯊烯/Tween 80乳劑中的三種細菌提取成分，單磷酰脂質A、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑的其它實例包括DDA (溴化二曱基雙十八烷基銨)、弗氏完全和不完全佐劑以及QuilA。此外，免疫調節物質，諸如淋巴因子(例如，IFN-y、 IL-2和IL-12)或合成的IFN-y誘導物(諸如聚I:C)可以和本文描述的佐劑聯合使用。如本發明所描述的，藥品可以包括具有單一或多拷貝的特定核苷酸序列的棵多核苷酸，該特定核苷酸序列與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定
DNA結合位點結合。多核香酸可以編碼生物活性肽、反義RNA或核酶并以生理學上可接受的可給藥形式提供。可來自本發明的另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括根據本文描述的方法從患者血液或其它來源分離的高度純化的血漿脂蛋白部分和預先結合到純化的脂蛋白部分的、包含與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定DNA結合位點結合的單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多核苷酸。
另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結合基序的重組載脂蛋白片段，其預先結合到包括單一或多拷貝的特定核香酸序列的多核苷酸上。另 一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結合基序的重組載脂蛋白片段，其預先結合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多核苷酸上。
給藥劑量在很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀態以及給藥途徑和治療頻率。包括預先結合到高度純化的脂蛋白部分的棵多核芬酸的藥物組合物可以按1 (ig到1 mg多核苷酸和1 )ig到100 mg蛋白質的量給藥。
rAb和rAb復合物給予患者可以遵循用于化學療法給藥的一般方案，如果有的話，考慮載體的毒性。預料根據需要重復治療周期。還考慮，多種標準治療以及外科干預可以與所述的基因治療聯合施用。
在考慮基因治療臨床應用的情況下，需要制備復合物作為適于目的應用的藥物組合物。通常這需要制備基本上不含熱原以及任何其它對人或動物有害的雜質的藥物組合物。通常還期望使用適當的鹽和緩沖液以使復合物穩定和允許復合物被靶標細胞攝取。
本發明的水性組合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在藥學上可接受的載體或水介質中。這些組合物也可以稱作接種物。用于藥物活性物質的介質和試劑的使用在本領域中為大家所熟知。任何常規介質或試劑除非與活性成分不相容，否則其在治療組合物中的使用被考慮。補充性活性成分也可以加入組合物中。本發明的組合物可以包括典型的藥物制劑。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中和在油類中制備分散體。在通常的儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。
疾病狀態。取決于要治療的特定疾病，根據本發明的治療組合物的給予可以經任何常規途徑進行，只要經該途徑可達到靶標組織以使最大化遞送抗原到位點來達到最大的(或在一些情況下最小的)免疫應答。通常可以經原位、皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射給藥。遞送的其它部位包括口、鼻、頰、直腸、陰道或局部的。局部給藥對于皮膚癌的治療可能是特別有益的。所述組合物通常作為包括生理學上可接受的載體、緩沖液或其它賦形劑的藥學上可接受的組合物給藥。
本發明的疫苗或治療組合物可以經注射胃腸外例如皮下或肌內給予。適于其它給藥方式的另外的制劑包括栓劑，以及在一些情況下口服制劑或適于
分配的制劑如氣霧劑。對于口服制劑，使用佐劑的T細胞亞型操作，抗原包
裝或添加單獨的細胞因子到多種制劑中產生具有最佳化免疫應答的改良口服疫苗。對于栓劑，常規的粘合劑和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或
甘油三脂；這些栓劑可以由包含0.5%到10%,優選1%-2%范圍內的活性成分的混合物形成。口服制劑包括通常使用的賦形劑，例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、淀粉硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠嚢、緩釋制劑或散劑的形式并且包含10%-95%的活性成分，優選25-70%。
本發明的編碼抗原的核酸可以作為中性的或鹽的形式配制入疫苗或治療組合物中。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成的)，其為與無才幾酸例如鹽酸或磷酸或與有才幾酸諸如醋酸、草酸、酒石酸、馬來酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以源自于無機^喊例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵和有機堿諸如異丙胺、三曱胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
疫苗或治療組合物以與給藥制劑相容的方式，以及以預防和/或治療有效的量給予。要給予的量取決于要治療的受試者，包括例如受試者的免疫系統對合成抗體的容量，以及期望保護或治療的程度。合適的劑量范圍為每次疫苗接種具有約幾百微克級的活性成分，范圍為約0.1 mg到1000 mg,諸如約1 mg到300 mg的范圍，以及優選約10 mg到50 mg的范圍。合適的初始紹^藥和強化注射方案也是變化的，但是典型的是初始給藥然后是后續的接種或其他給藥。給藥要求的活性成分的精確量取決于醫師的判斷且可能為每個受試者所特有。本領域技術人員清楚，本發明的核酸分子或融合多肽的治療有效量尤其取決于給藥方案，給藥抗原的單位劑量，核酸分子或融合多肽是否和其它治療劑聯合給藥，接受者的免疫狀態和健康狀態，以及特定核酸分子或融合多肽的治療活性。
組合物可以以單一劑量方案或以多次劑量方案提供。多次劑量方案中疫苗接種的初始時程可以包括，例如1-10個單獨的劑量，隨后在以維持和或加強免疫應答要求的后續時間間隔給予其它劑量，例如在l-4個月給予第二劑量，以及如果需要在數月之后給予后續劑量。需要每隔l-5年，通常3年的定期加強劑量來維持需要的保護性免疫水平。免疫時程可以繼之以與
ESAT6或ST-CF共培養的外周血淋巴細胞(PBL)的體外增殖測定，以及測量致敏淋巴細胞釋放的IFN，水平。可以使用常規的標記物諸如放射性同位素、酶、熒光標記物等進行測定。這些技術為本領域技術人員所知并且可以在美國專利號3,791,932、 4,174,384和3,949,064中找到，這些文獻的相關部分通過引用并入本文。
才莫塊式rAb載體和/或結合的rAb載體-(cohesion/dockerin和/或dockerin-cohesin)-抗原復合物(rAb-DC/DC-抗原疫苗)可以以 一種或多種"單位劑量"提供，這取決于是否使用核酸載體，最終純化的蛋白質，或使用的最終的疫苗形式。把單位劑量定義為包含計算以產生與該治療組合物給藥即適當的途徑和治療方式相關的期望反應的預定量的治療組合物。給藥量以及特定的途徑和制劑在臨床領域技術人員的范圍之內。還可以評估待治療的受試者，尤其是，受試者免疫系統的狀態和需要的保護。單位劑量不需要以單一注射給藥，而是可以包括經設定的一段時間內的連續輸注。本發明的單位劑量可以方便地用DNA/kg(或蛋白質/Kg)體重來描述，以約0.05、 0.10、 0.15、0.20、 0.25、 0.5、 1、 10、 50、 100、 l，OOO或更多mg/DNA或蛋白質/kg體重的范圍給藥。同樣地，遞送的rAb-DC/DC-抗原疫苗的量可以從約0.2到約8.0mg/kg體重變化。因此，在特定實施方案中，可以把0.4mg、 0.5 mg、 0.8mg、 1.0 mg、 1.5 mg、 2.0 mg、 2.5 mg、 3.0 mg、 4.0 mg、 5.0 mg、 5.5 mg、6.0 mg、6.5 mg、7.0 mg和7.5 mg的疫苗遞送到個體體內。給藥的rAb-DC/DC-抗原疫苗的劑量在很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀態以及給藥途徑和治療頻率。包括預先結合到脂質體或病毒遞送載體上的棵多核苷酸的藥物組合物可以按從l昭到lmg多核苷酸到lpg到100mg蛋白質的量給藥。因此，特定組合物可以包括在約1 jig、 5 [ig、 10 pg、 20昭、30嗎、40 (ig、 50 |ig、 60嗎、70嗎、80 ng、 100嗎、150嗎、200昭、250 jig、 500嗎、600 (ig、 700嗎、800嗎、900嗎或1,000嗎之間的多核苷酸或蛋白質，該多核苷酸或蛋白質獨立地與l嗎、5嗎、10嗎、20嗎、3.0嗎、40(ig、 50昭、60嗎、70 |ig、 80 |ig、 100 fig、 150嗎、200嗎、250路、500嗎、600嗎、700 jig、 800 )ig、 900 jig、 1 mg、 1.5 mg、 5 mg、 10 mg、 20 mg、 30 mg、 40 mg、50mg、 60mg、 70 mg、 80 mg、 90 mg或100 mg載體結合。
在體外細胞系統中測試本發明，該體外細胞系統測量Flu抗原靶向的樹突細胞對人Flu特異性T細胞的免疫刺激。本文顯示的結果證明在該系統中單獨使用無效的抗原劑量下這些抗原特異性細胞的特異性擴增。本發明還可以用于制備模塊式rAb載體，該模塊式rAb載體例如是與來自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B腸毒素的保護性抗原復合的重組人源化mAb(抗特異性人樹突細胞受體)。該實體的潛在市場是所有軍事人員的疫苗接種和儲備待用給大居民點服藥以應對任何與這些試劑相關,生,威脅^
興趣的工業包括制藥和生物:技術工業。
本發明包括包含疫苗的組合物和方法，其特異性靶向(遞送)抗原至抗原
發針對衍生所述抗原的活性劑(病原體或癌癥)的保護性或治療性免疫應答。此外，本發明產生了這樣的試劑，其直接或與其他試劑一起通過它們與在抗原呈遞細胞上表達的LOX-l受體的特異性結合而具有治療性作用。
才才泮+和方法
抗體和四聚體-用于DC和B細胞表面染色的抗體(Ab)，包括同型對照Ab，購自BD Biosciences (CA)。用于ELISA的Ab購自Bethyl (TX)。 ^元-BLyS和抗-APRIL來自PeproTech (NJ)。四聚體HLA-A承0201-GILGFVFTL (Flu Ml)和HLA-A*0201-ELAGIGILTV (Mart-1)購自Beckman Coulter (CA)。
細胞和培養物-來自正常供體的單核細胞(lxloVml)在含有GM-CSF (100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)(R&D, CA)的Cellgenics (France)培養液中培養。對于第3天和第6天的DC,分別在第1天和第3天將相同量的細胞因子添加到培養液中。B細胞用陰性分離試劑盒(BD)純化。CD4和CD8 T細胞用包被抗CD4或CD8的磁珠(Milteniy, CA)純化。使用PercollTM梯度(GEHealthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)通過密度梯度離心從血沉棕黃層中分離PBMC。對于DC活化，將lx105 DC在用mAb包被的96孔平板中培養16-18h。在碳酸鹽緩沖液pH 9.4中的mAb (l-2jig/孔)在37。C下培養至少3h。收集培養物上清液，細胞因子/趨化因子通過Luminex(Biomd， CA)測定。對于基因分析，DC在mAb包被的平板中培養8h。在一些實驗中，將可溶性50 ng/ml CD40L (R&D， CA)或50 nM CpG (InVivogen， CA)添加到培養液中。在DC和B細胞共培養中，將重懸在含有10% FCS和抗生素的RPMI1640(Biosource, CA)中的5xl03 DC首先在mAb包被的平板中培養至少6h，然后加入lxl()5用CFSE (Molecular Probes, OR)標記的純化自體B細胞。在一些實驗中，DC用5 moi (感染復數)熱滅活流感病毒(A/PR/8 H1N1)脈沖攻擊2h,然后與B細胞混合。對于DC和T細胞共培養，將5xl03 DC與lx105純化的自體CD8 T細胞或者混合的同種異體T細胞一起培養。在培養的最后18h，用lpCi/孔3[司-胸苷脈沖攻擊同種異體T細胞，然后通過用Y-計數儀(Wallac，畫)測定cpm。以5xl05 PBMC/孔在mAb包被的平板中培養。分別在第10天和第7天，通過用抗CD8和四聚體染色細胞來測定Mart-l和Flu Ml特異性CD8 T細胞的頻率。將10 pM的Mart-l肽(ELAGIGILTV)和20 nM的含Mart-l肽的重組蛋白(參見下文)添加到DC和CD8 T細'胞培養物中。將20 nM純化的重組Flu Ml蛋白(參見下文)加到PBMC培養物中。
單克隆抗體-通過常規技術制備小鼠mAb。筒而言之，用含有Ribi佐劑的20嗎受體胞外結構域.hlgGFc融合蛋白對6周齡的BALB/c小鼠進行i.p.免疫，然后在第IO天和第15天，用20昭抗原進行加強免疫。3個月后，在取出脾臟的前3天，再對小鼠加強免疫。或者，在30天至40天的期間內，每3-4天用在Ribi佐劑中的l-10嗎抗原注射小鼠足墊。在最后加強免疫后的3 -4天，收集引流的淋巴結，來自脾臟或淋巴結細胞的B細胞與SP2/0-Ag14纟田胞融合。對雜交瘤上清液進行篩選，與單獨的融合伴倡或與堿性磷酸酶融合的受體胞外結構域(16)比較，分析受體胞外結構域融合蛋白的Ab。然后在FACS中使用用編碼全長受體cDNA的表達質粒瞬時轉染的293F細胞對陽性孔進行篩選。選擇的雜交瘤是在CELLine瓶(Intergra, CA)中克隆和擴增的單個細胞。雜交瘤上清液與等體積的1.5M甘氨酸、3MNaCl、 lxPBS,pH7.8混合，并用MabSelect樹脂滾動。用結合緩沖液洗滌樹脂，并用0.1 M甘氨酸，pH2.7洗脫。接著用2 MTris中和，用PBS透析mAb。
ELISA-進行夾心ELISA來測量總IgM、 IgG和IgA以及flu特異性免疫球蛋白(Ig)。含有已知量的Ig的標準人血清(Bethyl)和人AB血清分別用作總Ig和flu特異性Ig的標準。樣本中的Flu特異性Ab滴度，單位被確定為具有相同的光密度的AB血清的稀釋系數。用ELISA試劑盒(BenderMedSystem, CA)測定BAFF和BLyS的量。
RNA純化和基因分析-用脂easy柱(Qiagen)提取總RNA,并用2100Bioanalyser (Agilent)分片斤。生物素沖示"i己的cRNA革巴才示用Illumina totalprep才示記試劑盒(Ambion)制備并雜交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的轉錄本)上。這些微陣列由附著在3pm珠上的50mer寡核香酸探針組成，所述珠固定在硅片表面上蝕刻的微孔中。用鏈霉抗生物素-Cy3染色后，用Illumina(Beadstation 500X)生產的亞微米分辨掃描儀成像。用基因表達分析軟件程序GeneSpring, Version 7.1 (Agilent)進行數據分析。
重組Flu Ml和MART-1蛋白的表達和純化-用PCR擴增流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1) Ml基因的ORF,同時加入起始密碼子遠端的Nhe I位點以及終止密碼子遠端的Not I位點。將消化片段克隆到pET-28b(+) (Novagen)中，并在Ml ORF讀框內插入His6標簽，從而編碼His.Flu Ml蛋白質。編碼插入在Nco I和Nhe I之間的來自熱纖4炎菌(CAermoce〃wm)(未公開)的N端169個殘基cohesin結構域的pET28b(+)衍生物表達Coh.His 。
為表達 Cohesin-Flex-hMART-l-肽 A-His ， 序列
(SEQ ID NO.: 1) ( 編 碼
DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO.: 2)-帶陰影的殘基是免疫顯性的HLA-A2-限制性肽，而該肽周圍帶下劃線的殘基來自MART-1)被插入到上述載體的Nhel位點和Xho I位點之間。蛋白在大腸桿菌菌抹BL21(DE3) (Novagen)或者T7Express (NEB)中表達，這些菌抹在37。C下在LB中培養，以卡那霉素抗性(40pig/ml)選擇，并以200轉/分鐘搖并瓦直至生長到對數中期，同時添加120mg/L IPTG。 3h后，通過離心收集細胞，保存在-8(TC下。將來自每1L發酵物中的大腸桿菌細胞重懸在30 ml含有0.1 ml蛋白酶抑制劑Cocktail II(Calbiochem, CA)的水冷的50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0 (緩沖液B)中。在冰上超聲處理細胞2次，每次5分鐘，設定值為18 (Fisher SonicDismembrator 60),其中有5分鐘靜止期，然后在4。C下以17,000 r.p.m. (SorvallSA-600)離心20分鐘。為了純化His.Flu Ml,使50 ml細胞裂解物上清液部分通過5 ml Q瓊脂糖珠，將6.25 ml 160 mM Tris、 40 mM咪唑、4 M NaCl pH7.9添加到Q瓊脂糖流動液中。將其以4 ml/分鐘速度上樣到5 ml帶有Ni++的H汀rap螯合HP柱上。結合柱的蛋白質用20 mM NaP04 , 3 00 mM NaCl pH7.6 (緩沖液D)洗滌，接著用100 mM H3COONa pH 4.0再洗滌一次。結合的蛋白質用100 mM H3COONa pH 4.0洗脫。合并峰值餾分，以4 ml/分鐘的速度上樣到用100 mM H3COONa pH 5.5平衡的5 ml HiTrap S柱上，用平衡緩沖液洗滌，接著用在50 mM NaP04 pH 5.5中的梯度為0-1 M的NaCl洗脫。合并用約500 mM NaCl洗脫的峰值餾分。為了純化Coh.Flu Ml.His,如上所述將來自2L培養物的細胞裂解。離心后，將2.5 ml Triton29 XI14加到上清液中，在冰上培育5分鐘。在25。C下再溫育5分鐘后，在25。C下進行離心，從Triton XI14中分離上清液。重復提取操作，將上清液通過5ml的Q瓊脂糖珠，在Q瓊脂糖流動液中添加6.25 ml 160 mM Tris、40 mM咪唑、4 M NaClpH7.9。如上所述，用Nr螯合的層析柱純化蛋白質，并用在緩沖液D中的0-500 mM ，咪唑洗脫。
抗LOX-l mAb-本發明包括以下所示的對應于抗LOX-l單克隆抗體的特定氨基酸序列，它們是治療性或保護性產品中的期望成分(在例如人源化重組抗體的情況下)。以下是在嵌合小鼠V區(下劃線)人C區重組抗體中的所
述序列。這些小鼠V區可容易地被人源化，即LOX-l結合區由任何本領域 技術人員移植到人v區框架序列上。此外，所述序列也可表達為融合蛋白，
其保留了抗體的功能，但加入了例如抗原、細胞因子或毒素以用于需要的治 療性應用。
QEGNVFSCSVMHEAL麗HYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 5) [mAnti-LOX—1—10F9K-LV-hlgGK誦C]SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.: 6)
RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKAS (SEQ ID NO.: 7) [mAnti-LOX-l—15C4K-LV畫hlgGK-C]
YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.: 8)。
本發明包括v區序列和相關序列，其由本領域技術人員修飾，以例如增 強LOX-l的親和力，和/或被整合入人V區框架序列中，以工程化入表達載 體中指導能夠結合抗原呈遞細胞上的LOX-1的蛋白質形式的表達。此外，
的)其他mAb可通3過類似的方法(始于PCR克隆和小鼠雜交"V區;則序)i入 編碼類似重組抗體(rAb)的表達構建體中。這種抗LOX-1 V區還可由本領域 技術人員人源化(即將小鼠特異性的結合序列移植到人V區框架序列上)以最 小化所述治療性rAb可能的免疫反應性。
工程化重組抗LOX1重組抗體-抗原融合蛋白(rAb.抗原)是有效的體外原 型疫苗-表達載體可采用不同的蛋白編碼序列構建，例如與H鏈編碼序列框 內融合。例如，抗原如流感病毒HA5、流感病毒Ml、 HIV gag或來自癌抗 原的免疫顯性肽或細胞因子可隨后表達為rAb.抗原或rAb.細胞因子融合蛋 白，在本發明的情況下，其能夠具有使用抗LOX-1 V區序列將抗原或細胞 因子(或毒素)直接帶至具有LOX-1的抗原呈遞細胞表面的用處。其容許例如 抗原的內在化-有時與受體的活化和隨后治療或保護性作用的起始(例如通過 起始有效的免疫應答，或通過殺死靶細胞)相關。基于該構思的典型原型疫 苗可使用H鏈載體例如rAB-pIRES2[mAnti-LOX-l—15C4H-LV-hIgG4H-C-Flex-FluHA5-l-6xHis],其指導H鏈小鼠mAb V區(下劃線)-人IgG4 C區-Flu HA5-1 (粗體)融合蛋白的合成。與類似的輕鏈表達質粒(編碼上述的序列)共表達產生多功能的重組抗體(rAb)，該重組抗體結合LOX-l ，并遞送Flu HA5-1 抗原至細胞表面用于DC活化、抗原內在化、抗原加工、抗原呈遞和特異性 抗Flu HA5-1 B和T細胞的發育和擴充。
KASDTTEPATPTTPVTTDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKH
NGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDL
CYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPY(3GKSSFF
RNWWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTY
ISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEY
AYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKY
VKSNRLVLAHHHHHH (SEQ ID NO.: 9)
類似地，rAB-pIRES2[mAnti-LOX-1—15C4H-LV-hlgG4H-C-Dockerin]編 碼與dockerin融合的抗LOX-l H鏈(序列如下)。Dockerin允許與cohesin-抗 原(coh.抗原)融合蛋白的強的特異性非共價相互作用-提供可選擇的遞送抗原 至DC和其他抗原呈遞細胞的方法。
KASNSPQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNR DGRVNSSDVTILSRYLIRVIEKLPI (SEQ ID NO.: 10)VESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV
KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSV應EALHNH YTQKSLSLSLGKASDTTEPATPTTPVTTPTTTLLAPLILSRIVGGWECEKHSQPW QVLVASRGRAVCGGVLVHPQ曹LTAAHCIRNKSVIIXGRHSLFHPEDTGQV F()VSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDL PTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVT KFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYT KWHYRKWIKDTIVANP (SEQ ID NO: 11) 關于克隆和表達重組抗體(rAb)和rAb.抗原的方法
cDNA克隆和嵌合小鼠/人mAb的表達-從雜交瘤(RNeasy試劑盒，Qiagen) 制備總RNA,并用于cDNA合成和PCR (SMART RACE試劑盒，BD Biosciences),釆用^是供的5'引物和基因特異的3'引物 mlgGK, 5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3， (SEQIDNO.: 12); mlgGX, 5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3' (SEQ ID NO.: 13);
mlgGl, 5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3， (SEQ ID NO.: 14); mlgG2a, 5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3， (SEQ ID NO.: 15);和 mlgG2b, 5,ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3， (SEQ ID NO.: 16)。
克隆PCR產物(pCR2.1 TA試劑盒，Invitrogen),并通過DNA測序鑒定。 使用衍生的序列用于小鼠H和L鏈V區cDNA,使用特異性引物PCR擴增 信號肽和V區，同時將用于克隆的側翼限制性位點插入編碼下游人IgGK或 IgG4H區的表達載體中。通過擴增由Xho I和Not I位點側翼的殘基 401-731(別631019371),并將其插入pIRES2-DsRed2 (BD Biosciences)的Xho I-Not I間隔區來建立用于表達嵌合mVK-hlgK的載體。使用PCR擴增mAb Vk 區，從起始密碼子開始，添加NheI或Spel位點，隨后CACC,至編碼區(例 如gil76779294i的殘基126),添加XhoI位點。隨后將PCR片段克隆入上述 載體的 Nhe I- Not-I 間隔區。 通過將序列 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3' (SEQ ID NO.: 17)插入到上述載體的Nhe I - Xho I間隔區來建立使用mSLAM導引部分的用于嵌合mVK-hlgK的載體。使用 PCR擴增在預測的成熟N端密碼子(使用SignalP 3.0 Server定義)(Bendtsen, Nielsen et al. 2004)和mVK區(如上文所定義)的末端之間的間隔，同時附加 5'tcgtacgga3'。將用Bsi WI和Xho I消化的片段插入到上述載體的相應位點 中。對照hlgK序列相應于別49257887|殘基26-85和別21669402|殘基67-709。 對照hlgG4H載體相應于別19684072|殘基12-1473,具有S229P和L236E取 代，其穩定了二硫鍵并消除了殘基FcR結合(Reddy, Kinney等，2000),插 入到pIRES2-DsRed2載體的Bgl II和Not I位點之間，同時添加序列 5'gctagctgattaattaa3'代替終止密碼子。使用PCR擴增mAb VH區，從起始密 碼子開始，添力。CACC,隨后添加BgIII位點，直至編碼gill9684072l殘基 473的區域。隨后將PCR片段克隆入上述載體的Bgl II - Apa I間隔。通過將 序 列 5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcg tacggattaattaag ggccc3' (SEQ ID NO.: 18)插入上述載體的Nhe I - Apa I位點來 建立使用mSLAM導引部分的用于嵌合mVH-MgG4序列的載體。使用PCR 擴增預測的成熟N端密碼子以及mVH區的末端之間的間隔，同時附加有 5'tcgtacgga3'。將用Bsi WI和Apa I消化的片殺:插入到上述載體相應的位點。 附錄2詳細列出了本研究中使用的各種mVK和mVH區的核香S復序列。
將不同抗原編碼序列插入到H鏈載體的Nhe I - Pac I - Not I間隔區，該 抗原編碼序列兩側為近端Nhe I位點和終止密碼子后的遠端Not I位點。Flu HA1-1由曱型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34(HlNl))紅細胞凝集素gi|21693168| 殘基 82-1025 (C982T 改變)編碼，該殘基具有近端 5 'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3 '序列(Nhe I位點,然后為編 碼cipA cohesin-cohesin接頭殘基)和遠端5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'序 列(編碼His6、終止密碼子和Not I位點)。Flu HA5-1由gil50296052l曱型流 感病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))紅細胞凝集素殘基49-990編碼，該殘 基結合有與Flu HA1-1相同的序列。Doc由gi|40671|celD殘基1923-2150編 碼，該殘基具有近端Nhe I位點和遠端Not I位點。PSA由gp4784812l前列 腺特異性抗原殘基101-832編碼，該殘基具有近端序列 虧'gctegcgatacaacaga3cctgca3C3cctacaacacctgtaac3ac3ccgacaacaacacttctagcgc3' (SEQ ID NO.: 19) (Nhe I位點和cipA間隔區)和遠端Not I位點。Flu Ml-PEP 由 5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcga acgcaagggtatacttggat tcgttttcacacttacttaagcggccgc3' (SEQ ID NO.: 20)編碼。這個 以及所有其他肽編碼序列通過具有適于克隆入Nhe I和Not I限制性H鏈載來產生。總是使用優選的人密碼子，除了限制性位點需要加入或在CipA間 隔區序列中的情況。
采用L鏈和H鏈構建體各 2.5昭和上述的方案，在5 ml瞬時轉染物中 檢測rAb表達構建體的生產水平。用抗MgG ELISA (親和純化的山羊抗人 IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch)分析上清液。在該方案的檢測中，分泌 性rAb的產生不依賴于H鏈和L鏈載體濃度，各DNA濃度在~ 2倍的范圍 內(即系統是DNA飽和的)。
在本文中，本發明的發明人證實，作為LLR之一的LOX-1在細胞(包括 DC)活化方面單獨或與其他細胞信號一起是功能性的。LOX-1介導的細胞活 化由特定的抗LOX-1 mAb誘導，因此此類抗人LOX-1 mAb對于開發針對疾 病的試劑中是有效的。
本發明包括新的抗人LOX-1劑及其在發現新的生物學中的用途，這是 本發明的基礎及其應用。筒言之，開發了新的抗LOX-1單克隆抗體(mAb) 并用于揭示先前未知的與該發現于抗原呈遞細胞上的細胞表面受體相關的 生物學。該新的生物學高度預測了活化該受體的抗LOX-1劑在不同治療性 和保護性應用中的應用。下面給出的數據有力的支持了最初的預測，并證明 了將本文的發現用于臨床應用的途徑。
針對人LOX-1高親和力單克隆抗體的開發制備受體胞外結構域上IgG (人IgGlFc)和AP (人胎盤堿性磷酸酶)融合蛋白分別用于免疫小鼠和篩選單 抗。先前描述了用于DCIR胞外結構域.IgG的表達構建體(16),以及使用小 鼠SLAM (mSLAM)信號肽定向分泌(17)。還通過使用PCR擴增AP殘基 133-1581 (gb|BC009647|),添加近端才匡內Xhol位點和遠端TGA終止密碼子 和Not I位點來產生DCIR胞外結構域.AP的表達載體。該Xho I - Not I片段 在上述的DCIR胞外結構域.IgG載體中替換了 IgG編碼序列。在相同的Ig 和AP載體系列中的LOX-1胞外結構域構建體含有編碼(bp 224-874, gill8490152l)的插入物。使用FreeStyle 293表達系統(Invitrogen)，根據廠 商說明(l mg總質粒DNA與1.3 ml 293 Fectin試劑/L轉染物)產生LOX-1融 合蛋白。為生產rAb，共轉染等量編碼H和L鏈的載體。轉染的細胞培養3 天，收集培養物上清液，加入新鮮的培養基，繼續培養2天。通過過濾澄清 合并的上清液。通過HiTrap蛋白A親和層析純化受體胞外結構域.hlgG，用 0.1 M pH 2.7的甘氨酸洗脫，隨后對PBS透析。使用HiTrap MabSelecFM柱 類似地純化rAb (后面描述的重組抗體)。小鼠mAb通過常規細胞融合技術生 產。簡言之，6周齡的BALB/c小鼠腹膜內用20 (ig受體胞外結構域.hIgGFc 融合蛋白與Ribi佐劑免疫，隨后在IO天和15天后用20 (xg抗原加強。3個月后，小鼠在取脾臟前3天再次加強。或者，在30至40天期間內，每3-4 天小鼠足墊內注射1-10 )ig在Ribi佐劑中的抗原。最后一次加強后3至4天， 收集引流淋巴結。使用常規技術將來自脾臟或淋巴結細胞的B細胞與 SP2/0-Ag 14細胞(18)融合。使用ELISA篩選雜交瘤上清液，與單獨的融合 伴侶或與AP融合的受體胞外結構域(16)相比，篩選針對受體胞外結構域融 合蛋白的抗體。陽性孔隨后用FACS篩選，使用用編碼全長受體DNA的表 達質粒瞬時轉染的293F細胞。選擇的雜交瘤是單細胞克隆的，使適應無血 清培養基，并在CELLine燒瓶(Integra, CA)中擴增。雜交瘤上清液與等體積 的1.5M甘氨酸、3MNaCl、 lxPBS, pH7.8混合，用MabSelect樹脂滾動。 該杉t脂用結合緩沖液洗滌，以0.1 M甘氨酸，pH2.7洗脫。用2 M的Tris中 和后，對PBS透析mAb。
通過直接ELISA進行純化的抗LOX-l單克隆抗體表征下圖顯示通過 ELISA 4企測一些抗LOX-l mAb相對親和力的實例(即將LOX-l.Ig蛋白固定 于微量滴定板表面，并通過劑量滴定系列檢測抗體結合LOX-1 .Ig的能力(如 通過抗小鼠IgG.HRP結合試劑4全測)。這些組為(左邊)對LOX-l.Ig蛋白的 mAb反應性；(右邊)對hlgGFc蛋白的mAb反應性，以及(下面)對LOX-l. 堿性磷酸酶融合蛋白的mAb反應性。在后一情況下，單抗是板結合的(通過 抗小鼠IgG試劑)，并與在溶液中恒定量的LOX-LAP結合。抗LOX-l mAb 與LOX-l胞外結構域特異性反應，其親和力超過商用的抗LOX-l單抗。
體內DC和體外培養的DC均表達LOX-l:圖1顯示正常供體的PBMC 上LOX-l的表達水平。如圖la中所示，抗原遞呈細胞，包括CDllc+DC、 CD14+單核細胞和CD19+ B細胞，表達LOX-l 。 CD3+ T細胞不表達可檢測 到的表面LOX-l。圖lb中顯示體外培養的DC和純化的血髓樣DC (mDC) 上LOX-l的表達水平。IL-4和IFNDC均表達顯著水平的LOX-l。盡管mDC 表達高水平LOX-l,但pDC未表達LOX-l (未顯示)，表明通過LOX-l操作 DC會引起獨特的應答，因為這些DC亞型在體內具有不同的功能。
通過LOX-l的信號傳導活化DC，并刺激DC產生細胞因子和趨化因子 樹突細胞是初級免疫細胞，依賴于其活化決定免疫應答的結果為誘導或耐受 (19)。 LOX-l在DC活化中的作用未知。我們制備了產生小鼠抗hLOX-1 mAb 的8個不同克隆，并且我們通過測定DC表型和DC分泌的細胞因子和趨化 因子來檢測各個mAb是否激活DC。圖2A中的數據顯示PABl、 4、 5、 8 和10能活化DC，但其他抗LOX-l單抗或對照單抗不活化DC(數據未顯示)。 此外，各mAb刺激DC產生不同水平的細胞因子和趨化因子，不過圖2中 顯示的所有mAb均能誘導DC成熟。圖3顯示通過LOX-l的信號傳導能夠導致DC活化。用對LOX-l特異 性的mAb刺激IL-4DC，圖3a中的數據顯示通過LOX-l的信號能夠活化 IL-4DC，導致CD86和HLA-DR表達增加。LOX-l也能活化IFNDC (未顯 示)。為檢測LOX-l是否能在體內活化DC,用抗LOX-l刺激純化的mDC24 小時，隨后用抗CD86、 CD80和HLA-DR(這些為DC活化的標記物)染色細 胞。如圖3b中所示，LOX-l還能活化體內衍生的mDC,使得CD86、 CD80 和HLA-DR表達水平增加。后一數據尤其重要，因為它們代表某些抗LOX-l 單抗對離體細胞(直接從血液中分離)的直接生物學效應。
通過LOX-l的信號傳導誘導獨特的DC活化為更詳細的表征通過 LOX-l的DC活化，進行微陣列基因表達分析。圖4顯示抗LOX-l mAb刺 激DC上調或下調不同種類的基因，表明通過LOX-l的信號導致DC活化的 獨特模式。當與通過DC-ASGPR和CLEC-6信號傳導(未顯示)比較時，數據 顯示各細胞表面DC凝集素遞送獨特的信號以活化DC。因此，我們預期通 過不同信號活化的DC會導致不同的免疫應答。
通過LOX-l的信號傳導激活DC分泌細胞因子和趨化因子用LOX-l 特異性mAb刺激的DC多個基因表達水平上升，包括共刺激分子以及趨化 因子和細胞因子相關的基因(圖5a和b)。當用抗LOX-l mAb刺激時，體外 培養的IL-4DC和mDC均產生顯著增加量的分泌IL-12p40、 MCP-1和IL-8。 包括TNFa、 IL-6、 MIP-la和IL-lb在內的其他水平增加的細胞因子和趨化 因子也在用抗LOX-l刺激的DC培養物上清液中觀察到。先前已描述LLR 在TLR2和TLR4介導的免疫細胞活化中的可能貢獻。
通過LOX-l的信號傳導增強通過CD40DC的信號傳導通過LOX-l的 信號傳導可與通過CD40的信號傳導協同作用用于增強DC的活化(圖5)。 CD40-CD40L作用過程中的LOX-l結合導致活化標記物CD83在細胞表面表 達的顯著增加(圖6a),以及IL-12p70和Il-12p40分泌增加(圖6b)。這表明 LOX-l可在體內DC活化中用作共刺激分子，并廣泛^提示通過LOX-l活化 的試劑(mAb例如本文中描述的那些，或者天然或替代LOX-l配體)的治療 作用。總體而言，圖1至圖6中的數據表明通過LOX-l的信號傳導能活化 DC, LOX-l是用于DC活化的新的共刺激分子。
通過LOX-l刺激的DC誘導有力的體液免疫應答DC通過為T依賴的 和非T依賴的B細胞應答提供信號(21-24)以及傳遞抗原至B細胞(25， 26)在 體液免疫應答中起重要作用。除DC外，作為第三信號的通過TLR9的信號 傳導對于有效的B細胞應答是必須的(27, 28)。 LOX-l在TLR9配體CpG存 在下可影響DC介導的體液免疫應答。用抗LOX-l單抗刺激6天IL-4DC, 隨后共培養純化的B細胞。如圖6a中所示，與對照mAb刺激的DC相比，用抗LOX-l單抗活化的DC導致顯著增加的B細胞增殖(通過CFSE稀釋顯 示)和漿細胞分化(CD38+CD2(T增加)。CD38+CD2(T B細胞具有典型的漿細胞 形態學，但其不表達CD138。大部分增殖細胞不表達CCR2、 CCR4、 CCR6 或CCR7。
通過ELISA測定產生的總免疫球蛋白(Ig)量(圖7b)。與圖7a中的數據一 致，用抗LOX-l刺激的DC培養的B細胞導致總IgM的產生顯著增加。除 了總Ig增加以外，通過觸發LOX-l活化的DC比用對照mAb刺激的DC更 有效地使B細胞產生流感病毒特異的IgM、 IgG和IgA (圖7c)，表明LOX-1-介導的DC活化對總的和抗原特異性的體液免疫應答均有作用。
DC-衍生的B淋巴細胞刺激子蛋白(BLyS， BAFF)和增殖誘導配體 (APRIL)是重要的分子，通過它們DC可直接調節人B細胞增殖和功能 (29-32)。圖6d中的數據表明通過LOX-l刺激的DC表達水平增加的細胞內 APRIL和分泌性APRIL,而非BlyS (未顯示)。測定了混合培養物中B細胞 上的BlyS和APRIL受體的表達水平，但沒有顯著的變化(未顯示)。這由圖 7e中的數據證實。在DC和B細胞共培養中，BAFF受體(BAFFR)、 TACI 和BCMA的結合被可溶性受體-Fc融合蛋白阻斷。當TACI或BCMA被阻 斷時，IgM和IgA產生均顯著下降。當向培養物中加入BAFFR-Fc時，未觀 察到這一現象，表明用抗LOX-l刺激的DC產生的APRIL在免疫球蛋白產 生增加中起重要作用。
上述發現極大地提示通過LOX-l特異性活化的試劑例如作為疫苗佐劑 或作為免疫受損個體中的免疫系統刺激劑的治療性應用。另外，所述發現預 期阻斷通過LOX-l的天然或異常調節的活化可能具有應用(例如引發移植器 械的耐受或改善自身免疫疾病)。
抗LOX-l mAb活化B細胞CD19+ B細胞表達LOX-l (圖1和圖8a), 這預測B細胞上表達的LOX-l的作用。圖8b中的數據表明，觸發B細胞上 的LOX-l導致分泌性IL-8和MIP-la產生增加，提示LOX-l可對B細胞活 化有直接作用。除了 IL-8和MIP-la夕卜，與對照mAb相比，當用抗LOX-l mAb 刺激B細胞時，IL-6和TNFa也有輕微增加。圖8c顯示用抗LOX-l mAb活 化的B細胞總IgG、 IgM和IgA的分泌量增加。
上述關于通過LOX-l結合直接作用于B細胞的發現補充了上述通過 LOX-l起作用或針對LOX-l的試劑的治療性應用的范圍。
LOX-l在T細胞應答中的作用通過LOX-l刺激的DC表達的共刺激 分子的水平提高，細胞因子和趨化因子的產生也升高(圖1和3),表明LOX-l 對細胞免疫應答以及體液免疫應答起作用。這通過混合淋巴細胞反應(MLR) 測試。用LOX-l特異性mAb刺激的DC顯著增強了純化的同種異體T細胞增殖(圖9a)。通過LOX-l活化的DC比用對照mAb刺激的DC更有效地致 敏(prime) Mart-l特異性CD8T細胞(上組的圖9b中)。更重要的是，通過 L0X-1的信號傳導允許DC將Mart-l肽交叉致敏至CD8T細胞中(下組的圖 9c中)。圖9b和9c右組分別顯示來自5和4個不同正常供體中的細胞產生 的數據，這表明LOX-l在增強DC功能方面具有重要作用，導致改善的致敏 和抗原交叉致敏至CD8T細胞中。抗LOX-l mAb和抗原融合蛋白也比對照 mAb融合蛋白誘導更有力的抗原特異性CD8T細胞應答。用10或1 nM的 mAb與Flu Ml蛋白的結合物負載IL-4DC，與自體CD8+ T細胞共培養7天。 細胞用抗CD8和Flu Ml四聚體染色。圖9d中的數據顯示抗LOX-l融合蛋 白誘導了顯著增強的Flu Ml特異性CD8T細胞應答。
已發現LOX-l活化的DC影響鄰近的T細胞，指導其增殖增加。此外， 當抗原在該相互作用中存在時，LOX-l活化的DC導致抗原特異性T細胞的 擴增增加。這表明LOX-l活化例如在疫苗環境下可指導抗原特異性初始T 細胞的選擇性擴增-其與上述LOX-l活化對B細胞的直接和間接的作用一 起，清楚地預測了抗原-特異性B細胞的擴增以及由此抗原特異性抗體的產 生。關于抗LOX-l用途的另一個證明是當抗原通過抗LOX-l mAb結合物直 接集中于DC時，所述DC指導該抗原特異性記憶CD8+細胞的擴增。
非人靈長類動物體內DC表達LOX-l-為測試非人靈長類(食蟹猴)血DC 是否被抗人LOX-l mAb識別，用抗LOX-l mAb和對其他細月包標記物CD3、 CD14、 CDllc、 CD27、 CD56和CD16的抗體染色猴PBMC。圖10中的數 據顯示CD14和CDllc+細胞均被抗人LOX-l mAb染色。與CD14+和CDllc十 細胞不同，CD3+、 CD16+、 CD27+和CD56+細胞不表達LOX-l 。該數據表 明某些抗人LOX-l mAb對猴抗原呈遞細胞具有交叉反應性。這大大地有利 于本文所描述的發明用于實際，因為猴可用作用于預想的人治療的有效且安 全研究的有效模型。
圖11顯示了典型rAb抗原融合蛋白的還原SDS.PAGE分析一包括抗 LOX-1—15C4.PSA，其能夠指導前列腺特異性抗原(高亮的灰色)至抗原呈遞 細胞表面，用于針對前列腺癌的疫苗接種。
圖12和13直接表明抗LOX-l rAb遞送連接的抗原至含LOX-l細胞的 表面的能力。
圖14A和14B顯示B細胞通過抗LOX-l mAb活化的DC的粘膜歸巢。 圖14B顯示測定了 B細胞上的粘膜同源受體的表達水平。與用抗LOX-l激 活的DC共培養的原初B細胞增殖要好于與用對照免疫球蛋白(Ig)刺激的DC 培養的B細胞(圖14A中的上兩組)。與用抗LOX-l mAb刺激的DC共培養 的原初B細胞表達CCR10，該原初B細胞具有增強的增殖和漿細胞分化能力。那些B細胞可遷移響應CCL28。盡管已知CCR10是遠端腸歸巢受體， 但是最近的研究顯示呼吸粘膜也表達顯著量的CCL28。因此，CCR10現已 證實是粘膜歸巢受體。
圖14B顯示，與經LOX-l活化的DC相互作用的B細胞^t程序化歸巢 至粘膜。與顯示該DC活化B細胞增殖、分化為漿樣細胞以及提高免疫球蛋 白的分泌(包括當LOX-l活化與通過LOX-l的抗原靶向相關時的抗原特異性 Ig)的數據一起，該B細胞CCR10表達的增加表明LOX-l活化和抗原靶對提 高抗原特異性粘膜免疫的高度可能性。
圖15顯示，抗LOX-l mAb有助于提高IgAl和lgA2的產生。下一步， 確定用抗LOX-l mAb活化的DC是否能誘導原初B細胞產生IgAl和IgA2。 通過FACS分選純化原初B細胞(IgD+CD27-)。圖15顯示用經抗LOX-l活 化的DC培養的原初B細胞導致IgAl和IgA2的產生顯著增加。IgM和IgG 水平也都被經抗LOX-l刺激的DC顯著提高。總之，通過DC-凝集素，尤其 是LOX-l活化DC,可導致提高的體液免疫應答。特別地，所述DC誘導的 B細胞表達粘膜歸巢受體CCR10,并可產生IgAl和IgA2。因此，用抗LOX-l 制備的疫苗能誘導強的粘膜免疫應答。
圖16顯示負載抗LOX-l和流感病毒血凝素(HAl, H1N1, PR8)的重組融 合蛋白的DC誘導原初B細胞分泌flu特異性的IgM。與抗LOX-l相比，抗 ASGPR和抗CLEC6的HAl融合蛋白導致弱的應答。與負載抗LOX-1-HA5 的DC共培養的原初B細胞也產生HAl特異性的IgM。總之，由抗凝集素 mAb和抗原制備的疫苗可誘導預防病毒感染的強粘膜IgAl和IgA2應答。
圖17顯示抗LOX-l-HA5耙向的DC也能擴增HA5-特異性CD4+ T細 胞，進一步證實了本發明作為有效疫苗的用途。
圖18顯示抗LOX-l疫苗能引發DC-亞型特異性的免疫應答。確定是否 用抗LOX-l-HA5疫苗靶向的不同DC亞型引發不同范圍的免疫應答，該免 疫應答通過定義為用HA5肽刺激的HA5特異的T細胞擴增來證明。因此， 基于抗LOX-l的疫苗通過將同一抗原靶向至不同的DC細胞亞型導致針對該 抗原廣泛的免疫應答。這些數據也顯示了抗LOX-l靶向疫苗在引發抗原特 異性T細胞應答中所需要的性質，所述細胞應答被高度預測為特征為它們產 生IFNy的效應細月包。
圖19顯示抗LOX-l抗體對短尾猴LOX-l的交叉反應性。從短尾猴中分 離相應于4個變體LOX-l cDNA的cDNA克隆，并將其設置入哺乳動物表 達載體中。圖19顯示三個特別期望的抗人LOX-l抗體對用這些表達載體轉 染的293F細胞與用人LOX-l表達載體轉染的293F細胞比較的FACS分析。 結果顯示所有測試的兩種mAb (15C4和11C8)對所有三種短尾猴LOX-l變體均顯示交叉反應性，而10F9與一種變體交叉反應。這種交叉反應性是期 望的，因為其允許在人臨床試驗前在NHP模型中進行基于機制的毒性和效 價試驗。
圖20顯示4個來自短尾猴的變體序列(5U1-5U4)與人L0X-1的Clustal W比對。
圖21A至圖21D顯示通過LOX-l的抗原遞送導致抗原特異性的CD4T 細胞應答。測試抗L0X-1-HA1和對照IG-HA1的結合親和力(圖21A)。抗 L0X-1-HA1和對照Ig-HA1均可與單核細胞衍生的IFNDC結合，但抗 L0X-1-HA1比對照Ig-HA1與DC結合得稍好一些。測量了負載抗 L0X-1-HA1或對照Ig-HA1的DC誘導的CD4 T細胞增殖。圖21B顯示負 載抗L0X-1-HA1的IFNDC誘導的CD4 T細胞增殖(69%)比用對照Ig-HA1 誘導的CD4 T細胞增殖(7%)更大。
為確定增殖的CD4 T細胞是否為抗原(HAl)-特異性的，用負載HA1肽 池的IFNDC再刺激用負載抗L0X-1-HA1的DC擴增的CD4 T細胞。圖21C 顯示肽池37-48導致產生IFNy的CD4 T細胞的頻率相對4交高。還測定了 CD4 T細胞對肽池37-48中單個肽的反應性。圖21D顯示CD4 T細胞對三種肽， 肽43、肽44和肽45應答產生細胞內IFNy。總之，這些數據顯示用抗 LOX-1-HA1革巴向人DC能誘導抗原特異性的CD4T細胞應答。
考慮任何本說明書中討論的實施方案可通過本發明的任何方法、試劑 盒、試劑或組合物實現，反之亦然。此外，本發明的組合物可用于完成本發 明的方法。
應理解，本文描述的特定實施方案以例證的方式顯示而不作為本發明的 限制。不背離本發明的范圍的前提下，可以在多種實施方案中使用本發明的 基本特征。本領域技術人員將識別或僅使用常規實驗能夠確定本文描述的特 定操作的許多等價物。這樣的等價物被認為是在本發明的范圍之內并被權利 要求書所覆蓋。
在說明書中提到的所有出版物和專利申請指示了本發明所屬領域技術 人員的技能水平。所有出版物和專利申請均引入本文作為參考，其程度如同 各單個出版物或專利申請特別且單獨地指出引入本文作為參考一樣。
詞語"一"當和術語"包括"、"包含"、"含有"在權利要求書和/或說明 書中一起使用時可以表示"一個(種)"，但是也與"一個(種)或多個(種)"、"至少 一個(種)"和"一個(種)或一個(種)以上"的意思一致。在權利要求書中術語"或" 的使用用于表示"和/或"，除非盡管公開的內容支持指代唯一的替換物以及" 和/或"的定義，但是權利要求書中明確指出指的是唯一的替換物或替換物是相互排斥的。貫穿本申請，術語"大約"用于表示數值包括裝置、使用來測定 該值的方法的固有誤差變異，或存在于研究受試者之中的變化。
如本說明書和權利要求書中所用，詞語"包括"(及其任何形式)、"具有"(及 其任何形式)、"包含"(及其任何形式)或"含有"(及其任何形式)是包含的或開放 的并且不排除另外的、未列舉的元件或方法步驟。
本文使用的術語"或其組合"指在該術語之前列舉的項目的所有排列與
組合。例如，"A、 B、 C或其組合"意指包含A、 B、 C、 AB、 AC、 BC或ABC 至少一個，以及如果在特定的情況下順序是重要的，還包含BA、 CA、 CB、 CBA、 BCA、 ACB、 BAC或CAB。繼續這個例子，明確包括的是包含一個 或多個項目或術語的重復的組合，諸如BB、 AAA、 MB、 BBC、 AAABCCCC、 CBBAAA、 CABABB等等。熟練的技術人員可以理解在任何組合中通常沒 有對項目或術語數目的限制，除非從上下文中是顯然的。
按照本申請公開的內容而不需要過度的實驗，能夠制備及實施本文 〉開 及請求保護的所有組合物和/或方法。雖然本發明的組合物和方法已經就優選 的實施方案進行了描述，但是本領域技術人員清楚，在不背離本發明的構思、 精神及范圍的前提下，可以將變化應用于本文所描述的組合物和/或方法以及 本文所描述的方法的步驟中或步驟的序列中。所有這樣的對本領域技術人員 而言顯而易見的類似替代和修改被認為在所附的權利要求書所定義的本發 明的精神、范圍及構思的范圍之內。1. Delneste, Y., G. Magistrelli, J. Gauchat, J. Haeuw， J. Aubry, K. Nakamura, N. Kawakami隱Honda, L. Goetsch， T. Sawamura, J. Bonnefoy, and P. Jeannin. 2002. Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediated antigen cross-presentation. Immunity 17:353-362.
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權利要求
1.一種用于增加LOX-1-表達性抗原呈遞細胞抗原呈遞效力的方法，所述方法包括使所述抗原呈遞細胞與抗LOX-1特異性抗體或其片段接觸，其中所述抗原呈遞細胞被活化。
2. 權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括分離的樹突細胞、外 周血單核細胞、單核細胞、髓樣樹突細胞及其組合。
3. 權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括已在體外與GM-CSF 和IL-4、干擾素a、抗原及其組合一起培養的如下細胞分離的樹突細胞、 外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、髓樣樹突細胞及其組合。
4. 權利要求l的方法，所述方法還包括活化與GM-CSF和IL-4或干擾 素a接觸的抗原呈遞細胞的步驟，其中與所述LOX-l特異性抗體或其片段 的接觸增加抗原呈遞細胞上的CD86和HLA-DR的表面表達。
5. 權利要求l的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突 細胞已與GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸以活化該樹突細胞，其中所述活 化的樹突細胞增加CD86、 CD80和HLA-DR的表面表達。
6. 權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突 細胞已與GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸以活化該樹突細胞，其中所述活化的樹突細胞增加IL-12p40、 MCP-l 、 IL-8、 TNFa、 IL-6、 MIP-la和IL-lb及其組合的分泌。
7. 權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突 細胞已與GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸，且所述LOX-l特異性抗體或其 片段增加與通過CD40的信號傳導有關的活化。
8. 權利要求1的方法，其中所述抗原呈遞細胞包括樹突細胞，所述樹突 細胞已與GM-CSF和IL-4或干擾素a接觸，且所述LOX-l特異性抗體或其 片段增加了樹突細胞的共刺激活性。
9. 權利要求1的方法，其中與所述LOX-l特異性抗體或其片段接觸的 樹突細胞的在一個或多個基因的表達譜發生變化，所述基因選自圖4中的那 些基因。
10. 權利要求1的方法，其中LOX-l特異性抗體或其片段選自克隆 9D7-10-4、 8B4-10-2、 11C8-B7、 13B11-A8及其組合。
11. 權利要求1的方法，其中以LOX-l特異性抗體或其片段通過LOX-l 受體活化的樹突細胞激活B細胞、T細胞及其組合。
12. 權利要求1的方法，其中LOX-l特異性抗體或其片段與 Cohesin/Dockerin對的一半結合。
13. 權利要求1的方法，其中LOX-l特異性抗體或其片段與 Cohesin/Dockerin對的一半結合，且該對的另 一半與一種或多種細胞因子結 合，所述細胞因子選自白細胞介素，轉化生長因子(TGF),成纖維細胞生長 因子(FGF),血小板衍生生長因子(PDGF),表皮生長因子(EGF),結締組織活 性肽(CTAP),成骨因子，以及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生 物，B/T細胞分化因子，B/T細胞生長因子，促有絲分裂細胞因子，趨化細 胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-a, IFN-P, IFN-y， IL1, IL2, IL3, IL4, IL5， IL6, IL7, IL8， IL9, IL10, IL11, IL12, IL13， IL14， IL15, IL16, IL17， IL18等,瘦素，肌肉生長抑制素，巨噬細胞刺激 蛋白，血小板衍生生長因子，TNF-a, TNF-(3， NGF, CD40L， CD137L/4-1BBL, 人淋巴毒素-P， G-CSF, M-CSF, GM陽CSF， PDGF, IL-la, IL1畫卩，IP-10, PF4, GRO, 9E3,促紅細胞生成素，內皮抑素，血管抑素，VEGF,包括(3 轉化生長因子(例如TGF-pi、 TGF-(32、 TGF-(33)在內的轉化生長因子(TGF) ^!&因家族；骨形態發生蛋白(例如BMP-1 、 BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8、 BMP-9);肝素結合生長因子(成纖維細胞生長因 子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長 因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如GDF-1); 以及活化素(例如活化素A、活化素B、活化素AB)。
14. 一種表達LOX-l特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述LOX-l 特異性抗體或其片段活化抗原呈遞細胞以表達新的表面標記物、分泌一種或 多種細胞因子或表達新的表面標記物和分泌一種或多種細胞因子兩者兼具。
15. 權利要求14的雜交瘤，其中所述雜交瘤選自克隆9D7-10-4、 8B4-10-2、 11C8-B7、 13B11-A8及其組合。
16. —種用于增強B細胞免疫應答的方法，所述方法包括在抗原存在下 用LOX-l特異性抗體或其片段觸發樹突細胞上的LOX-l受體，其中已與LOX-l活化的樹突細胞接觸的B細胞增加抗體產生、分泌細胞因子、增加B細胞活化表面標記物表達及其組合。
17. 權利要求16的方法，其中所述B細胞分泌IL-8、 MIP-la、 IL-6、 TNFa及其組合。
18. 權利要求16的方法，其中所述B細胞包括漿細胞。
19. 權利要求16的方法，其中由抗LOX-l抗體活化的B細胞歸巢至粘膜。
20. 權利要求16的方法，其中所述活化的B細胞表達LOX-l。
21. 一又利要求16的方法，其中所述B細胞增加IgG、 IgM、 IgA及其組 合的產生。
22. —種用于增強B細胞免疫應答的方法，所述方法包括以LOX-l特 異性抗體或其片段觸發B細胞上的LOX-l受體，其中所述B細胞增加抗體 產生。
23. 權利要求22的方法，其中所述B細胞增加分泌性IL-8、 MIP-la、 IL-6、 TNFa及其組合的產生。
24. 權利要求22的方法，其中所述B細胞增加IgG、 IgM、 IgA及其組 合的產生。
25. 權利要求22的方法，其中所述B細胞增加IgAl和lgA2的產生。
26. —種用于增強T細胞活化的方法，所述方法包括以LOX-l特異性抗 體或其片段觸發樹突細胞上的LOX-l受體，并使T細胞與該LOX-l活化的 樹突細胞接觸，其中T細胞活化被增強。
27. 權利要求26的方法，其中所述樹突細胞進一步與GM-CSF和IL-4、 干擾素a、抗原及其組合接觸。
28. 權利要求26的方法，其中增加CD8+T細胞的活化。
29. 權利要求26的方法，其中所述T細胞在暴露于用抗LOX-l抗體或 其片段活化的樹突細胞時增殖。
30. —種抗LOX-l免疫球蛋白或其部分，其由哺乳動物細胞分泌并且該 免疫球蛋白與抗原結合，其中所述免疫球蛋白將所述抗原靶向至抗原呈遞細 胞，且該抗原呈遞細胞刺激CD4+細胞的增殖。
31. 權利要求30的免疫球蛋白，其中所述抗原特異性結構域包括全長抗 體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、Fv片段，以及 Fabc片段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段。
32. 權利要求30的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白或其部分包含SEQ ID NO.: 1-11中的至少一個。
33. —種疫苗，其包含用LOX-l特異性抗體或其片段活化的樹突細胞。
34. —種模塊式rAb載體，其包含LOX-l特異性抗體結合結構域，該抗 體結合結構域與一個或多個包含cohesin-dockerin結合對的一半的抗原載體 結構域連接。
35. 權利要求34的rAb,其中所述抗原特異性結合結構域包含抗體的至 少一部分。
36. 權利要求34的rAb，其中所述抗原特異性結合結構域包含與 cohesin-dockerin結合》于的一半構成融合蛋白的4元體的至少一部分。
37. 權利要求34的rAb,其還包含與抗原結合的cohesin-dockerin結合 對的互補性一半，其中該抗原與模塊式rAb載體形成復合物。
38. 權利要求34的rAb,其還包含與抗原構成融合蛋白的 cohesin-dockerin結合只于的互氺卜'1"生一半。
39. 權利要求34的rAb,其中所述抗原特異性結構域包括全長抗體、抗 體可變區結構域、Fab片段、Fab，片段、F(ab》片段、Fv片段，以及Fabc片 段和/或具有部分Fc結構域的Fab片段。
40. 單獨地或與共激活劑一起結合在免疫細胞上的LOX-l受體、聯合活 化抗原.呈遞細胞的試劑用于治療性應用的用途。
41. 免疫細胞上的LOX-l結合劑用于制備疫苗的用途，所述LOX-l結 合劑與或不與激活劑 一起與 一個或多個抗原連接。
42. 抗LOX-l劑作為免疫細胞共激活劑用于增強通過免疫細胞上表達 的除LOX-l外的細胞表面受體引起的免疫應答的用途。
43. 能夠通過LOX-l受體結合并活化免疫細胞的抗LOX-l抗體V區序 列的用途。
44. 與一種或多種毒性劑連接的DC-LOX-l結合劑用于在已知或懷疑由 的病理細胞或組織的情況下的治療性目的的用途。
全文摘要
本發明包括用于靶向免疫細胞上LOX-1受體的組合物和方法，以及抗LOX-1抗體的用途。
文檔編號C07K16/00GK101668772SQ200880013222
公開日2010年3月10日 申請日期2008年2月22日 優先權日2007年2月23日
發明者G·祖拉夫斯基, J·F·班徹羅, S·吳, S·祖拉夫斯基, 李大鵬 申請人:貝勒研究院