一種快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的lamp檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物技術領域，具體是一種快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 柑桔黃龍病也稱柑桔青果病，主要分布于亞洲、非洲、美洲的40多個國家和地區， 在我國部分地區發生普遍;是世界柑桔生產上的一種毀滅性病害;柑桔黃龍病病原屬原核 生物界、薄壁菌門、韌皮部桿菌屬(Liberobacter)，目前，全球共發現亞洲韌皮部桿菌(L. 881&1：；[0118)、非洲韌皮部桿菌(]^.3；^；[0311118)和美洲韌皮部桿菌(]^.311161'；[0311118)3個不同 種，目前在中國分布的柑桔黃龍病菌為亞洲種，亞洲柑桔黃龍病的為害癥狀不僅表現為使 葉片轉黃，還能使柑桔產量降低、品質下降；病情嚴重時會使根系腐爛，甚至會造成整片柑 桔園被毀，且至目前為止，柑桔黃龍病僅可防不可治，主要采取砍除病樹、防治媒介昆蟲等 措施進行防控，因此對柑桔黃龍病菌的早期檢測鑒定尤其重要；目前柑桔黃龍病的檢測鑒 定技術主要有六種，包括田間診斷法、指示植物法、電鏡檢測法、免疫學檢測法、淀粉顯色 法、核酸分子檢測法;其中田間診斷簡便，但易與其他病害混淆，且與診斷者的學識經驗有 很大關系；指示植物法耗時長;電鏡檢測疫學檢測均易漏檢，淀粉顯色雖然快速、經濟，但也 需與田間診斷結合憑經驗判斷；分子核酸分子檢測方法是目前檢測準確率最高的一種方 法，其中包括常規PCR、實時定量PCR方法、LAMP檢測法等，其中前兩種分子檢測方法對檢測 環境、設施設備均有較高要求，不適合大規模快速檢測應用;LAMP檢測方法由于具有操作簡 便、對環境要求低、快速、準確的優點已廣泛應用于食品、醫藥、農業等領域，目前在亞洲柑 桔黃龍病的檢測已有部分研究，但采用靶基因不同，其特異性引物、檢測準確性等均不同。

【發明內容】

[0003] 本發明為了能更好的防控柑桔黃龍病的發生，對感病的柑桔植株進行早期診斷以 防止其進一步大面積擴散，經過長期的試驗研究與對比，提出一種快速檢測亞洲柑桔黃龍 病菌的LAMP檢測方法，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0004] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案： 一種快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測方法，包括以下步驟： 1)引物設計： 采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，應用Clustal W進行多重比對，分析序列的 保守區，利用在線設計軟件Primer Explorer V 4.0,設計LAMP引物，包括2條外引物F3/B3， 2條內引物FIP/BIP，針對6個特定區域設計4條特異性引物，引物序列如下：

2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA; 2.2) 提取的DNA冷凍保存備用； 3) LAMP特異性檢測： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各lyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶lyL，模板2yL，加 ddH20補足至25yL; 3.2) 將反應?0?管置于恒溫孵育器，651反應8〇1^11，之后80°0下滅活51^11結束反應。
[0005]作為本發明進一步的方案:步驟2中提取的DNA于-20°c保存備用。
[0006]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明提供的亞洲柑桔黃龍病LAMP快速 檢測技術操作簡便、對環境設施設備要求不高、成本低，且快速準確，特別適合對于亞洲柑 桔黃龍病的大規模初篩，為柑桔黃龍病的檢測與防控提供了一種新的手段;本發明的檢測 方法靈敏度比普通PCR高10000倍。
【附圖說明】
[0007]圖1為柑桔四種病原菌DNA樣品的LAMP反應曲線圖。
[0008]圖2為不同稀釋度DNA樣品的LAMP反應曲線圖。
[0009] 圖3為不同稀釋度DNA樣品的普通PCR凝膠電泳圖。
[0010] 其中，1-柑桔潰瘍病菌;2-亞洲柑桔黃龍病菌A;3-亞洲柑桔黃龍病菌B;4-柑果莖 點霉菌;5-柑桔炭疽病菌;6-亞洲柑桔黃龍病菌C; 7-柑桔健康葉片;8-雙蒸水；11: HLB-IO*3 稀釋度DNA; 22: HLB-10-1 稀釋度DNA; 33: HLB-10-2稀釋度DNA; 44: HLB-10-3稀釋度DNA; 55 : HLB-10-4 稀釋度 DNA; 66: HLB-10-5 稀釋度 DNA; 77: HLB-10-6 稀釋度 DNA; 88: HLB-10-7 稀釋度 DNA〇
【具體實施方式】
[0011]下面結合【具體實施方式】對本專利的技術方案作進一步詳細地說明。
[0012]請參閱圖1-3,一種快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測方法，包括以下步驟： 1) 引物設計： 采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，應用Clustal W進行多重比對，分析序列的 保守區，利用在線設計軟件Primer Explorer V 4.0,設計LAMP引物，包括2條外引物F3/B3， 2條內引物FIP/BIP，針對6個特定區域設計4條特異性引物，引物序列如下：
2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA; 2.2) 提取的DNA于-20°C保存備用； 3)LAMP特異性檢測： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各lyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶lyL，模板2yL，加 ddH20補足至25yL; 3.2) 將反應?0?管置于恒溫孵育器，651反應8〇1^11，之后80°0下滅活51^11結束反應。 [00 13] 實施例1 將本發明檢測方法應用新型環介導等溫擴增設備一一用GENIE Π 便攜式基因熒光擴 增儀進行擴增和檢測，檢測所建立檢測方法的特異性與靈敏度，并將其結果與常規PCR檢測 方法進行比較，結果表明本發明的方法靈敏度高，特異性好;具體情況如下： (1) 特異性試驗： 采用本發明的檢測方法，以柑桔黃龍病(3個樣）、潰瘍病（1個樣）、黑星病、炭疽病及健 康樣品DNA為模板，對雙蒸水作空白對照進行LAMP反應，檢測該方法的特異性，只有柑桔黃 龍病的3個樣品有擴增，結果表明該方法的特異性好，如附圖1所示； (2) 靈敏度試驗： 將DNA樣品依次稀釋為級，應用本發明檢測方法與常規PCR方法進行比較，結果 表明，應用本檢測方法，l〇Q-l〇-6級出峰時間從9minl9sec至9min49sec不等，10- 7稀釋度沒有 出現擴增曲線，說明DNA樣品的LAMP能檢測到10-6稀釋度，應用常規PCR檢測方法對于相同稀 釋度的DNA樣品進行靈敏度試驗，結果顯示，普通PCR能檢測到10- 2稀釋度。表明本檢測方法 靈敏度比普通PCR高10000倍;如附圖2-3所示。
[0014]上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方 式，在本領域的普通技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下 做出各種變化。
【主權項】
1. 一種快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 引物設計； 2) 核酸提取； 3. LAMP特異性檢測。2. 根據權利要求1所述的快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 引物設計： 采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，應用Clustal W進行多重比對，分析序列的 保守區，利用在線設計軟件Primer Explorer V 4.0,設計LAMP引物，包括2條外引物F3/B3， 2條內引物FIP/BIP，針對6個特定區域設計4條特異性引物，引物序列如下：2) 核酸提取： 2.1) 按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA; 2.2) 提取的DNA冷凍保存備用； 3. LAMP特異性檢測： 3.1) 取5XReaction Buffer 5yL，5ymol/L F3和B3引物各lyL，40ymol/L FIP和BIP引 物各IyL，Mg2+ 0.8yL，dNTPs 1.2yL，Bst DNA聚合酶IyL，模板2yL，加 CldH2O補足至25yL; 3.2) 將反應PCR管置于恒溫孵育器，65°C反應80 min，之后80°C下滅活5 min結束反應。3. 根據權利要求1所述的快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測方法，其特征在于，步 驟2中提取的DNA于-20°C保存備用。
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測亞洲柑桔黃龍病菌的LAMP檢測方法，包括以下步驟：1)引物設計：采用柑桔黃龍病菌的16SrDNA作為靶基因，設計4條LAMP特異性引物；2)核酸提取：按照CTAB法提取柑桔葉片總DNA；3)LAMP特異性檢測：取5×Reaction？Buffer、F3和B3引物、FIP和BIP引物、Mg2+、dNTPs、Bst？DNA聚合酶、模板、加ddH2O定容至25μL；將反應PCR管置于恒溫孵育器反應，之后滅活結束反應；本發明操作簡便、對環境設施設備要求不高、成本低，快速準確，特別適合對于亞洲柑桔黃龍病的大規模初篩，為柑桔黃龍病的檢測與防控提供了一種新的手段。
【IPC分類】C12R1/01, C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號】CN105524986
【申請號】CN201511003710
【發明人】黃麗莉, 李茵, 祝建新, 羅濤朋, 劉 英
【申請人】江西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年12月29日