一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，包括H7N9禽流感工作種子批毒種的建立、病毒接種與培養、病毒滅活、病毒收獲液澄清與濃縮、病毒純化、病毒裂解、再滅活、除糖除裂解劑、除菌過濾及半成品配制步驟；采用該方法制備的H7N9型流感疫苗免疫原性強，抗原譜廣，質量穩定，純度高，安全性好，成本低，適合于大規模生產，具有較大的應用價值。
【專利說明】一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于疫苗制備領域，具體涉及一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002]禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒引起的傳染性疾病，被國際獸疫局定為甲類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟，它能感染人類，人感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很高；目前，主要采用疫苗進行預防，所用疫苗包括病毒滅活疫苗、減毒疫苗、重組亞單位疫苗等。
[0003]流感病毒顆粒外膜由兩型表面糖蛋白覆蓋，一型為血細胞凝集素(即H)，一型為神經氨酸酶(即N)，H又分15個亞型，N分9個亞型。所有人類的流感病毒都可以引起禽類流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人類流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以傳染給人，其中H5為高致病性，H3為人犬共患；依據流感病毒特征可分為HxNx共135種亞型，H7N9亞型禽流感病毒是其中的一種，往往在禽間發現，未發現過人感染的情況，這個病毒的生物學特點、致病力、傳播力，還沒有依據進行分析判斷。
[0004]在針對禽流感H7N9病毒的疫苗研究方面，現有技術中尚未見良好療效的針對H7N9亞型的粘膜免疫疫苗，更未有良好療效的針對H7N9亞型病毒的多表位粘膜免疫疫苗，面對可能的禽流感H7N9病毒感染的流行，人們迫切需要一種新型、高效的疫苗來預防禽流感。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提`供一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，該方法制備得到的疫苗能預防H7N9型病毒的感染。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
提供一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，包括以下步驟:
(1)禽流感工作種子批毒種的建立:將來自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接種11日齡的SPF雞胚，建立禽流感主代種子批毒種，從該禽流感主代種子批毒種中選擇血凝效價高的毒種作為工作種子批建立毒種；
(2)病毒接種與培養:于10日齡健康SPF雞胚尿囊腔接種稀釋為10_5稀釋度的H7N9禽流感工作種子批毒種，每胚0.1ml ;將雞胚置33~35°C培養4(T60小時；挑選活胚置4°C冷胚15~20小時，收獲病毒尿囊液；
(3)病毒滅活:將獲得的病毒尿囊液中加入甲醛在2~8°C下滅活24~36小時；
(4)病毒收獲液澄清與濃縮:將滅活后的尿囊液進行澄清過濾，即經10um濾膜粗濾后，再經0.45um濾膜進行兩次過濾，然后用相對分子質量為1000K的超濾膜進行過濾和濃縮，最后用0.01mol/l的PBS濃縮，濃縮液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；
(5)病毒純化:蔗糖速率區帶離心:分別用33%和56%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度離心3小時；
(6)病毒裂解:純化后的病毒液加入等量的終濃度為0.3^1.0%的Triton X-100，混勻后置20~25°C下作用2小時；
(7)再滅活:將步驟(6)制得的裂解液加入甲醛在2~8°C下滅活24~36小時；
(8)除糖除裂解劑:將步驟(6)制得的裂解物用相對分子質量為100K的超濾膜超濾濃縮10倍，去除蔗糖和大部分裂解劑；再用0.01mol/1的PBS濃縮20倍，最后用蔗糖密度梯度離心進行純化，并收集各區段病毒液，進行血凝滴度、卵清蛋白和內毒素含量測定；其中，蔗糖密度梯度離心是在25000rpm/min的條件下離心f 3小時；
(9)除菌過濾:將步驟(8)制得的病毒純化液用0.2um孔徑的濾膜過濾即為單價原液；
(10)半成品配制:根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氫 氧化鋁佐劑，混勻后于2(T25°C攪拌吸附4小時，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。
[0007]步驟(5)中，病毒純化的具體過程為:當區帶離心轉速達到3000rpm/min時，泵入病毒液、33%蔗糖及56%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進樣完畢，同時調節機器轉速至25000rpm/min,離心 3 小時。
[0008]綜上所述，本發明的制備方法制備的H7N9型流感疫苗免疫原性強，抗原譜廣，質量穩定，純度高，安全性好，成本低，適合于大規模生產，具有較大的應用價值。
【具體實施方式】
[0009]下面結合實施例對本發明進行詳細的描述，但它們不是對本發明的進一步限制。
[0010]實施例1
本實施例的禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，包括以下步驟:
將來自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接種11日齡的SPF雞胚，建立禽流感主代種子批毒種，從該禽流感主代種子批毒種中選擇血凝效價高的毒種作為工作種子批建立毒種；將上述制得的H7N9禽流感工作種子批毒種用滅菌生理鹽水稀釋為10_5稀釋度，接種于10日齡健康SPF雞胚尿囊腔，病毒接種量為0.1ml/胚，將雞胚置33°C培養40小時；挑選活胚置4°C冷胚15小時，收獲病毒尿囊液；
將獲得的病毒尿囊液中加入甲醛在2°C下滅活24小時；將滅活后的尿囊液進行澄清過濾，即經10 um濾膜粗濾后，再經0.45um濾膜進行兩次過濾，然后用相對分子質量為1000K的超濾膜進行過濾和濃縮，最后用0.01mol/1的PBS濃縮，濃縮液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；
再分別用33%和56%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度離心3小時進行病毒純化；其中，純化的具體過程為:將空區帶離心轉頭先放入離心機，選擇區帶離心功能并啟動，當區帶離心轉速達到3000rpm時,打開離心機倉門，放上上樣頭,開始上樣,從進樣口的邊孔以50ml/min的泵流速先后加入單型病毒液樣品、33%蔗糖和56%蔗糖，其中33%蔗糖的加入量為病毒樣品量的1/2，56%蔗糖的加入量為將區帶離心轉頭加滿使有少數液體從中孔留出為止，改變泵的方向，從中孔以相同速度加入PBS作為封閉液，上樣完后，取出上樣頭，關閉倉門，離心開始。3h后，待離心轉速降至3000rpm時，打開離心機倉門，并在出口處連接紫外分光光度檢測儀測定病毒液流出的OD值；由于過濾濃縮后的病毒液中仍含有許多物質，隨著病毒液的流出可以看到紫外分光儀OD值的變化。以OD值變化范圍為單位收集病毒液，進行相應血凝效價、卵清蛋白含量、內毒素檢測，以確定合適的用于制備流感裂解滅活疫苗的病毒液所對應的紫外分光儀OD值區間，同時記錄單位時間出樣的OD值進行檢測，尋找規律用于今后大量生產時直接收集相應OD值區段的純化病毒液。最后分區段收集病毒液并分別測定血凝效價、卵清蛋白含量、內毒素檢測，收集血凝效價高，卵清蛋白含量和內毒素低的病毒液合并。
[0011]將上述純化后的病毒液加入等量的終濃度為0.3%的Triton X-100,混勻后置20°C下作用2小時，再加入甲醛在2°C下滅活24小時，制得裂解液；將制得的裂解物用相對分子質量為100K的超濾膜超濾濃縮10倍，去除蔗糖和大部分裂解劑；再用0.01mol/1的PBS濃縮20倍，最后用蔗糖密度梯度離心進行純化，并收集各區段病毒液，進行血凝滴度、卵清蛋白和內毒素含量測定；其中，蔗糖密度梯度離心是在25000rpm/min的條件下離心I小時，制得病毒純化液；將病毒純化液用0.2um孔徑的濾膜過濾即為單價原液；根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氫氧化鋁佐劑，混勻后于20°C攪拌吸附4小時，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品；將上述半成品采用洗烘灌聯動機組分裝，凍干、真空壓塞和軋蓋， 制得凍干疫苗成品，并于2l°C冷庫保存。
[0012]實施例2
本實施例的禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，包括以下步驟:
將來自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接種11日齡的SPF雞胚，建立禽流感主代種子批毒種，從該禽流感主代種子批毒種中選擇血凝效價高的毒種作為工作種子批建立毒種；將上述制得的H7N9禽流感工作種子批毒種用滅菌生理鹽水稀釋為10_5稀釋度，接種于10日齡健康SPF雞胚尿囊腔，病毒接種量為0.1ml/胚，將雞胚置35°C培養60小時；挑選活胚置4°C冷胚20小時，收獲病毒尿囊液；
將獲得的病毒尿囊液中加入甲醛在8°C下滅活36小時；將滅活后的尿囊液進行澄清過濾，即經10 um濾膜粗濾后，再經0.45um濾膜進行兩次過濾，然后用相對分子質量為1000K的超濾膜進行過濾和濃縮，最后用0.01mol/1的PBS濃縮，濃縮液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；
再分別用33%和56%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的離心速度離心3小時進行病毒純化；其中，純化的具體過程為:將空區帶離心轉頭先放入離心機，選擇區帶離心功能并啟動，當區帶離心轉速達到3000rpm時,打開離心機倉門，放上上樣頭,開始上樣,從進樣口的邊孔以50ml/min的泵流速先后加入單型病毒液樣品、33%蔗糖和56%蔗糖，其中33%蔗糖的加入量為病毒樣品量的1/2，56%蔗糖的加入量為將區帶離心轉頭加滿使有少數液體從中孔留出為止，改變泵的方向，從中孔以相同速度加入PBS作為封閉液，上樣完后，取出上樣頭，關閉倉門，離心開始。3h后，待離心轉速降至3000rpm時，打開離心機倉門，并在出口處連接紫外分光光度檢測儀測定病毒液流出的OD值；
由于過濾濃縮后的病毒液中仍含有許多物質，隨著病毒液的流出可以看到紫外分光儀OD值的變化。以OD值變化范圍為單位收集病毒液，進行相應血凝效價、卵清蛋白含量、內毒素檢測，以確定合適的用于制備流感裂解滅活疫苗的病毒液所對應的紫外分光儀OD值區間，同時記錄單位時間出樣的OD值進行檢測，尋找規律用于今后大量生產時直接收集相應OD值區段的純化病毒液。最后分區段收集病毒液并分別測定血凝效價、卵清蛋白含量、內毒素檢測，收集血凝效價高，卵清蛋白含量和內毒素低的病毒液合并。
[0013]將上述純化后的病毒液加入等量的終濃度為1.0%的Triton X-100，混勻后置25°C下作用2小時，再加入甲醛在8°C下滅活36小時，制得裂解液；將制得的裂解物用相對分子質量為100K的超濾膜超濾濃縮10倍，去除蔗糖和大部分裂解劑；再用0.01mol/1的PBS濃縮20倍，最后用蔗糖密度梯度離心進行純化，并收集各區段病毒液，進行血凝滴度、卵清蛋白和內毒素含量測定；其中，蔗糖密度梯度離心是在25000rpm/min的條件下離心3小時，制得病毒純化液；將病毒純化液用0.2um孔徑的濾膜過濾即為單價原液；根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氫氧化鋁佐劑，混勻后于25°C攪拌吸附4小時，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品；將上述半成品采用洗烘灌聯動機組分裝，凍干、真空壓塞和軋蓋，制得凍干疫苗成品，并于2l°C冷庫保存。
[0014]實施例3
本實施例的禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，包括以下步驟:
將來自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接種11日齡的SPF雞胚，建立禽流感主代種子批毒種，從該禽流感主代種子批毒種中選擇血凝效價高的毒種作為工作種子批建立毒種；將上述制得的H7N9禽流感工作種子批毒種用滅菌生理鹽水稀釋為10_5稀釋度，接種于10日齡健康SPF雞胚尿囊腔，病毒接種量為0.1ml/胚，將雞胚置34°C培養50小時；挑選活胚置4°C冷胚17小時，收獲病毒尿囊液；
將獲得的病毒尿囊液中加入甲醛在5°C下滅活30小時；將滅活后的尿囊液進行澄清過濾，即經10 um濾膜粗濾后，再經0.45um濾膜進行兩次過濾，然后用相對分子質量為1000K的超濾膜進行過濾和濃縮，最后用0.01mol/1的PBS濃縮，濃縮液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液；`
再分別用33%和56%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的離心速度離心3小時進行病毒純化；其中，純化的具體過程為:將空區帶離心轉頭先放入離心機，選擇區帶離心功能并啟動，當區帶離心轉速達到3000rpm時,打開離心機倉門，放上上樣頭,開始上樣,從進樣口的邊孔以50ml/min的泵流速先后加入單型病毒液樣品、33%蔗糖和56%蔗糖，其中33%蔗糖的加入量為病毒樣品量的1/2，56%蔗糖的加入量為將區帶離心轉頭加滿使有少數液體從中孔留出為止，改變泵的方向，從中孔以相同速度加入PBS作為封閉液，上樣完后，取出上樣頭，關閉倉門，離心開始。3h后，待離心轉速降至3000rpm時，打開離心機倉門，并在出口處連接紫外分光光度檢測儀測定病毒液流出的OD值；
由于過濾濃縮后的病毒液中仍含有許多物質，隨著病毒液的流出可以看到紫外分光儀OD值的變化。以OD值變化范圍為單位收集病毒液，進行相應血凝效價、卵清蛋白含量、內毒素檢測，以確定合適的用于制備流感裂解滅活疫苗的病毒液所對應的紫外分光儀OD值區間，同時記錄單位時間出樣的OD值進行檢測，尋找規律用于今后大量生產時直接收集相應OD值區段的純化病毒液。最后分區段收集病毒液并分別測定血凝效價、卵清蛋白含量、內毒素檢測，收集血凝效價高，卵清蛋白含量和內毒素低的病毒液合并。
[0015]將上述純化后的病毒液加入等量的終濃度為0.7%的Triton X-100,混勻后置23°C下作用2小時，再加入甲醛在5°C下滅活30小時，制得裂解液；將制得的裂解物用相對分子質量為IOOK的超濾膜超濾濃縮10倍，去除蔗糖和大部分裂解劑；再用0.01mol/1的PBS濃縮20倍，最后用蔗糖密度梯度離心進行純化，并收集各區段病毒液，進行血凝滴度、卵清蛋白和內毒素含量測定；其中，蔗糖密度梯度離心是在25000rpm/min的條件下離心2小時，制得病毒純化液；將病毒純化液用0.2um孔徑的濾膜過濾即為單價原液；根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氫氧化鋁佐劑，混勻后于23°C攪拌吸附4小時，即為半成品H7N9禽流感病毒裂解疫苗，將上述半成品采用洗烘灌聯動機組分裝，凍干、真空壓塞和軋蓋，制得凍干疫苗成品，并于2l°C冷庫保存。
[0016]雖然結合具體實施例對本發明的【具體實施方式】進行了詳細地描述，但并非是對本專利保護范圍的限定。在權利要求書所限定的范圍內，本領域的技術人員不經創造性勞動即可做出的各種修改或調整仍受本專利的保護。
【權利要求】
1.一種禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)禽流感工作種子批毒種的建立:將來自于NIBSC的H7N9株禽流感病毒接種11日齡的SPF雞胚，建立禽流感主代種子批毒種，從該禽流感主代種子批毒種中選擇血凝效價高的毒種作為工作種子批建立毒種； (2)病毒接種與培養:于10日齡健康SPF雞胚尿囊腔接種稀釋為10_5稀釋度的H7N9禽流感工作種子批毒種，每胚0.1ml ;將雞胚置33~35°C培養40飛0小時；挑選活胚置4°C冷胚15~20小時，收獲病毒尿囊液； (3)病毒滅活:將獲得的病毒尿囊液中加入甲醛在40°C下滅活24~36小時； (4)病毒收獲液澄清與濃縮:將滅活后的尿囊液進行澄清過濾，即經10um濾膜粗濾后，再經0.45um濾膜進行兩次過濾，然后用相對分子質量為1000K的超濾膜進行過濾和濃縮，最后用0.01mol/l的PBS濃縮，濃縮液中再加入0.25mol/lPB回收病毒液； (5)病毒純化:蔗糖速率區帶離心:分別用33%和56%蔗糖作為蔗糖密度梯度，以25000rpm/min的速度離心3小時； (6)病毒裂解:純化后的病毒液加入等量的終濃度為0.3^1.0%的Triton X-100，混勻后置20~25°C下作用2小時； (7)再滅活:將步驟(6)制得的裂解液加入甲醛在2~8°C下滅活24~36小時； (8)除糖除裂解劑:將步驟(6)制得的裂解物用相對分子質量為100K的超濾膜超濾濃縮10倍，去除蔗糖和大部分裂解劑；再用0.01mol/1的PBS濃縮20倍，最后用蔗糖密度梯度離心進行純化，并收集各區段病毒液，進行血凝滴度、卵清蛋白和內毒素含量測定；其中，蔗糖密度梯度離心是在25000`rpm/min的條件下離心f 3小時； (9)除菌過濾:將步驟(8)制得的病毒純化液用0.2um孔徑的濾膜過濾即為單價原液； (10)半成品配制:根據所配制的半成品總量計算原液用量，使血凝素含量為120ug/ml，再加入2.4 mg/ml的氫氧化鋁佐劑，混勻后于2(T25°C攪拌吸附4小時，即配制成H7N9禽流感病毒裂解疫苗的半成品。
2.根據權利要求1所述的禽流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于:步驟(5)中，病毒純化的具體過程為:當區帶離心轉速達到3000rpm/min時,泵入病毒液、33%鹿糖及56%蔗糖，并加入PBS作為封閉液，進樣完畢，再調節機器轉速至25000rpm/min，離心3小時。
【文檔編號】A61K39/145GK103520716SQ201310401419
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】侯文禮, 馮曉 申請人:成都康華生物制品有限公司