針對流感的多價融合蛋白疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明的實施方式涉及分子生物學、生物技術、制備生物化學、醫學，并且可用于 預防由現有流感毒株以及由可能的重排列引起的流感。
【背景技術】
[0002] 術語"融合蛋白"指的是通過重組DNA分子的表達獲得的蛋白質，其中數個不同基 因的編碼陣列結合至一個閱讀框。
[0003] 每年，流感病毒影響5%到15%的人口，引起急性呼吸道疾病。每一年，生產并廣 泛使用針對季節性流感的疫苗。然而，存在具有新的基因組合的某些流感病毒毒株的廣泛 傳播的危險。這樣的病毒可以是更具攻擊性的并且引起更高水平的并發癥和死亡率。在 2009年，不利情況發生，其與高致病性流感病毒A (HlNl) pdm/09有關。疾病由具有新抗原 決定簇的流感病毒引起。具體而言，專家擔心這樣的事實：新病毒是病毒的重排列，其在動 物（豬）和人二者中傳播。根據WHO,對于A (HlNl) pdm/09,與感染的人接觸的人類的傳染 率為22%到33%。相比之下，季節性流感的模擬比率的范圍為從5%到15%。
[0004] 鑒于疫苗的開發，病毒表面蛋白血細胞凝集素（HA)是特別感興趣的。HA負責病毒 結合至細胞受體并且以這樣的方式易感染疾病。HA的突變通常導致流行病學的和有時廣泛 流行的病毒潛能的增強。
[0005] 正在針對病毒蛋白的抗原決定簇一一表位開發B-細胞和T-細胞應答。針對病毒 性感染即流感病毒的免疫一一基于使用由病毒表位表示的氨基酸序列一一顯示對于針對 病毒的免疫應答的開發大有希望并允許對于季節性感染發作和大流行病二者的預防創建 通用疫苗。在一種構建體中使用不同病毒亞型的抗原決定簇使多價疫苗的生產更容易并允 許創建針對新病毒毒株的有效疫苗。
[0006] 創建通用疫苗是必要的，其將能夠提供針對現有的和可能的重排列流感病毒毒株 的防衛。基于重組蛋白的疫苗的使用允許避免甚至與滅活病毒的注射關聯的風險。最近已 經進行了許多嘗試來創建這樣的通用安全的疫苗。
[0007] 存在這樣的發明，根據該發明，編碼禽流感病毒的多表位血細胞凝集素的基因在 載體構建體內使用，用于在植物中生產重組多表位疫苗（RU 2008139004 A，01. 10.2008)。 在專利申請US 2009106864 (2009)和RU 2008139004中，作者使用A型禽流感病毒血細胞 凝集素的共有序列，最優化密碼子用于在植物中表達。在專利申請JP2009102416 (2009) 中，作者在昆蟲細胞中使用桿狀病毒構建體，用于表達A型和B型流感病毒的血細胞凝集 素。這些方法的缺點是使用來自僅一種流感病毒亞型（H5N1)的蛋白（血細胞凝集素）序 列。這使疫苗活性譜變窄。而且，與在大腸桿菌中的表達相比，在植物和昆蟲細胞中的表達 提供更低的蛋白產率。
[0008] 已知數種融合多肽，其包括與包含五種免疫顯性的抗原表位的A型流感病毒的表 面HA-蛋白具有高同源性百分比的序列（RU 92004487, 10. 12. 1992)。這些多肽的建議應用 中的一種是提供針對相應抗原的疫苗，用于治療和預防（包括免疫治療方法）以防被這類 抗原感染。然而，沒有規定使用哪種亞型的血細胞凝集素。在開發通用疫苗的過程中，也應 當考慮B型流感病毒的血細胞凝集素的抗原決定簇，因為疫苗的免疫原性由其序列被使用 的毒株限制。
[0009] 已知多價流感疫苗包含多價抗流感抗原、佐劑、提供疫苗滲透的藥劑和可接 受的賦形劑（CN101450209, 31. 12. 2008)。由H1-H16和N1-N9表示的抗原稱為抗原 組分。還已知多價流感疫苗，其由表面病毒蛋白A/H1N1、A/H3N2、B型血細胞凝集素 (CN101524538, 26. 03. 2009)、佐劑-甘油或氫氧化鋁組成。融合構建體中可接受的佐劑和 抗原決定簇二者的使用以及使用單一蛋白類型一一血細胞凝集素將允許疫苗的生產簡單 化并降低生產成本，因為將不再必要調整條件和控制組分生產的質量。
[0010] 已知基于滅活病毒的多價疫苗。活性組分由抗原A/H1N1、H3N2、B、H5N1和A(HlNl) pdm/09表示（CN101732711，31. 12. 2009)。列舉的抗原從滅活病毒提取，這意味著疫苗的規 模擴大的生產可以被與病毒尤其是流感病毒的使用關聯的可能的問題所限制。例如，必須 創建適合的工作條件以處理容易傳播的高度致病的病毒毒株。而且，列舉的抗原為單獨的 蛋白質，在上面列舉了使用融合構建體的優點。
[0011] 本發明的原型是包含與人類細胞相互作用的流感病毒的至少四種蛋白 表位的鞭毛的混合物，其中每一種蛋白表位在沙門氏菌的鞭毛蛋白中單獨地表達 (W00032228, 30. 11. 1998)。列舉的表位涉及：（i)與B細胞相互作用的一種血細胞凝集素 表位，（ii)血細胞凝集素（HA)或核蛋白（NP)的一種表位，其可以結合至MHC分子，用于表 示輔助T細胞表面上的受體，和（iii)至少兩種核蛋白（NP)表位或基質蛋白（M)，其受白種 人顯性并且結合至細胞毒性T淋巴細胞（CTL)的MHC抗原限制。
[0012] 在本發明中，鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白FliC實現佐劑功能。由于其與Toll 樣受體-5 (TLR-5)相互作用，FliC刺激巨噬細胞和樹突細胞的成熟，這導致誘導免疫應 答（Me Dermott P. F. , High-affinity interaction between Gram-negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun.-2000· -V.68. -p. :5525 - 5529 ;Means T.K.等，The Toll-like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J. Immunol. -2003. - V. 170. - p. : 5165 - 5175) 〇
[0013] 此時，鞭毛蛋白是最有希望且充分研究的新一代佐劑中的一種。研究結果顯示與 鞭毛蛋白一起接種的重組蛋白具有更高的免疫原性和抗原性質。在更短的時間記錄對它們 的應答并誘導更強的細胞和體液免疫應答(Balaram, 2008) 〇
[0014] 這種發明的缺點在于免疫混合物的復雜性。包含不同的A型和B型流感病毒亞型 的B和T細胞表位的融合蛋白和鞭毛蛋白的使用將引發強烈的免疫應答并降低生產成本。 因此，僅使用鞭毛蛋白組分是實際的。兩個受體-活化位點在鞭毛蛋白的末端位點中被檢 測到（aa 79-117 和 aa 08-439) (Tonyia，2001) 〇
[0015] TLR-5在先天免疫的細胞、上皮和內皮細胞上表達（Sebastiani G.等，Cloning and characterization of the murine Toll-like receptor 5(Tlr5)gene: sequence and mRNA expression studies in Salmonella-susceptibleMOLF/Eimice. Genomics. -2000.-V. 64. - p. 230 - 240 ；Zarember K. A.和 Godowski P. J. ? Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products,and cytokines. J. Immunol. -2002. - V. 168. - p. 554 - 561 ：Delneste. 2007)。考慮到這一點，使用粘膜進行 免疫是實際的，這將使免疫原的運輸更容易。

【發明內容】

[0016] 本發明具體化了基于高度純化的融合蛋白（SEQ ID NO: 1)的疫苗，所述蛋白包括A 型流感病毒的蛋白Hl (281-461aa)、H3 (466-505aa)、H5 (510-549aa)的片段、以及B型流感 病毒血細胞凝集素的片段（554-593aa)、和作為佐劑的鞭毛蛋白組分--FliCl (l_169aa) 和FliC2(182-276aa);該組分經由柔性鉸鏈連接。所表示的蛋白片段是血細胞凝集素 H1、 H3、H5和B的保守區。在自然發生感染的過程中，針對它們生產特異性抗體，其與A型和B 型流感病毒的不同毒株之中的同源表位（homolog epitope)交叉反應。數種蛋白質的表位 的使用將允許增加疫苗的功效，并且由于連接表位的柔性鉸鏈，將提供蛋白質的正確的三 維結構，這將促進每個表位充分發揮功能。
[0017] 根據選擇的氨基酸序列，通過參考大腸桿菌的蛋白編碼基因中出現的密碼子計算 適當的核苷酸序列（SEQ ID NO: 2);同時，通過參考相應mRNA的dG的減少選擇密碼子。
[0018] 本發明的應用的主要技術結果是流感疫苗的效價增加：在引入本發明要求保護的 疫苗之后，形成針對A型和B型流感病毒二者的不同亞型一一針對現有的和甚至針對可以 由于任何其它流感病毒毒株的重排列出現的那些亞型一一的免疫。在疫苗引入之后，針對 來自不同的流感病毒毒株的血細胞凝集素的表位的抗體正在體內產生。因此，響應于流感 病毒感染而產生抗體的能力正在形成。其后，一旦被任何流感病毒感染則免疫應答將更快 形成，這將引起避免感染或者疾病將更溫和。這種方法將允許消除目前疾病。
[0019] 核苷酸序列的密碼子最優化的技術結果是蛋白質產率增加。
[0020] 因此，使用鞭毛蛋白組分作為無毒佐劑將增加免疫應答，發展為疫苗。
[0021] 該技術結果也降低價格并加速疫苗生產，這是由于單組分（融合蛋白）生產代替 了一組疫苗混合物（原型）組分。
[0022] 為了生產本發明的融合蛋白，可以使用分子生物學和微生物學的標準方法，其對 于本領域普通技術人員而言是熟悉的。這類方法在科學文獻中描述。
[0023] 附圖描沐
[0024] 圖1.用1LD/50的病毒A/PR/8/34(HlNl)感染后小鼠存活率的動力學。感染后的 天數在橫軸上展現，并且縱軸顯示小鼠存活率的百分比。
[0025] 圖2.用1LD/50的A/California/07/09(H1N1)感染后小鼠存活率的動力學。感 染后的天數在橫軸上展現，小鼠存活率的百分比在縱軸上。
[0026] 圖3.針對B/Fl