專利名稱：選擇性裂解的全細胞疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學、免疫學和細菌學。具體而言，本發明的實施方式提供了全細胞免疫原性制劑，該制劑賦予了抗體介導和T淋巴細胞介導相協同的免疫應答。就肺炎雙球菌(pneumococci)而言,該全細胞免疫原性制劑誘發了抗體介導和T淋巴細胞介導(包括IL-17A介導的)相協同的針對致死性感染和粘膜肺炎雙球菌定殖(colonization)的防護作用。
背景技術：
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae ;肺炎雙球菌)感染是世界范圍內發病和死亡的主要原因，并在兒童和老年人中引發重病(包括肺炎、腦膜炎和菌血癥)和一些不太嚴重的感染(如中耳炎)。在發展中國家，每年幾乎有一百萬兒童死于肺炎雙球菌疾病的感染。肺炎鏈球菌多藥耐藥菌株的快速出現限制了抗生素的效力并鼓舞了利用疫苗預防肺炎雙球菌感染的新一輪興趣。獲批的肺炎雙球菌疫苗由血清型特異性的莢膜多糖或莢膜多糖-蛋白綴合物的可注射多價混合物組成，并因此僅對所包含的血清型有效。例如，盡管7價肺炎雙球菌綴合物疫苗(PCV7)顯著地降低了疫苗型(VT)菌株引起的侵襲性肺炎雙球菌疾病的發病率，但是最近的研究顯示出非VT血清型逐步取代了 VT血清型，潛在地限制了疫苗的有用性。這使得對如下內容進行了評估是否可通過血清型非依賴性抗原(serotype-independent antigens)的免疫接種來預防肺炎雙球菌的定殖。例如,用在整個肺炎鏈球菌種中廣泛保守的某些蛋白進行的粘膜免疫顯示出誘發全身性的、粘膜抗體并賦予了針對肺炎雙球菌疾病和定殖的防護作用。繼續對免疫原性組合物(包含肺炎鏈球菌多糖和蛋白)的鑒定進行研究，所述組合物針對所有血清型均引起抗體介導的免疫應答和T淋巴細胞介導的強免疫應答這兩種免疫應答。可選策略使用了滅活的肺炎雙球菌細胞(提呈多種血清型非依賴性的抗原)作為廉價疫苗，但是此前未對這些組合物的免疫原性進行足夠的探究。因此，對制備全細胞肺炎雙球菌疫苗的新策略和了解相關免疫機理存在需要
發明內容
本文中給出的實施方式提供了包括革蘭氏陽性細菌(例如肺炎雙球菌)細胞制劑的免疫原性組合物，所述制劑已通過具有如下特點的方法滅活增加了經傳統方法滅活的制劑中未發現的免疫原性組分的暴露，并且保留了細菌尺寸顆粒的優點用于抗原攝取。所述免疫原性組合物包括滅活的、全細胞制劑的細胞部分(cellular fraction)和上清液(例如，溶劑或水相)部分，該組合物與分別給予的細胞部分和可溶部分(soluble fraction)相t匕，顯示出協同的免疫原性性質。這些免疫原性組合物并不依賴于肺炎雙球菌的莢膜多糖，提供莢膜血清型非依賴性的免疫原性在某些實施方式中，所述肺炎雙球菌為無莢膜的變體。在某些實施方式中，所述肺炎雙球菌為缺乏IytA基因(指定(specifies)主要的自溶素)的變體，因此，這一肺炎雙球菌變體的培養物可生長到相對高的密度而不自溶。在其它實施方式中，已對肺炎鏈球菌溶血素(PdT，細胞毒素)的基因進行了取代以指定突變的蛋白PdT，所述突變蛋白PdT無毒，但仍然是TLR4激動劑(具有引發(engage)固有免疫系統的能力)。在本發明的一個實施方式中，用試劑(如￠-丙內酯(BPL))對肺炎雙球菌細胞進行處理(滅活)(a)該試劑以釋放出多種保護性免疫原的方式使細胞部分裂解，所述免疫原經驗證為可溶分子；(b)該試劑可被除去而不用對收集的細胞進行漂洗，從而使釋放入懸浮液中的免疫原可容易地被保留在制劑中；以及(C)該試劑維持了肺炎雙球菌細胞的整體結構，以促進通過對具有TLR配體的細菌尺寸顆粒進行應答的免疫系統的傳入支(afferent limb)的那些組件進行的攝取。在類似的實施方式中，所述試劑為氯仿或三氯乙烯。在另一實施方式中，通過包括聲波處理的方法來制備所述全細胞免疫原性組合物制劑。可通過注射、也可通過鼻腔途徑、舌下途徑、頰(buccal)途徑或透皮途徑給予本發明的免疫原性組合物。所述免疫原性組合物可與適當的佐劑(如鋁佐劑(alum)或腸毒素相關分子(例如霍亂毒素))聯合使用。本文所述的肺炎雙球菌免疫原性組合物制造起來相對簡單且廉價，并且比之前所述的肺炎雙球菌疫苗更加有效。例如，少至I. g的劑量顯著地使小鼠免于致死實驗性肺炎。


圖IA顯示出在所示劑量時(X軸)，與經乙醇處理的細胞制備的肺炎雙球菌全細胞(WC)疫苗(WCE)相比，使用氯仿處理的細胞制備的肺炎雙球菌全細胞(WC)疫苗(WCC)增強的保護作用。每隔一周，將疫苗以所示劑量經鼻內給予小鼠，共給予兩次，所述疫苗使用Iug的霍亂毒素(CT)作為佐劑。在最后一次免疫接種3周后，用不同的血清型(血清型6B)經鼻內對小鼠進行激發(challenged)。在激發I周后，對每鼻腔洗滌物的菌落形成單位(CFU)進行測定。在比WCE的劑量低10-100倍時，WCC具有顯著的保護作用。圖IB顯示出在IO8劑量時WCB (使用3 -丙內酯制備的WC疫苗)的保護作用(圖6A和圖6B顯示出其在單獨的測試中具有與WCC等同的效力)。圖IC給出了 WCE、WCC以及WCC離心后的上清液部分(WCCsu)的比較；劑量為IO8的WCE或IO8的WCC或等價量的WCC上清液。所示的組接受CT (霍亂毒素)作為佐劑；一個對照組接受鹽水而不是CT ；WCCsu的保護作用大于WCE，具有統計顯著性。圖ID顯示出裂解物具有同等的保護作用，圖IE顯示出通過血細胞檢測的，該裂解物同等地在體外致敏了 IL-17A的應答，IL-17A為定殖模型中的保護作用的相關物(correlate)。圖2A-圖2B顯示出激發前免疫應答與定殖和吸入性膿毒病模型中的保護作用的關系。將劑量為Iy g、10yg或IOOiIg的WCB(使用￠-丙內酯制備的WCV)吸附至Al (OH) 3 (0. 2Img Al/劑)，并每隔兩周經皮下注射一次，共注射三次。圖2A顯示出血清型6B的定殖與IL-17A應答的關系；定殖與IL-17A的激發前濃度呈反相關。圖2B顯示出吸入性膿毒病模型中的存活率與抗WCA (全細胞抗原)IgG的激發前滴度范圍的關系。在第三次給藥8天后，將小鼠用異氟醚麻醉并經鼻內(i. n.)給予處于100 u L PBS中的IO6CFU的血清型3菌株WU2。這一模型一般在激發后的I周內在大多數(> 90%)首次接受試驗的小鼠(naivemice)體內誘發膿毒病。存活率隨滴度升高而增高，并且在滴度> 10，000任意單位(arbitrary units)時，存活率為 100%。圖3A和圖3B顯示出由肺炎雙球菌細胞(具體地，RM200細胞)釋放的蛋白的 SDS-PAGE的放射顯影照片。圖3A顯示出經氯仿滅活的細胞懸液離心(16，OOOXg ；5min)后的上清液(su) (WCCsu)或經另一有機溶劑三氯乙烯滅活的細胞懸液離心(16，OOOXg;5min)后的上清液(WCTsu);這兩種制劑在滅活后均未漂洗。將其與用乙醇滅活的疫苗懸液的上清液(WCEsu)進行比較，該疫苗在傳統疫苗制備過程中進行了漂洗；僅殘余了痕量的上清液蛋白。圖3B顯示出經P -丙內酯滅活的細胞的上清液(WCBsu)，類似地，該上清液在滅活后未漂洗。圖4A和圖4B顯示出通過WCB上清液或沉淀物(pellet)(細胞)部分的誘導，致敏IL-17A對WCA的應答(圖4A)和抗體對WC抗原的應答(圖4B)。通過在16，000 X g離心30min制備所述上清液(WCBsup)。將抗原吸附至Al (OH) 3(0. 24mg Al/劑)。各小鼠每次免疫接種時接受30 yg的劑量(蛋白含量)。將小鼠每隔兩周進行免疫接種，共免疫接種兩次，在第二次免疫接種I周后取血樣用于分析。細胞部分在誘發IL-17A的應答中更加有效，而上清液在誘發抗體應答中同樣有效或更有效。圖5A-圖5C顯示出Al (OH)3吸附對WCC的免疫原性的影響。將抗原在4°C孵育18h，同時輕緩地混合，從而提供Iii g、IOiig或IOOiig的蛋白和0.21mg Al/0. 2ml劑。將吸附或未吸附的抗原或者單獨的Al (OH)3每隔兩周于下背區域(lower back area)的皮膚下注射到小鼠體內，共注射三次。在第三次注射2周后，用肺炎雙球菌6B型菌株0603激發小鼠。在激發10天后，對從鼻腔洗滌物樣品中回收的CFU進行測定。在第8列數據中，WCC-Al (OH)3制劑在37°C孵育了 I個月，在注射前儲存于4°C( A標出)。圖5A顯示出通過第二次注射兩周后所取血樣檢測的在體外致敏IL-17A對WCA的應答；圖5B為在那些血樣中通過ELISA測定的抗WCA的IgG抗體。圖5C顯示出將血清型6B從鼻咽的清除。除非標明，在該圖和隨后的圖中，通過Mann-Whitney U計算出的與單獨的佐劑相比較的差異顯著性以星號示出:*P〈0. 05，**p〈0. 01和***p〈0. 001。依據所有三個標準，Al (OH)3都使得免疫原性極大地增高。圖6A-圖6B給出了 WCC與@ -丙內酯滅活細胞(WCB)制成的抗原之間的比較；以及CD4+細胞在定殖模型中的作用。實驗安排、分析和激發與圖5中一樣。圖6A顯示出IL-17A的致敏；劑量-應答顯示出WCB與WCC的免疫原性相當。圖6B顯示出對將血清型6B菌株從鼻咽的清除；依據這一標準，WCB和WCC同樣有效。通過在激發前I天和激發后2天、5天、8天給予⑶4抗血清，對WCC免疫動物組的⑶4+細胞依賴性進行評價(在標注α -⑶4的列中)；在這些動物中，上述增強的清除被消除。圖7Α-圖7C顯示出WCB的3次注射實驗安排或2次注射實驗安排對致死的血清型3吸入性膿毒病的影響。將劑量為I μ g、10 μ g或100 μ g的WCB吸附至Al (OH)3CO. 2ImgAl/劑)并每隔兩周給予。圖7A顯示出在3次注射實驗安排中，在第三次給藥8天后，將小鼠用異氟醚麻醉并經鼻內給予處于IOOyL PBS中的IO6CFU的菌株WU2。示出了存活曲線。將7天后仍活著的小鼠處死，并培養以驗證肺炎雙球菌菌血癥僅有的菌血癥動物為單用Al (OH)3的三個對照中的兩個。與100 μ g的劑量一樣，IOyg的劑量具有完全的保護作用。在所示組中評價保護作用對CD4+細胞的依賴性，在激發前I天和激發后3天向所 示組給予CD4抗血清；與定殖模型相反，沒有可檢測到的保護作用的消除，表明單獨的抗體應答對保護作用來說是足夠的。圖7B和圖7C顯示出更簡單的2次注射實驗安排。圖7C顯示出在激發前2天所取的血漿樣品中，給予了 100 yg劑量的所有動物具有超過10，000的滴度，而給予了 10 μ g劑量的動物中并非所有的動物都具有超過10，000的滴度。在第二次給藥9天后，小鼠被激發，如同圖7A中一樣將存活率繪制成圖表；對于10μ g劑量，保護作用是部分的，對于100 μ g劑量，保護作用是完全的，這與抗體應答的情況一致。圖8A-圖SC顯示出兔子免疫接種研究的結果。在第I天、第15天和第29天，經肌內注射向各包括三只雌性新西蘭白兔的組分別給予鹽水；單獨的Al (OH)3 (O. 6mg Al);劑量為50 μ g、500 μ g或5000 μ g的Al (OH)3吸附的WCB ;或DTwP疫苗(毒性對照)。在免疫接種前和在第43天取血清。圖8A顯示出在第43天時抗WCA的血清IgG抗體的滴度劑量依賴性地增高。圖8B反映了被動保護利用來自兔子的第45天的混合血清(pools of sera)檢測血清型3小鼠肺炎模型中的被動保護，所述兔子用Al (OH) 3和Al (OH) 3吸附的WCB以500 μ g的劑量進行了免疫接種。將血清在56°C加熱30min以使補體失活。如圖7A中所述，在用菌株WU2激發前一天，經腹膜內向小鼠給予200 μ L的其中一種混合血清和300 μ LPBS。存活曲線顯示出了免疫血清的完全保護作用。圖8C顯示出調理吞卩遼(opsonophagocytic)滅活分析。將來自于用單獨的鋁佐劑或鋁佐劑吸附的WCB (500 yg/劑)免疫接種了三次的兔子的血清經加熱處理后，用于使用血清型6B肺炎雙球菌菌株(0603 )進行的表面滅活分析中。在所測試的三個稀釋度(1/5、1/20和1/80)下，與處在同樣稀釋度的免疫前血清相比，免疫血清顯著地增高了肺炎雙球菌的調理吞噬滅活。通過Mann-Whitney U檢驗，**P〈0. 008。圖9A-圖9B詳細地示出了小鼠對Al (OH) 3吸附的WCB (通過皮下注射給予三次)的劑量-應答。圖9A :IgG抗體應答；圖9B :IL-17A應答。依據這兩種標準，基于滅活前的活細胞計數，最佳劑量為3. 3E7，對應的蛋白劑量為33 μ g。通過3. 3yg而非Iyg產生了統計上顯著的IL-17A應答，而顯著的抗體應答是由少至I μ g產生的。除非另作說明，如本文所使用的并貫穿本申請文件的E5=105、E6=106、E7=107、E8=108、E9=109、E10=101CI，依此類推。圖10A-10B顯示出在所示劑量時,經頰途徑和舌下途徑的WCC抗原的免疫原性(基于滅活前的活細胞計數)，利用 ο μ g雙重突變的LT佐劑R192G/L211A (dmLT)—起進行測試。以周為間隔免疫接種三次。如圖2中所述進行激發。圖10A繪制了抗全細胞抗原(WCA)血漿抗體的滴度(這里，頰途徑被稱作“ 口腔”途徑)；如左側所示，盡管比皮下途徑低得多，但是經上述兩種途徑都存在著可測的對WCC的抗體應答；圖IOB反映了通過血細胞檢測的在體外致敏IL-17A對WCA的應答(pg/ml，y軸)；上述兩種途徑都存在著劑量依賴的應答。圖IlA顯示出頰途徑和舌下途徑都誘導了劑量依賴性地增高的將血清型6B從鼻咽的清除。圖IlB顯示出IL-17A生成和定殖之間的相關性。圖IlC顯示出血清型應答和定殖之間的相關性。圖12A和圖12B給出了當將WCC與大腸桿菌(E. coli)不耐熱毒素(LT) 一起給予時的免疫原性數據(抗WCA IgG和IL-17A)。圖12C和圖12D顯示出超聲產生的WCC片段經透皮途徑(TCI)的免疫原性。以等同于IO8細胞的劑量，將在紗布貼劑中的平均直徑為IOOnm或20nm的片段連同I μ gLT佐劑(如果示出)一起施用到被輕輕摩擦以去除角質層的背部皮膚上。將所述貼劑留在原位18h。以兩周為間隔將這一免疫接種進行三次。在第三次免疫接種10天后取血樣用于IL-17A的分析，在6天后進行肺炎雙球菌的激發。圖12C顯示出對于經TCI和經i. η.給予，通過血細胞檢測的在體外致敏IL-17A對WC抗原的應答的數據的比較。圖12D :TCI給藥和i. η.給藥間的血清型6Β定殖清除數據的比較。對于其他細節，參見圖 IA-圖 IE 的描述。*Ρ〈0· 05、**Ρ〈0. 005、***Ρ〈0. 0005。圖13Α-圖13C顯示出免疫接種的次數和劑量與抗體應答(圖13Α)、IL-17A應答(圖13Β)以及定殖(圖13C)之間的關系。圖14顯示出IL-17A刺激(stimulation)數據,其中，“sup”表示利用WCB離心后收集的上清液進行刺激。圖15顯示出與鹽水相比，單獨給予的佐劑顯示出了加速肺炎雙球菌清除的跡象(雖然統計學上并不顯著)，該跡象為這一模型中的預期結果，在這一模型中接種和激發通過相同的途徑進行。然而，當和IO8的WCE —起給予時，mLT可提供出色的保護作用。
具體實施例方式本文的發明并不限于本文所述的和那些可變化得到的具體方法學、方案和試劑等。本文所使用的術語僅出于描述具體實施方式
的目的，而并不意圖限制本發明的范圍，本發明的范圍只通過權利要求進行限定。除非上下文中清楚地另有所示，本文和權利要求中所使用的單數形式包括復數的情況，反之亦然。除了在操作實施例中以外，或另有所示，本文所使用的所有表示成分的量或反應條件的數字均應被理解為在所有情況下由術語“大約”修飾。為了描述和公開的目的，所有的專利和其它已確定的出版物在此明確地引入本文作為參考，例如，所述出版物中描述的方法學的使用可能與本發明相關。這些出版物僅因為它們的公開早于本發明的申請日而提供。這方面的任何內容不應視為承認發明者沒有權利借助于先前的發明或因為任何其它原因而將公開的內容提前。所有關于這些文件的日期的聲明或這些文件的內容的表述是基于申請者可得的信息，并且不構成任何關于這些文件的日期或這些文件的內容的正確性的承認。除非另有定義，本文所使用的所有科技術語具有與本領域普通技術人員通常的理解相同的、與本發明有關的含義。盡管任何已知的方法、設備和原料可被用于本發明的實際操作或測試中，就這一點而言，本文已對這些方法、設備和原料進行了描述。本發明與全細胞肺炎雙球菌制劑的選擇性裂解有關。盡管在本領域中已知許多微、生物失活試劑，但是本發明以如下方式提供選擇性裂解和失活使得在誘發T-淋巴細胞介導的免疫應答和抗體介導的免疫應答中高度有效的免疫原制劑成為可能。以本文所述的方式利用技術和試劑使細菌制劑選擇性失活和裂解并顯示出出乎意料的免疫原性，這在本領域中并不是已知的。在低收入國家中，肺炎鏈球菌(肺炎雙球菌)在兒童中造成了主要的疾病負擔(O’Brien等，Lancet，374，893 (2009))。莢膜多糖綴合物疫苗提供了血清型特異性保護，但該疫苗具有如下缺點有限的血清型覆蓋度；血清型替代；以及高的生產、貯存成本；和注射(Hanage, Future Microbio. 23 (2008) ；Ray, Vaccines, 1,65 (2002))。因此，開始探索基于種共有的(species-common)蛋白抗原的、可能更經濟的血清型非依賴性疫苗(serotype-independent vaccines) (Tai,Crit. Rev. Microbio.,32,139 (2006))。在一種這類方法中，出于最大化地暴露種共有的莢膜下抗原的目的，對無莢膜肺炎雙球菌的滅活 細胞進行了研究。已經熟知可將失活的細菌細胞用作疫苗；已將通過加熱、酚、甲醛或紫外輻射滅活用于這類失活。然而，對于肺炎雙球菌的無莢膜細胞，比起傳統的失活方法(如力口熱等)，用70% (體積/體積)乙醇在4°C滅活該細胞產生了免疫原性更強的抗原。這一抗原制劑被稱作“全細胞抗原”(WCA)，當用合適的佐劑進行配制時，被稱作“全細胞疫苗”(WCV)。這里要澄清的是，這一抗原被叫做WCE是為了表示用乙醇進行了失活。因為鼻內(i. η)應用途徑對誘導全身性免疫和粘膜免疫都是有效的，因此最初對鼻內(i. η)應用進行了檢測。利用WCE外加作為粘膜佐劑的霍亂毒素(CT)進行的鼻內免疫接種預防了大鼠中致死的血清型3肺炎，并減少了用血清型6Β肺炎雙球菌進行的小鼠的非致死鼻內激發產生的鼻咽(NP)定殖(Malley等，Infect. Immun. ,69,4870 (2001))。后一激發之所以有意義是因為，眾所周知的是，鼻咽定殖是肺炎雙球菌感染中必要的第一步驟(Austrian, J. Antimicrob.Chemother.，18 (A)，35 (1986))。無論是通過血清型6B的菌株還是通過血清型23F的菌株，這一激發引起中耳定殖和NP定殖，二者均可通過WCE得以減少(Malley等，Infect.Immun.，72，4290(2004))。盡管通過i. η.接種提高了血清抗體的水平，但是在無抗體時，通過CD4T細胞依賴的、白細胞介素17Α (IL-17A)介導的機制，在小鼠體內誘導了針對定殖的防護作用(Lu 等，PLoS Pathog. ,4, el000159 (2008) ;Malley 等，PNAS，102，4848 (2005))。在該定殖模型中，少至IO7個細胞(大約IOyg蛋白)的WCE (順序給予三次)具有保護作用(Trzcinski等，Infect. Immun. , 76, 2678 (2008))。這些在先研究中，用表達天然肺炎鏈球菌溶血素(有效的溶細胞素)的菌株RxlAL制得WCE。作為本文所述的可選策略并預期了人類研究，可使用具有突變W433F、D385N和C428G的肺炎鏈球菌溶血素(PdT)的衍生物，所述突變致使分子變為非溶血性的并且不能激活補體(Berry等，Infect. Immun. ,63,1969(1995))，但是維持了其TLR4激動劑性質(Malley等，PNAS，100，1966 (2003))。此前，細胞在Todd-Hewitt-酵母肉湯中生長，該肉湯含有牛心浸液。此外，為避免牛成分的任何危害，可使用生長在大豆基培養基(Liberman 等，J. Ind. Microbio. Biotech. ,35,1441 (2009))中的細胞。WCE的一個缺點是必須從滅活細胞中分離出上述的70%乙醇，例如通過離心分離。本發明還提供了規避安全操控和處理大體積乙醇的挑戰的技術，提供了至少三種可選的在低濃度下具有殺菌性的失活試劑氯仿、三氯乙烯和丙內酯。由于氯仿和三氯乙烯二者均是高揮發性的、而β_丙內酯可通過加熱失活，所以無需在失活后將細胞從水相中分離，便可將這些試劑除去，這也使得首次可方便地對由所述滅活細胞釋放的可溶組分進行檢測。如本文所給出的，還對由聲波處理產生的可溶組分進行了檢測。腸毒素作為佐劑的可能的副作用(Mutsch等，N. Engl. J. Med. ,350,896 (2004))以及鼻內接種的其它問題促使對遺傳上去毒的腸毒素衍生物和頰給藥途徑及舌下給藥途徑進行考慮。還用聲波處理的抗原制劑對透皮免疫接種進行了檢測。檢測了這些不同的免疫接種程序對定殖的防護作用，證實加速了用血清型6B菌株進行鼻內激發后的鼻咽定殖清除(Lu等，2008)。本文給出的結果表明了可通過多種試劑使細胞失活以生成有效的全細胞抗原，可以多種方式給予所述全細胞抗原從而順應具體接種計劃的偏好。例如，將丙內酯(BPL)用于無莢膜全細胞肺炎鏈球菌菌株的裂解。BPL處理產生具有免疫原活性的兩種組分。在BPL處理后，部分裂解的細胞作為細胞部分在結構上仍然是完整的。這一細胞部分在抗體誘導中略微有效，而在IL-17A誘導中極其有效，因此，促進了病原細菌的吞噬滅活(例如通過多形核白細胞)及隨后的抗原提呈。此外，肺炎鏈球菌的BPL裂解使抗原釋放入可溶(水性的)部分中，所述可溶部分以血清型非依賴性的方式發揮保護作用。通過水解BPL、并取消將它們從細胞中除去所需要的步驟，可將這些可溶組分保留在免疫原性組合物中。本文還在實驗上證明了這一可溶部分的有效性。因此，當接種經處理的細菌制劑時，引發了獨特且血清型非依賴性的雙管齊下的(two-pronged)、T淋巴細胞介導的免疫和抗體介導的免疫。此前，用與腸毒素相關佐劑一起給予的滅活全細胞肺炎雙球菌疫苗進行的粘膜免疫已經顯示出，賦予了抗小鼠體內的中耳定殖和鼻咽定殖的多血清型保護作用。除可能難以實施的新的粘膜免疫策略外，本發明的實施方式提供皮下注射或肌內注射。例如，將肺炎雙球菌菌株RM200進行工程化，使之無莢膜、無自溶素、并表達無毒的突變型肺炎鏈球菌溶血素類毒素(pneumolysoid)。培養物在無牛成分的大豆基培養基中生長,用氯仿或β-丙內酯進行滅活，并注射入C57131/6小鼠中，同時注射或不注射鋁佐劑。在激發時，定殖防護作用從機理上取決于⑶4+Τ細胞的存在；相比之下，在3型吸入性膿毒病模型中，在激發時對于保護作用來說不需要CD4+T細胞，表明單獨的抗體足以抵御這一模型中的死亡。在試驗性的毒性研究中，接受了順序肌內注射的兔子在注射部位表現出局部反應原性但無臨床征象。由此產生的兔抗血清在體外吞噬滅活分析中有活性，并在3型吸入性膿毒病模型中對小鼠進行被動保護。本發明解決了肺炎雙球菌疫苗領域中的主要需求現行的疫苗組合物利用了血清型特異性莢膜多糖以對特異的血清型進行免疫，而本發明并不是基于莢膜多糖誘導的應答。因此，可聯合使用所得到的裂解細胞和可溶抗原以賦予多血清型疫苗可應用性的優點。特別是在其它疫苗由于血清型選擇性而對覆蓋度的缺口敏感時，這一點十分有用。其次,_ 11￡\0^\]1 (常用的疫苗)的市價為65$每劑,而經估計,本文所述疫苗的生產成本為 O.20$每劑。因此，本實施方式滿足了本領域中潛在的生物學需求和經濟需求。具體而言，已知當經鼻內給予時，WCE通過致敏引起促吞噬作用細胞因子IL-17A的確立來保護小鼠免于NP定殖(如用血樣進行的體外分析所表明的)；還已知伴隨的抗體應答是不必要的(Lu 等，PLoS Pathog.，4，el000159 (2008) ;Malley 等，PNAS, 102,4848(2005))。在本發明中，分別通過氯仿(C)、三氯乙烯(T)或β-丙內酯(B)對肺炎雙球菌疫苗菌株RM200進行滅活以制造WCC、WCT和WCB制劑。對于接種實驗，將滅活的細胞懸液以單次使用的小份凍干并以蔗糖作為穩定劑，在臨試驗前進行再水化。以CT為佐劑，將這些制劑與WCE各經i. η.給予兩次，并對這些制劑與WCE進行如下方面的比較對用血清型6Β的肺炎雙球菌菌株進行的鼻內激發的加速清除；以及在體外對IL-17A應答的致敏。按照這兩個標準，WCC、WCT和WCB都比WCE更加有效。具體而言，圖IA顯示出在每次免疫接種的劑量為IO8和IO7時WCE有保護性作用(即，顯著地降低了由用6B菌株0603經鼻內激發的小鼠的鼻咽中回收的CFU的數量)，但在IO6時沒有保護性作用，而WCC在IO6時也有保護性作用(劑量被表示成滅活前的CFU數量，這一值對應于約Uyg干重或I μ g的蛋白)。如WCE —樣，WCC在體外致敏了通過T細胞表達的IL-17A :在激發前I周，各WCC免疫接種小鼠的IL-17A表達與激發后回收的CFU呈反相關(圖2A，Spearman檢驗ρ=-0· 54，P=O. 0007)。在單獨的實驗中，在劑量比WCE低10-100倍時，WCT有顯著的保護性作用。因此，WCC和WCT顯示出比WCE有效約10倍。當經鼻內給予時，WCB同樣有保護作用它有抗定殖的保護作用(圖1B)并且在IL-17A致敏中有活性；所述保護作用與IL-17A分析相關。在單獨的實驗中，WCB顯示出具有類似于WCC的定量效力(圖6A和圖6B)。 在水性懸浮液中用上述任何試劑對肺炎雙球菌RM200細胞進行滅活，使多種蛋白釋放入可溶(水性的)相中。由于乙醇能與水混溶并且難以從水中除去,所以必須將乙醇滅活的細胞從水相中分離，以免有毒溶劑污染WCE疫苗。相比之下，不混溶的溶劑氯仿和三氯乙烯可容易地從水相中除去，并且β_丙內酯可被容易地分解成無害成分；所以在用這些試劑滅活后，可將水溶相與細胞一起保留在疫苗中。當從疫苗懸浮液中將細胞離心除去后，通過電泳對疫苗進行分析時，WCC、WCT和WCB的上清液部分明顯地顯示出所釋放蛋白的多樣性，WCE (從此前經相分離的WCE疫苗中獲得)則不出所料地僅顯示出痕量的這類蛋白。所釋放的蛋白本身已經顯示出具有實質性的保護活性，因此，相對于WCE，顯然有助于本申請公開的疫苗制劑的更強的效力。具體而言，使肺炎雙球菌疫苗菌株RM200在大豆基培養基中生長至對數生長晚期，隨后漂洗并在乳酸化林格氏溶液中濃縮至八_為32。通過在4°C下與氯仿(C)(l/40 [體積/體積])攪拌2h、或與三氯乙烯(T) (1/40[體積/體積])攪拌2h、或與β -丙內酯(B)(1/4，000 [體積/體積])攪拌24h進行滅活。細胞不用進一步漂洗通過凍干將C和T除去，通過在凍干前于37°C孵育2h使B分解。所得到的疫苗抗原制劑分別被稱為WCC、WCT和WCB。為了對從所述細胞中釋放的物質進行檢測，將凍干的WCE、WCC、WCT和WCB的樣品以A6tltl為32的量懸浮于LR中，在25°C渦旋lmin，然后在16，OOOXg離心5min。上清液的總蛋白含量大約是未離心懸浮液的總蛋白的15%。SDS-PAGE (圖3A)顯示出了 WCC和WCT的上清液(以下標“su”表示)中的大量可溶蛋白，而WCE (此前已在滅活后被離心以除去所存在的大體積的70%乙醇)僅含有痕量的這類蛋白。然而，當對不經離心的處于70%乙醇中的細胞懸浮液進行檢測時，同等的蛋白混合物(通常會在WCE的制劑中損失)顯示出已被溶液化(未示出)。圖3B顯示出大量可溶蛋白同樣存在于WCB中。我們示出了，如同未分離的疫苗WCC —樣，氯仿滅活細胞經離心分離的水相(“WCCsu”)相對于定殖是高度保護性的。用WCB和WCBsu可證實類似的結果(未示出)。因此，在用允許保留所釋放的組分的試劑對RM200細胞進行滅活后，當通過鼻內途徑給予時，可溶相有助于保護作用。考慮將肺炎雙球菌疫苗(如WCV)用于粘膜給予有許多潛在的優點(Holmgren &Czerkinsky, Nat. Med.，1，S45 (2005))。世界衛生組織對于肺炎雙球菌疫苗的預先市場承諾的“目標產品概況”(WHO，肺炎雙球菌綴合物疫苗的預先市場承諾(AMC)的目標產品概況(TPP)(2008))，優選皮下注射或肌內注射；因此，使用目前批準的鋁佐劑對目前公開的可注射疫苗制劑進行試驗是令人信服的。皮下注射使小鼠免于鼻內定殖，而鼻內定殖是肺炎雙球菌疾病前的必經過程(Austrian, J. Antimicrob. Chemother. , 18 (A), 35 (1986))。吸附至Al (OH) 3上極大地增高了效力。除了非致死的血清型6B定殖模型之外，還使用了致死的血清型3模型用高度莢膜化的血清型3菌株對麻醉的小鼠進行鼻內激發產生了菌血癥和死亡。這里，經皮下(s. c)途徑的WCC或WCB同樣有效順序注射三次少至I μ g的蛋白、或順序注射兩次10 μ g的蛋白有顯著的保護作用。在 這一模型中，如同所示，對于將肺炎雙球菌從鼻咽中清除并不必要的血清抗體應答(Malley等，PNAS, 102,48 (2005))，看起來參與了以下保護作用不消除CD4抗體的保護作用；以及通過將血清從接種后的兔子轉移至小鼠的“被動保護”。具體而言，為通過免疫學分析進行評估和在定殖模型中進行保護，將未吸附和吸附在Al (OH)3 (O. 21mg Al/劑)上的劑量遞增的WCC (I μ g、10 μ g和100 μ g)以順序的三次注射進行測試。沒有佐劑時，無可測的IL-17A應答(圖5A);而使用Al(OH)3時，甚至對I μ g的劑量都有明顯的應答。用作為包被抗原的WCC和綴合有HRP的抗小鼠IgG 二抗，通過ELISA對血漿IgG抗體進行測定。吸附和未吸附時均存在劑量依賴的抗體應答，但是通過Al(OH)JI強了約100倍(圖5B)。抗體應答包括IgGl和IgG2c兩者。未吸附時，沒有針對血清型6B菌株0603的實驗性NP定殖的保護作用；但是，Al (OH)3吸附時，兩個較高的WCC劑量引起CFU的明顯降低(圖5C)。對于注射的WCB，觀察到了鋁佐劑類似的增強作用；以及在定殖模型中，吸附的WCB的保護作用與IL-17A的致敏相關(圖2A)。對吸附的WCB和WCC在IL-17A致敏和在定殖模型中的保護作用進行定量比較注射吸附在Al (OH)3上的劑量為10 μ g或100 μ g的WCC和WCB。劑量依賴的IL-17A應答并沒有不同(圖6A)。對將血清型6B從鼻咽的清除也是不可區別的(圖6B)。在WCC免疫接種的動物組中對這一模型中的CD4+途徑依賴性進行評價，在臨激發前對所述動物給予抗⑶4+抗血清以使得這些細胞不能再作為保護作用效應因子；在這些小鼠中保護作用被消除(圖6B第2列)。為確定血清型3菌株WU-2的致死吸入性膿毒病模型(Lu等，2009 ；Malley等，Infect. Immun.，74，2187，2006)中的保護作用，用劑量為 I μ g、10 μ g 和 100 μ g 的WCB-Al (OH)3注射三次。在接受了單獨的Al (OH)3的對照中，7天的觀察期結束后，7/10的小鼠死亡(圖7A)，三只存活者中的兩只患有菌血癥。存在著WCB的劑量依賴的保護作用接受了 I μ gWCB的小鼠中的半數以及接受了 IOyg或IOOyg的小鼠中的全部在7天的觀察期后存活；存活的經接種小鼠中無一患有菌血癥。不出所料，在IL-17A應答和抗體應答中存在劑量依賴地增高，致死模型中的保護作用與各小鼠激發前的抗體滴度相關。當小鼠體內的血清抗肺炎雙球菌IgG抗體滴度超過10，000任意單位時，均觀察到了保護作用(圖2B)。還用僅兩次注射對這一模型中的保護作用進行了測試。相隔2周給予IOyg或100 μ g的劑量，一周后取血，取血2天后進行激發。10 μ g劑量部分地抵御了死亡或菌血癥，而IOOyg劑量完全抵御了死亡或菌血癥(圖7B);在2次注射實驗安排中，血清IgG抗體應答起實質作用；在較高的劑量下，滴度增高至約7倍(圖7C)。當通過肌內注射給予吸附的WCB時，在致死的激發模型中同樣也觀察到了保護作用。目前，這是將疫苗注射入人的常規途徑。通常地，在4°C下吸附18h到22h，然后立即對制劑進行測試。為測試吸附后的抗原的穩定性，將Al (OH)3和100 μ g/劑的WCC在經上述實驗進行測試之前于37°C下孵育I個月。IL-17A應答、抗體滴度和保護結果與相同劑量的新鮮制備的WCC-Al (OH)3并沒有不同(圖5A、圖5B和圖5C,最后一列,通過Δ標不)。因此,作為液體懸浮液是穩定的(可注射疫苗的優點)。盡管通過注射WCB來抵御致死的鼻內激發的保護作用與IL-17A分析和抗體應答相關，但是這一模型中的CD4+T細胞的缺乏(由此顯著地削弱了 IL-17A應答)并不會阻斷該保護作用。因此，蘊涵了抗體的必要功能。如上文所指出的，各小鼠的保護作用與抗全細胞抗原的抗體的激發前滴度相關(圖2B)。如將在下文示出的，通過用來自WCB接種后的兔子的經加熱滅活血清進行被動保護，示出了抗體在這一模型中的功能性作用的跡象(圖SB)。因此，兩種不同感染模型的使用顯示出肺炎雙球菌全細胞疫苗具有雙管齊下的免疫(two-pronged immunity)潛能依賴于IL-17A的抗非致死定殖的保護作用和主要依賴于抗體的抗致死侵襲的保護作用。通過含有細胞成分和可溶成分的疫苗促進了所述的雙管齊下免疫力。在圖4A-圖4B中所示的實驗中，對WCB的樣品進行離心以產生細胞(“沉淀物”)部分和可溶(“sup”)部分。注射等量(按照蛋白含量為30 μ g)的上述部分。圖4A顯示出細胞部分在誘導致敏IL-17A應答方面更優越，圖4B顯示出對于抗體應答來說，可溶部分能力相當或更好。因此，利用選擇性裂解細胞以釋放保護性抗原、但不需要隨后除去可溶相的試劑使疫苗失活，構成了生成提供了雙管齊下的保護性應答的疫苗的簡單步驟。本發明的另一實施方式提供了通過超聲溶液化的制劑的保護作用。延伸對可溶組分的保護作用的觀察，將WCC的樣品進行聲波處理以裂解細胞，并將這一裂解物與相應劑量的完整WCC進行比較。圖ID顯示出該裂解物有同等的保護作用，圖IE顯示出通過血細胞檢測的，該裂解物在體外同等地致敏了 IL-17A的應答，所述IL-17A應答和定殖模型中的保護作用相關(Lu等，2008)。作為通用方法，WCA的劑量可表示為μ g蛋白，其中約85%為細胞部分，約15%為可溶部分(Lu等，2010) ;1 μ g對應于大約I. 7μ g的總干重并對應于滅活前的IO6的CFU。對于小鼠的主動免疫，相隔兩周給予兩次或三次順序注射，在最后一次注射I周或2周后，取血用于體外致敏IL-17A表達分析和抗WCA的血清IgG抗體分析，在定殖模型或吸入性膿毒病模型中用肺炎雙球菌對動物進行激發，將各小鼠的結果與體外分析的結果進行比較。為證明血清型覆蓋度的擴大，用此前未使用的肺炎雙球菌血清型誘導小鼠吸入性膿毒病的激發激發用的5型菌株DBL5在少至IO5CFU/吸入時可致死。對用100 μ g劑量的WCB Al (OH)3的2次注射順序進行測試，發現其對IO5CFU/吸入或IO7CFU/吸入的激發具有高保護作用。在兔子中對初步的毒物學評估和免疫原性進行了評價。用鹽水、單獨的Al (OH)3 (O. 21mg Al)、劑量為50、500或5000的Al (OH) 3吸附的WCB或商購的DTwP疫苗(已知的毒性對照)在第I天、第15天、第29天和第43天對每組三只的各組中的雌性新西蘭白兔進行肌內注射。在整個過程中未觀察到試驗制品相關的臨床征象、皮膚刺激、食欲不振或溫度變化。當尸檢時，在這一研究的任何組中，均沒有確定的與試驗制品相關的肉眼表現(macroscopic findings)。盡管并非明顯地劑量依賴，在所有WCB組中，嗜中性白細胞和單核細胞顯示出輕微至適度的增加(相對于鋁佐劑為I. 58-1. 87倍)。在接受了中等劑量WCB和高劑量WCB的動物中，從第2天(相對于鋁佐劑為I. 16-1. 94倍)到第45天(相對于鋁佐劑為I. 31-2. 62倍)，纖維蛋白原逐步地且劑量依賴性地增加。在接受了 500μ g和5，000μ g的WCB的組中，球蛋白輕微地增加。這些臨床病理學參數的變化與對疫苗的炎癥應答一致。在肌內注射部位觀察到許多鏡下表現(microscopic findings),包括觀察到在不同的對照組和WCB試驗制品注射組之間不同的表現。這些表現通常對于注射部位4 (第45天)最大，并顯示出隨時間而不斷恢復(recovery)(注射部位1，第I天)。在皮下出血/炎癥/壞死的表現中觀 察到了 WCB免疫組之間的劑量依賴性的唯一微小的證據。總的來說，與第2組對照相比，在所有WCB組中，肌肉和皮下炎癥的表現有一定程度提高，所有注射部位沒有表明這些表現的嚴重程度或發病率具有劑量依賴性的任何一致的證據。與DTwP對照相比，WCB組作為整體并沒有一致地具有任何鏡下表現的增高的發病率或嚴重程度。總之，在50 μ g、500 μ g或5，000 μ g這三個劑量水平對WCB進行檢測。基于局限在炎癥的表現(纖維蛋白原和微觀病理學)，這一研究中，無可見不良作用水平(NOAEL)為50 μ g/動物的氫氧化鋁吸附的WCB。在WCB免疫接種的兔子中，在第I天、第15天、第29天和第43天注射前所取的樣品中，血清IgG抗體滴度逐步并劑量依賴性地升高；在圖8A中示出了第43天的滴度。利用來自經鋁佐劑和WCB免疫接種的兔子的第45天的混合血清，對血清型3的小鼠吸入性膿毒病模型中的被動保護進行了測試 第45天的混合血清具有高度保護性(圖SB)。在如前所述的表面滅活分析中，對來自兔子(已用500 μ g Al (OH)3吸附的WCB或單獨的鋁佐劑進行了免疫)的經加熱處理的瀕 死放血血清(terminal bleed sera)進行評價(Lu等,PLoS Pathog,9，el000159 (2008) ;Weinberger 等，PLoS Pathog.，5，el000476 (2009))。如圖 8C 中所示，在所測試的三個稀釋度中，與免疫前血清相比，來自兔子的免疫血清顯著地增強了人嗜中性白細胞對血清型6B肺炎雙球菌菌株的滅活，表明用吸附的WCB進行的免疫接種誘導了調理吞噬抗體。本發明的另一實施方式提供了通過與無毒的腸毒素衍生物一起經鼻內給予的WC抗原的保護作用。CT和大腸桿菌不耐熱毒素(LT)均不適合于經鼻內對人使用，這促使對無毒的突變型LT進行評價。將大腸桿菌不耐熱毒素的單突變衍生物(mLT，R192G)與CT進行比較。圖15顯示出，與鹽水相比，單獨給予佐劑顯示出加速肺炎雙球菌清除的跡象(雖然并非統計上顯著的)，這是這一模型中的預期結果，在這一模型中通過相同途徑進行接種和激發。然而，當與IO8的WCE—起給予時，mLT提供了出色的保護作用。此外，本發明提供了適合于通過頰途徑和舌下途徑給予的免疫原性制劑。最近的報道提高了對通過鼻內途徑給予的大腸桿菌不耐熱毒素(LT)、甚至是去毒的突變型LT的安全性的關注，并指出它們的使用可能與貝耳氏麻痹(Bell’ s palsy)的發展相關(Lewis等，PLoS one，4，e6999 (2009);Mutsch等，2004)。在幼兒中進行鼻內接種的另一缺點是受試者有大量鼻腔粘液(在一些臨床環境中常見)，將削弱疫苗與粘膜的有效接觸。因此，對可選的粘膜途徑進行測試施加至下白齒旁的頰粘膜(常常用于兒童的活脊髓灰質炎接種)和舌下應用(最近在細胞學上詳細分析的途徑)(Cuburu等，J. Immunol.，183，7851 (2009))。這兩種途徑均可進入韋氏環(Waldeyer’ s ring)的免疫應答組織而較少進入中樞神經系統，并避開了鼻腔粘液問題。使用WCC并以雙重突變的LT (dmLT, R192G/L211A)作為佐劑對頰途徑和舌下途徑進行探索。發現兩種給藥途徑均具有劑量依賴的保護作用(圖11A)。與所述保護作用一致，觀察到了體外IL-17A應答的致敏(圖10B)。
本發明還提供了通過透皮免疫(TCI)給予的含有超聲產生的WCC片段的免疫原性組合物。通過將含有抗原和LT佐劑的紗布貼劑施加至背部皮膚而對透皮免疫途徑進行測試，如同此前為了其它疫苗制劑所做的一樣，對背部皮膚進行輕微摩擦以使角質層破損(Zhu等,Clin. VaccineImmunol. ,15,359 (2008))。其他體系的經驗提倡降低粒徑,所以對平均直徑為IOOnm (WCC100)和20nm (WCC20)的片段進行測試。與單獨施用LT或單獨施用WCC100相比，當與LT 一起施用時，WCC100和WCC20有同樣的保護作用。與該保護作用一致，體外使IL-17A應答的致敏極大地超過了與經i.n.免疫的保護作用相關的水平(圖12C)(同樣參見Lu等，2008)。因此，透皮接種是鼻腔途徑的另一替代途徑。針對幼兒中的全身性疾病，肺炎雙球菌莢膜多糖-蛋白綴合物疫苗對于所包括的血清型已是有效的，并提供了某些群體免疫力(Hsu等，N. Engl. J. Med. ,360,244 (2009)；Lexau 等，JAMA，294，2043 (2005) ;Whitney 等，N. Engl. J. Med.，348，1737 (2003))。制造的復雜性、相對高的生產成本和增加的血清型替代疾病(Hanage，2008)使得努力開發出血清型非依賴性的且更經濟的疫苗。這些疫苗包括純化的蛋白質抗原(Basset等，Infect.Immun.，75，5460(2007)；Briles 等，Vaccine，18，1707(2000)；Giefing 等，J. Med. Exp.，205，117 (2008) ;Glover 等,Infect. Tmmun. ,76,2767 (2008))、載體化的蛋白質抗原(Arevalo等，FEMS Immunol. Med. Micro.，55，346 (2009) ；Kong 等，PNAS, 105,9361 (2008) ；Li 等，PNAS, 106, 593 (2009)；Nayak 等，Infect. Tmmun.，66, 3744 (1998)；Xin 等，Infect. Tmmun.，77,4518(2009))、以及本文所研究的無莢膜化的WCV(Lu等，2008 ;MalIey等，2003 ;MalIey等，Infect. Immun.，72，4290 (2004))，上述任一疫苗均可與本實施方式的免疫原性組合物聯合使用。攜帶(Carriage)通常先于肺炎雙球菌疾病(Austrian, 1986),所以疫苗誘導的對攜帶的增強清除(Lu等，2008)可抵御肺炎和侵襲性疾病。本實施方式提供了降低持續時間和強度、但不一定消除攜帶的免疫原性組合物。例如，在小鼠中，WCV并不阻斷定殖，但是卻加速了從鼻咽中的清除(Bogaert 等，Infect. Tmmun. , 77,1613 (2009) ；Lu 等，2008 ；Malley等，2001 ；Malley 等，2004 ；Malley 等，2005)。盡管以微粒形式和可溶形式存在的滅活WC抗原(許多不同抗原的組合)在生產一致性和標準化方面具有潛在的挑戰，但它的效力、低生產成本、作為親液物(Iyophile)的穩定性以及不需注射器的可能給藥方式使得值得對它進行臨床開發。對于這么復雜的抗原，通過生化標準對其直接進行標準化和品質控制是不可行的。需要基于動物免疫接種的效力分析；但是將動物激發試驗作為終點是不理想的，優選通過體外分析測定的相關物。用于在體外生成IL-17A的小鼠的致敏就是通過多種途徑給予WCV所產生的保護作用的相關物(Lu等，2010)，但是這一分析需要在許多發展中國家可能不容易得到的組織培養設備。如本文所示，當經S. C給予WCV時，通過ELISA測定的抗WCA的血清IgG抗體既是相關物、也是抵御侵襲性疾病的藥劑。因此，WCV的經規劃的初步臨床評價是作為用于肌內注射的鋁吸附抗原，初步效價標準將依據小鼠免疫接種和用于測定兩次順序注射后的IgG抗體的ELISA。可潛在地將IL-17A分析用作輔助標準。如同IgGELISA，IL-17A分析可使用人血的小樣品進行，所以二者均可在臨床試驗中用作有用的生物標記物7價肺炎雙球菌綴合物疫苗(PCV)在美國抵御侵襲性疾病的成功和9價PCV在南非以及岡比亞的臨床試驗結果(Klugman等，N. Engl. J. Med.，349,1341 (2003) ；Cutts等，Lancet，365，1139 (2005))理所當然地產生了如下結論在發達國家和發展中國家，利用下一代綴合物疫苗提供足夠的血清型覆蓋度并降低成本，肺炎雙球菌疾病如果沒被根除也可被顯著地控制。最近分別在歐洲和美國獲批的所謂的“第二代”10價和13價肺炎雙球菌疫苗代表了在這一領域中的進一步的重要進展。然而，并不包含于第一代的7價綴合物疫苗中的血清型的出現(Hanage, Future Microbio. , 3, 23 (2008)),以及對這些菌株是疾病、發病和死亡的重要原因的證實(Singleton 等，JAMA，297，784 (2007)；Hsu 等，N. Engl. J. Med.，369,244 (2009))引起了關注。盡管現在發達國家和發展中國家對使用促進適當廣譜的肺炎雙球菌綴合物疫苗的努力仍在繼續，針對肺炎雙球菌接種的可選策略的需要仍然是優先級的。在過去的十年中，多個科研小組將注意力集中在了開發能夠進入臨床試驗的種特異性肺炎雙球菌疫苗(Nabors 等，Vaccine, 18,1743 (2000) ；Briles 等，J. Infect. Dis.，182，1694(2000);Giefmg 等，J.Exp.Med.，205，117(2008);01iveira 等，Microbes Infect.，8,1016 (2006) ;0gunniyi 等,Infect. Tmmun. ,68,3028 (2000))。然而，令人清醒的是，迄今為止還沒有已進入III期臨床試驗的此類疫苗。此外，很明顯的是，開發種特異性肺炎雙球菌疫苗面對著開發和獲批中的多個重要障礙，所述障礙包括但不限于研究種群、終點、效力確定的選擇；與目前批準的綴合物肺炎雙球菌疫苗的比較；給藥途徑和對優化粘膜免疫力刺激的佐劑的潛在需求。在特定的實施方式中，使用菌株RM200生產WC抗原。在菌株RxlE中，為了通過減少自溶來提高產率，利用標記有卡那霉素抗性基因rpsL的Janus表達盒取代整個IytA基因組編碼區域(Sung 等，Appl. Environ. Micro. , 67, 5190 (2001) ;Trzcinski 等，AppI.Environ. Micro. ,69,7364 (2003))。展示有正確的IytA: : Janus基因組背景、對脫氧膽酸鹽溶胞作用具有抗性、并具有類似于野生型菌株的生長動力學的整合體被稱為RlGOOtjRxIE表達肺炎鏈球菌溶血素的非溶血性衍生物PdT (Berry等，1995)，所述PdT既是毒素也是保護性抗原。為確定PdT表達的滯留(retention)，用羊的紅細胞對RM200的溶血活性進行測試，用純化的肺炎鏈球菌溶血素蛋白進行標準化，發現用多至5X108的細胞時為非溶血性的，而少100倍的表達肺炎鏈球菌溶血素的全細胞誘導了紅細胞的完全溶胞(分別為8 X IO6個表達肺炎鏈球菌溶血素的WCE細胞和5 X IO5個表達肺炎鏈球菌溶血素的WCC細胞)；該分析的肺炎鏈球菌溶血素檢測下限為0. 05ng/ml。用抗肺炎鏈球菌溶血素血清進行的Western印跡分析證實了 PdT蛋白的表達。可將本文給出的技術(使用選擇性裂解并保留所釋放的可溶部分來制備全細胞免疫原)用于在其他革蘭氏陽性細菌中制備疫苗，例如鏈球菌(包括A組鏈球菌和B組鏈球菌)、腸球菌(Enterococci)(包括糞腸球菌(faecalis)和屎腸球菌(faecium))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或非金黃色葡萄球菌、腸道球菌(Enterococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(包括炭疽桿菌(Bacillus antracis),引起炭疽病的因子)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、分枝桿菌(包括結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、非結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌(M. Ieprae))和李斯特菌屬(Listeria)。此外，其它細菌抗原成分可與本發明的免疫原性組合物相聯合，所述其他細菌的抗原成分來自于如葡萄球菌的種、鏈球菌的種(包括A組和B組)、腸球菌的種；李斯特菌屬、芽孢桿菌屬(包括炭疽桿菌)、棒狀桿菌屬、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)(腦膜炎奈瑟氏球菌(meningitidis)和淋病奈瑟氏球菌(gonorrheae))、莫拉菌屬(Moraxella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)(分型嗜血桿菌和非分型嗜血桿菌)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(銅綠假單胞菌(aeruginosa)及其它)、沙門氏菌屬(Salmonella)(傷寒沙門氏菌和非傷寒沙門氏菌)、志賀氏菌屬(Shigella)、抗革蘭氏陰性腸道菌(腸桿菌屬(Enterobacter)、朽1檬酸細菌屬(Citrobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、大腸桿菌等)、艱難梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium difficile)及其它梭狀芽胞桿菌、類桿菌屬(Bacteroides)及其它厭氧菌、衣原體科(Chlamydiaceae)的種(沙眼衣原體(C. trachomatis)和肺炎衣原體(C. pneumoniae))、支原體(Mycoplasma)和軍團菌屬(Legionella)以及密螺旋體(Treponemes)(梅毒、鉤端螺旋體)和疏螺旋體(Borrelia)。本發明的免疫原性組合物還可與如WO 09/143413中所述的融合蛋白-多糖綴合物聯合使用。通過醫藥或獸醫領域普通技術人員公知的技術并通過對如下這類因素加以考慮來確定本發明組合物中的免疫原和佐劑的量以及給予的劑量具體的抗原；佐劑(如果存在)；具體患者的年齡、性別、體重、物種和病癥；以及給藥途徑。例如，根據本申請的公開，本領域技術人員可容易地確定用于合適宿主(希望在其中進行免疫應答)的具體的全細胞免疫原的劑量以及一般與之一起給予的任何佐劑的量。因此，本領域技術人員可容易地確定組合物中的抗原和任選的佐劑的量并以本發明的方法給予。一般地，通常以處于磷酸鹽緩沖鹽水中的O. 001-50wt%的溶液使用佐劑，并且抗原以μ g到mg的數量級存在，如約O. 0001wt%-約5wt%。然而，一般情況下，抗原以μ g到Hlg的數量級存在，如1μ g-ΙΟΟμ g，包括端值；或約10 μ g ;或約O. 001wt%-約20wt%,包括端值。對于待給予動物或人的組合物(包括其組分)以及任何具體的給藥方法，優選如通過在合適的動物模型(例如嚙齒動物(如小鼠))中測定致死量(LD)和LD5tl來確定可能的毒性；還優選如通過用于抗體或抗原的血清滴定及其分析(例如通過ELISA和/或RFFIT分析)來確定誘發合適的免疫應答的組合物的劑量、組合物中組分的濃度和給予該組合物的時間。這類測定并不需要除本領域技術人員的知識、本申請的公開和本文所引用文獻以外的過度試驗。并且，不需要過度實驗即可確定順序給藥的時間。本發明免疫原性組合物的實例包括用于孔口給藥(如口腔給藥、鼻腔給藥、肛門給藥、陰道給藥、口服給藥、胃內給藥、粘膜(例如經舌粘膜、牙槽粘膜、齒齦粘膜、嗅區粘膜或呼吸區粘膜)給藥等)的液體制劑(如懸浮劑、糖漿劑或酏劑)；以及用于胃腸外給藥、皮下給、藥、皮內給藥、肌內給藥或靜脈內給藥(例如可注射的給藥)的制劑(如無菌懸浮劑或乳劑)。這類組合物可與合適的載體、稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理鹽水、葡萄糖)等混合。所述組合物還可被凍干。根據給藥途徑和期望的制劑，該組合物可含有輔劑物質，如濕潤劑或乳化劑、PH緩沖劑、凝膠化或粘度增強添加劑、防腐劑、芳香劑、著色劑等。可查閱標準文本(如Remington, Science & Practice of Pharmacy(最新版)和美國專利公開No. 2009/0098165)以制備合適的制劑，無需過度的實驗。本發明的組合物作為可被緩沖至所選定的pH的液體制劑(例如等滲水溶液劑、懸浮劑、乳劑或粘性組合物)而被方便地提供。如果期望鼻腔給予或呼吸區(粘膜)給予，組合物可為一定的劑型并可通過擠壓噴霧分料器、泵分料器或氣霧劑分料器分發。氣霧劑通常借助于烴加壓。泵分料器可優選分發計量的制劑或具有特定粒徑的制劑。本發明的組合物尤其是如果經口服給予時，可含有藥學上可接受的芳香劑和/或著色劑以使它們變得更加有吸引力。粘性組合物可為凝膠劑、乳液劑(lotions)、軟膏劑、霜 劑等的形式，并且一般含有足夠量的增稠劑以使粘度為2500-6500cps，然而也可使用更粘稠的組合物(粘度甚至高達10，OOOcps)。粘稠組合物優選具有2500-5000cps的粘度，因為高于該范圍它們變得較難給予。比起凝膠劑、其它粘性組合物和固體組合物，液體制劑通常更容易制備。此外，尤其是通過注射或口腔給藥時，液體組合物在某種程度上也比較方便給予至動物、兒童，特別是較小的兒童。另一方面，粘性組合物可在適當的粘度范圍內配制以提供與粘膜(如胃粘膜或鼻腔粘膜)更長的接觸時間。對合適載體和其他添加劑的選擇將取決于確切的給藥途徑和具體劑型(如液體劑型(例如，組合物是否將被配制成溶液劑、懸浮劑、凝膠劑或其它液體劑型)、或固體劑型(例如，組合物是否將被配制成丸劑、片劑、膠囊劑、囊片、定時釋放劑型或液體填充劑型))的性質。除抗原、脂蛋白和任選的佐劑之外，溶液劑、懸浮劑和凝膠劑通常含有主要量的水(優選純凈水)。還可存在少量的其他成分，如PH調節劑(例如，堿，如NaOH)、乳化劑或分散劑、緩沖劑、防腐劑、濕潤劑、膠凝劑(例如甲基纖維素)、著色劑和/或芳香劑。組合物可為等滲的，即，它可具有與血液和淚液相同的滲透壓。可使用氯化鈉或其他藥學上可接受的試劑(如右旋糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇或其它無機溶質或有機溶質)來實現本發明組合物期望的等滲性。尤其是對于含有鈉離子的緩沖液，優選氯化鈉。可使用藥學上可接受的增稠劑將組合物的粘度維持在選定的水平。由于甲基纖維素易于得到且經濟并便于共同發揮作用，優選甲基纖維素。其它合適的增稠劑包括，例如黃原膠、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、卡波姆等。增稠劑的優選濃度將取決于所選定的試劑。要點在于使用可實現選定粘度的量。通常通過這類增稠劑的加入而由溶液制備粘性組合物。可使用藥學上可接受的防腐劑以延長組合物的保質期。盡管可使用多種防腐劑，包括例如對羥苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯銨，苯甲醇可能比較適合。盡管根據所選定的試劑可能有相當大的變化，防腐劑的合適濃度可為0. 02%-2% (基于總重量)。本領域技術人員將認識到相對于WCA和任選的佐劑，所選擇的組合物組分必須為化學上非活性的。根據本申請公開和本文所引用的文獻，這對化學原理和藥學原理領域的技術人員來說是沒有問題的，或者通過參考標準文本或通過簡單的實驗(不涉及過度實驗)可容易地避開問題。利用普遍接受的步驟混合各成分來制備本發明的免疫學上有效的組合物。例如可將所選擇的成分簡單地混入攪拌機、或其它標準設備中以生產濃縮的混合物，隨后通過加入水或增稠劑可將該混合物調節至終濃度和粘度，以及可能通過加入緩沖劑以控制PH或加入額外的溶質以控制張度(tonicity)。通常pH可為約pH 3-pH 7.5。考慮到如下因素具體患者或動物的年齡、性別、體重和病癥；以及用于給予的組合物的形式，可以不同劑量并通過醫藥和獸醫領域技術人員公知的技術給予所述組合物。尤其是由于可通過類似于已知疫苗的方式和劑量進行WCA給藥，本領域技術人員根據本申請公開、本文所引用的文獻和下文的實施例(例如本文所引用的申請中涉及小鼠和兔子的實施例)，可確定用于人或其它哺乳動物的劑量而無需過度實驗。用于初次給藥和加強劑量或用于順序給藥的適合方式也是可變的，可包括初步給藥繼之以后續給藥；盡管如此，可由本領域技術人員根據本申請公開、本文所引用的文獻 (包括本文所引用的申請)和下文的實施例來進行確定。可單獨給予該組合物、或者可與本發明的其它組合物或與其它預防性或治療性組合物共同給予或順序給予。本發明的疫苗可被一次給予、或者以各次給藥間隔2-6個月的方式給予兩次或三次。或者，本發明的疫苗包括每當需要時就可向動物或者人給予。本文所使用的“免疫原性組合物”是指用于對受試者的免疫系統進行刺激的組合物，以使該免疫系統的一種或多種功能被增強并針對該免疫原性組合物。抗原或者免疫原旨在表示含有可刺激宿主免疫系統產生對該抗原特異性的分泌的、體液免疫應答和/或細胞免疫應答的一個或多個表位的分子。可使用本技術領域已知的技術將免疫原性組合物用于生產抗體(包括分離的多克隆抗體和單克隆抗體)。免疫原性組合物包括疫苗。本文所使用的“疫苗”是指用于對受試者的免疫系統進行刺激的試劑，以提供針對不被受試者的免疫系統視為自身抗原的抗原的防護作用。免疫接種是指在受試者體內誘導高水平的抗體和/或細胞免疫應答的方法，所述免疫應答針對暴露至生物體的病原體或抗原。本文所使用的疫苗和免疫原性試劑涉及受試者的免疫系統受試者借之以產生針對侵入受試者細胞或細胞外液的抗原性物質的抗體和/或細胞免疫應答的解剖學特征和機理。就抗體生產而言，由此產生的抗體可屬于任何免疫學種類,如免疫球蛋白A、D、E、G或M。由于IgA是恒溫動物體內分泌系統的主要免疫球蛋白，所以關注刺激免疫球蛋白A (IgA)生成的疫苗。除IgA形成外，疫苗很可能產生廣譜的其它免疫應答，例如細胞和體液免疫力。對抗原的免疫應答已被很好地研究并被廣泛地報道。參見例如，Elgert，IMMUNOL. (WileyLiss, Inc.，1996) ；Stites 等，BASIC & CLIN. IMMUNOL.，(第 7 版，Appleton&Lange, 1991)。如本文所指出的，在免疫學中佐劑常常被用于通過對免疫系統進行刺激來修飾或增強疫苗的作用，從而使免疫系統更加有力地對疫苗進行應答，并因此提供了對具體疾病增強的免疫力。佐劑通過摹擬在進化上保守的分子(所謂的PAMPs)的特異性參數(sets)來完成這一任務，所述PAMPs包括脂質體、脂多糖(LPS)、用于抗原的分子籠、細菌細胞壁組分和內吞的核酸(如雙鏈RNA (dsRNA)、單鏈DNA (ssDNA)和含未甲基化的CpG 二核苷酸的DNA)。由于免疫系統已經進化以識別這些特異的抗原性部分，通過摹擬天然感染，和疫苗一起存在的佐劑通過加強樹突狀細胞(DCs)、淋巴細胞和巨噬細胞的活性，可極大地增強針對抗原的固有免疫應答。此外，由于佐劑的各種毒力功能均經過減毒，它們自身一般對宿主生物體幾乎沒有或沒有威脅。一般的無機佐劑(有時被稱為“鋁佐劑(alum)”)包括磷酸鋁、氫氧化鋁及其它磷酸鹽。盡管鋁鹽被普遍地用于人疫苗，也使用有機化合物(如角鯊烯)，這在動物疫苗中更加常用。油基佐劑常被用于某些獸醫疫苗中。除本文所述的佐劑之外，類毒素(如破傷風類毒素)也被用作佐劑。其它可與本發明的全細胞免疫原性組合物一起使用的蛋白性佐劑包括鴨肝炎表面抗原(參見美國專利No. 7，279，555)和細菌孔蛋白(參見美國專利No. 6，153，406和No. 6，013， 267)。本發明的特定實施方式提供了制備全細胞免疫原性組合物的方法，所述方法包括(a)使肺炎雙球菌在培養基(例如，無動物成分培養基，如大豆基培養基)中生長；(b)漂洗并富集該肺炎雙球菌(例如，至A_S 32); (c)通過在約4°C下與氯仿(約1/4到1/40 [體積/體積]，包括端值)攪拌足夠的一段時間(例如約2h)、或通過在約4°C下與三氯乙烯(約1/4到1/40 [體積/體積]，包括端值)攪拌足夠的一段時間(例如，約2h)、或通過在約4°C下與丙內酯(約1/4到1/4，000 [體積/體積]，包括端值)攪拌足夠的一段時間(例如，約24h)對細胞進行選擇性裂解，使肺炎雙球菌滅活；其中，滅活的細胞制劑未進一步漂洗；以及(d)對氯仿或三氯乙烯滅活的細胞進行凍干以除去氯仿或三氯乙烯；或將β-丙內酯滅活的細胞在37°C下孵育2h以分解β-丙內酯然后凍干該制劑。借助于下述實施例對本發明進行進一步的描述，所述實施例被提供用于說明，而并不應被認為是對本發明的限制。實施例實施例I.抗原制劑由James Paton (阿德萊德大學，澳大利亞)向我們提供菌株RxlE，該菌株中的肺炎鏈球菌溶血素基因被去毒的突變型PdT所取代。使用前文所述策略，將整個IytA基因組編碼區域用標記有卡那霉素抗性基因rpsL的Janus表達盒取代(Sung等，Appl. Environ.Microbio. 139 (2006) ;van Ginkel 等，J. Immunol. , 165,4778 (2000))。簡短而言，產生了三種 PCR 擴增產物(i )用引物 LADI (CAAGGTATCCATCATTCC) (SEQ ID NO: I)和 LAD2(CGCGGATCCACAGTAGAGCCAGATGGC (SEQ ID NO:2)擴增得到的 IytA 基因組區域上游的 Ikb片段；下劃線示出 BamHI 位點)；(ii)用引物 LAD3 (TTTGGGCCCGTTGCACGCCGACTTGAGG (SEQID NO:3);下劃線示出 ApaI 位點)和 LAD4 (CTTTGCTTCTCAGAATCTAGG) (SEQ ID NO:4) ψ增得到的IytA下游的800bp片段；以及(iii)用引物DAM351 (具有ApaI位點)和DAM406(具有BamHI位點)擴增得到的Janus表達盒(Sung等，2001)。使用相應的限制性內切酶在通過PCR引入的位點處對擴增產物進行消化，凝膠純化，然后在4°C下過夜連接。然后，將連接混合物用作最終PCR的模板，使用外側弓I物LAD5 (CATAGCTTTATGACTGATACC) (SEQID N0:5)和 LAD6 (AAGGTCTTCGAATCGGCAGTCG) (SEQ ID NO:6)，產生 3. 2kb 的擴增產物具有側翼為IytA上游序列和下游序列的Janus表達盒的三元DNA分子(tripartite DNAmolecule)。然后,通過選擇卡那霉素抗性菌落(其中的野生型IytA基因被IytA: : Janus中斷片段(disruption fragment)取代),將這一分子轉化入卡那霉素敏感、鏈霉素抗性的菌株 RxlE (PdT)中。
與野生型親代菌株相比，使用Janus特異性內側引物和LAD5引物通過PCR在基因型上證實了該推定的整合體lytA: : Janus菌株產生了 Janus特異性PCR產物,但是野生型菌株沒有。在5%脫氧膽酸鈉存在的情況下，通過對溶胞敏感性進行評價在表型上證實了 IytA: : Janus轉化子野生型菌株裂解,而IytA缺乏菌株抗溶胞。RxlE PdT菌株的IytA: : Janus轉化子被命名為RM200。本文使用了四種不同的滅活細胞制劑，其中用乙醇、氯仿、三氯乙烯或丙內酯實現失活(分別為WCE、WCC、WCT或WCB)。通常，使菌株RM200生長至A_為1.0，此時活菌數(viable count)為約6X108CFU/ml。在4°C下進行后續步驟。通過離心收集細胞并用乳酸化林格氏溶液(LR) (102mM NaCl、28mM NaC3H5O3、I. 5mM CaCl2 和 4mM KCl)漂洗兩次。對于WCE制劑，將細胞重懸至A6tltl為10，在15min內，逐步加入乙醇至70% (體積/體積)。將懸浮液攪拌55min，再次離心沉淀細胞，漂洗兩次，在具有10%蔗糖的LR中重懸至A_為32，培養至確定無菌，再以單次使用的等份凍干。對于WCC制劑和WCT制劑，將處于具有10%蔗糖的LR中的A_為32的經漂洗的細胞與氯仿或三氯乙烯(1/40 [體積/體積])混合2h。對于WCB，將處于具有10%蔗糖的LR中的經漂洗的細胞與β -丙內酯(BPL)( 1/4，000 [體積/體積])在4°C下混合24h，隨后在37°C下孵育2h至使BPL失活。對于WCC和WCT，滅活的 細胞不用漂洗，而是直接凍干(消除了殘留的有機溶劑)；在使BPL失活后，同樣地對WCB進行凍干。通過將懸浮液潤旋Imin然后在16，OOOXg離心5min來制備上清液。使用總蛋白試劑盒，以牛血清白蛋白(Sigma)作為標準對蛋白濃度進行測定。用預制的4-12%Bis-TrisSDS凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)進行SDS-PAGE。將WCC懸浮液用探頭聲波儀在最高強度聲波處理至少2min以制備WCC裂解物。在免疫接種前一天，將疫苗按如下制備將冷凍的等份解凍或用無菌水使凍干粉劑復水，稀釋至適當的濃度，并在所示濃度于15ml錐形管中與Al (OH)3混合，然后在4°C下翻轉過夜以使之吸附。氫氧化招(招佐劑)(2%招膠(Alhydrogel))來自于 Brenntag North America(Reading, PA)。β -丙內酯(BPL)來自于 Fisher (Rockford, IL),鹽水來自于 B. BraunMedical Inc. (Bethlehem，PA)。所有其它試劑從Sigma處獲得。霍亂毒素(CT)來自于ListBiological Laboratories (Campbell, CA)。大腸桿菌不耐熱毒素LT的突變衍生物(mLT(R192G)和 dmLT(R192G/L211A))如此前所述得到(Dickenson & Clements, Infect. Tmmun.,63,1617 (1995))。LT、紗布貼劑和用于透皮免疫的砂紙由Intercell USA,Gaithersburg,MD提供。實施例2.小鼠的免疫接種和激發將C57BL/6J 小鼠(Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine)用于所有的實驗中。在首次免疫接種時年齡為4-6周。通過將10 μ L鹽水、單獨的佐劑、或與特定的抗原混合的佐劑無損傷地滴注入未麻醉小鼠中，進行鼻內(i. η)免疫(該步驟不將免疫原放置入肺中);在I周后進行二次免疫。分別通過將與l%NaHC03和30%蔗糖混合的30 μ L疫苗放置在口腔表面上、或者將處于相同稀釋劑中的5μ L疫苗放置在舌下，進行口腔或舌下免疫。口腔或舌下免疫每周進行一次，共進行三次，而經鼻內免疫僅給予兩次。將WCC用于透皮免疫(TCI)實驗。將WCC在含有0. l%Zwittergent3-14(Calbiochem, Gibbstown, NJ)和1%精氨酸(Sigma)的水中再水化,然后聲波處理至平均尺寸為 IOOnm (WCAlOO)或 20nm(WCA20)。將小鼠用 2，2，2-三溴乙醇(Avertin ;Sigma)麻醉，然后用推子剃除背部毛發。用濕紗布輕柔觸碰，使剃過的皮膚含水，用干燥的無菌紗布輕撫來除去多余水。在用砂紙輕柔打磨后，用移液管將免疫溶液(體積為20μ L)移至貼劑上，將該貼劑施加于剃過的區域并在該皮膚上保留18h。每兩周免疫接種一次，共進行三次。對于除鼻內免疫情況外的所有免疫接種，在最后一次免疫接種2周后取血，對于鼻內免疫在3周后取血，并分析WCA刺激后的IL-17A生成。將未麻醉的小鼠輕輕地束縛，使之每隔兩周在下背部接受一次、共接受兩次或三次皮下注射(具有或不具有抗原的200 μ L佐劑)。在最后一次免疫接種I周或2周后取血，并分析WCA刺激后的抗體生成和IL-17A的體外生成。鼻咽(NP)定殖模型為測定對NP定殖的易感性，按此前所述的方法(Malley等，2001)用活的莢膜化肺炎雙球菌進行經i. η.的激發如此前所述，在最后一次免疫接種四周后(或對于通過TCI免疫的小鼠，2周后)，用處于所施用的10 μ L PBS中的IO7CFU的血清 型6Β菌株0603對小鼠進行激發。為測定NP定殖，通過滴注從橫斷氣管逆流的無菌鹽水、收集來自鼻孔的前6滴(約O. 1ml)、并將未摻水的或稀釋的樣品置于含有2. 5μ g慶大霉素/ml的血瓊脂平板上，進行上呼吸道培養。圖中示出了各小鼠的每鼻腔洗滌物樣品的CFU數；幾何平均數(GM)作為水平條展示。為便于統計分析，無菌樣品被規定為檢測下限(I. 6CFU/鼻腔洗滌物)的一半或O. 8CFU/鼻腔洗滌物。吸入性膿毒病激發模型在最后一次免疫接種兩周后，用異氟醚將小鼠緩和地麻醉，使之保持仰臥，并使用我們之前所述的模型(Lu等，Infect. Immun. ,77,2076 (2009))，給予 100 μ L 含有 3 型菌株 WU-2 或 5 型菌株 DBLS (David Briles 博士，Univ. Alabama,Birmingham,AL)的接種物的鼻內接種,但是進行了如下改變在吸入性激發前2天,小鼠不再經鼻內暴露于肺炎雙球菌。這一模型在未免疫小鼠中于3-4天內誘導了膿毒病和死亡。對小鼠每日監測兩次，當表現出疾病的病征時，通過吸入CO2處死并進行瀕死放血，隨后獲得血培養物；如下所述，在所有小鼠中，經腹膜內注射如下物質500 μ L鹽水或者300 μ L鹽水外加200 μ L加熱失活的血清(56°C下30min),該血清來自于由用氫氧化招(具有或不具有WCA)免疫接種的兔子。所有動物研究都經過了當地動物倫理委員會批準。統計分析使用PRISM (4. Oa 版本,GraphPad Software, Inc.)通過 Mann-WhitneyU檢驗對抗體和IL-17A的濃度以及NP定殖密度進行比較。同樣使用PRISM由Kaplan-Meier檢驗分析存活率差異。對于毒物學研究，所有比較都是與接受單獨的鋁佐劑的組進行的。使用ANOVA或Welch’ s檢驗，通過組兩兩比較法對體重、食物消耗量、體溫、血液學(除白細胞計數之外)凝結參數、臨床化學值以及器官重量進行比較，對于多重比較進行適當的調整。對于白細胞計數和尿分析，由于缺乏正態性(normality),分別將數據進行對數變換和秩變換，并將變換后的數據進行如上分析。通過Cochran Mantel Haenszel檢驗對紅斑、焦痂和水腫形成進行分析。實施例3.兔子免疫接種和毒物學研究所有的兔子免疫接種均在MPI (Mattawan，MI)進行。在第I天、第15天、第29天和第43天，通過肌內注射向每組各三只的組中的雌性新西蘭白兔給予O. 5ml的如下注射液鹽水；單獨的Al (OH)3 (含有O. 6mg Al);劑量為50,500或5000Ag的Al (OH)3吸附的WCB或全細胞白喉-破傷風-百日咳全細胞(DTwP)疫苗(來自Institute Butantan的臨床產品)。在各次免疫接種前和在第45天瀕死放血時得到血清，并冷凍寄送至波士頓兒童醫院(Children’ s Hospital Boston)以對抗體進行測定。對于所有的動物，定期對發病率、死亡率、臨床征象、體溫以及食物和水的消耗量進行觀察。在每次給藥前對皮膚刺激得分(Dermal irritation scores)進行評價,在每次給藥之后(除最后一次給藥外)每日進行評價并連續評價三天。在基線時、第2天和終點時，進行臨床病理學研究。在研究終點(最后一次給藥兩天后)，進行肉眼檢查，對器官重量進行記錄，在顯微鏡下對注射部位進行檢測。實施例4.酶聯免疫吸附分析(ELISA)在包被有處于PBS中的WCA (IOOps蛋白/ml)的Immulon 2HB 96微孔板(ThermoScientific, Waltham, MA)中對抗WCA的鼠抗體進行分析。將平板用處于PBS中的1%BSA進行封閉。加入在PBS-T中稀釋的抗體，并于室溫下孵育2h。用PBS-T對平板進行漂洗，加入抗小鼠免疫球蛋白G、G1或G2的HRP綴合二抗(全部來自Sigma)，并于室溫下孵育lh。用SureBlue TMB微孔過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg, MD)對平板進行漂洗和顯色。 實施例5.全血樣品中IL-17A生成的分析向含有10%的低內毒素限定胎牛血清(FBS) (Hyclone,Logan,UT)和10 μ g/ml環丙沙星(Cellgro, Manassas, VA)的 450pd DMEM 培養基(BioWhittaker, Walkersville, MD)中加入50 μ L肝素化血液。除了未刺激的對照外，將培養物與IO7個細胞的肺炎雙球菌WCA在37°C下孵育6天。在離心后收集上清液，并儲存在-80°C下直至通過酶聯免疫吸附分析(ELISA)對 IL-17A 的濃度進行分析(R&D Systems, Minneapolis, MN)。實施例6.表面滅活分析如此前所述的方法進行嗜中性白細胞表面滅活分析(Lu等,2008 ;Weinberger等，2009)。簡短而言，6B型菌株0603 (Malley等，2005)生長至對數生長中期，并在_80°C下于THY/10%甘油中進行冷凍。在實驗當天，將細菌解凍并將其在補充有10%FBS的RPMI中稀釋至100CFU/gL，用正常的兔血清或來自于已按照如上所述進行了三次WCV免疫接種的兔子血清在37°C下調理30min。在所有情況下，將兔子血清在52°C下加熱30min以使補體失活。根據制造商說明書，使用Histopaque 梯度(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)從人類志愿者的外周血中純化出多形核白細胞(嗜中性白細胞)并立即使用。將被稀釋至含有30cfu的、經調理的5 μ L細菌懸液以5個重復/平板的方式，在室溫下點樣于具有5%脫纖維蛋白的羊血的胰蛋白酶解酪蛋白大豆瓊脂(TSA II) (BD)上，使流體吸附，這需要約15min。然后涂覆10 μ L嗜中性白細胞(3X IO6細胞/mL;細菌嗜中性白細胞的比值為約I : 60)，進行吸附，并在37°C下、5%C02中孵育過夜。對照包括在沒有嗜中性白細胞、或具有嗜中性白細胞但沒有血清的情況下點樣的細菌。實施例7. WCB免疫接種動物中的膿毒病模型用鋁佐劑和相當于滅活前的OUO7CFU或IO8CFU劑量的WCB每2周對動物經皮下(s.q)免疫接種一次，共進行兩次。在第二次給藥6天后，取血用于IL-17A和抗體測定。2天后(沒有預先暴露)對小鼠進行WU-2吸入激發，并每天兩次地對疾病和死亡進行監測，共監測7天。在第7天，從存活者處獲得最終的血液(血培養物)。結果在圖中示出。使用不同劑量的WCB重復這一實驗，結果在圖2B、圖9A和圖9B中示出。在這一膿毒病激發中，用107-3X IO8CFU免疫接種的所有小鼠在激發后存活，在3X IO6和IO6免疫接種的組中有三例死亡。
實施例8.對用WCC進行的頰免疫/舌下免疫/皮下免疫的評價在這一實施例中，“ 口腔”或“頰”給藥途徑使用了放置在清醒小鼠舌下的30L體積的WCA和佐劑。疫苗稀釋劑由30%蔗糖、LR和碳酸氫鈉組成。“舌下”給藥途徑使用了放置在舌下的5μ L體積的WCA和佐劑，使用相同的稀釋劑。“皮下”途徑僅在LR中稀釋。基于實驗，口腔途徑看起來有效。這一研究的目的是比較通過口腔給予、更加濃縮的舌下給予和皮下給予的WCA和dmLT的效力，并評價免疫原性和保護能力。將免疫原與dmLT —起制備從90mg總重量中稱取27mg，溶于50 μ L 3%碳酸氫鈉/30%蔗糖LR緩沖液中，使得終濃度為10mg/ml。制備這一制劑僅用于單次免疫接種，第二次免疫接種時再新鮮配制。將WCC在LR中凍干，并在80 μ L 3%NaHC03和30%蔗糖中復水以得到5E10 ;或在400 μ L中復水以得到Ε10。在表I中示出了分組和途徑。表I.疫苗的途徑和組成
權利要求
1.具有全細胞革蘭氏陽性細菌的、誘導多重免疫力的部分的免疫原性組合物，通過以下述方式選擇性裂解全細胞細菌制劑來制備所述免疫原性組合物將主要誘導抗體應答的可溶部分和主要誘導抗體非依賴性應答的細胞部分保留在所述組合物中。
2.如權利要求I所述的免疫原性組合物，其中，所述細菌無莢膜。
3.如權利要求I或2所述的免疫原性組合物，其中，所述細菌為肺炎鏈球菌。
4.如權利要求1-3任一項所述的免疫原性組合物，其中，通過化學試劑完成所述選擇性裂解。
5.如權利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述化學試劑為氯仿、三氯乙烯或￠-丙內酯。
6.如權利要求1-3任一項所述的免疫原性組合物，其中，通過聲波處理完成所述選擇性裂解。
7.包含如權利要求1-6任一項所述的免疫原性組合物的疫苗。
8.如權利要求7所述的疫苗，其中，所述疫苗包含佐劑。
9.如權利要求7或8所述的疫苗，其中，所述疫苗被配制為用于鼻腔給藥、頰給藥、透皮給藥、皮下給藥或肌內給藥。
10.在哺乳動物體內誘導免疫應答的方法，所述方法包括給予如權利要求7-9任一項所述的疫苗。
11.制備滅活的、全細胞免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物具有來自于革蘭氏陽性細菌的、誘導抗體依賴性免疫力和抗體非依賴性免疫力的細菌的部分，所述方法包括以下述方式選擇性裂解細菌將可溶部分和裂解的細胞部分保留在所述全細胞免疫原性組合物中。
12.如權利要求11所述的方法，其中，所述細菌無莢膜。
13.如權利要求11或12所述的方法，其中，所述細菌為肺炎鏈球菌。
14.如權利要求11所述的方法，其中，所述可溶部分誘導血清型非依賴性的抗體應答，所述細胞部分誘導增強的吞噬作用。
15.如權利要求11-14任一項所述的方法，其中，通過化學試劑完成所述細菌的裂解。
16.如權利要求15所述的方法，其中，所述化學試劑為￠-丙內酯、氯仿或三氯乙烯。
17.如權利要求15或16所述的方法，所述方法進一步包括以保留所述可溶部分和所述細胞部分的方式去除所述化學試劑。
18.如權利要求11-13任一項所述的方法，其中，通過聲波處理完成所述細菌的裂解。
全文摘要
本發明提供了免疫原性組合物和制備免疫原性組合物的方法，所制備的免疫原性組合物具有滅活的、全細胞肺炎鏈球菌的、誘導多重免疫力的部分，所述方法通過以下述方式選擇性裂解全細胞細菌制劑來制備所述免疫原性組合物將主要誘導抗體應答的可溶部分和主要誘導抗體非依賴性應答的細胞部分保留在該免疫原性組合物中。
文檔編號A61K39/02GK102648003SQ201080055928
公開日2012年8月22日 申請日期2010年10月12日 優先權日2009年10月9日
發明者喬治·A·羅伯遜, 安德烈亞·馬里亞·泰特, 波特·安德森, 理查德·馬利, 瓦爾德里·德奧利韋拉·迪亞斯, 維維亞娜·邁蒙里·貢薩爾維斯, 讓-弗朗索瓦斯·盧西恩·邁松納夫, 陸英杰, 馬克·奧爾德森 申請人:兒童醫療中心有限公司, 布坦坦基金會, 疫苗解決途徑公司