丙型流感病毒和疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種與以前鑒定的任何丙型流感病毒僅具有低同源性的新型丙型流感病毒。攻擊研究顯示所述病毒可感染豬并在豬間傳播。此外，丙型流感病毒通常被看作人病原體，并且已進行了血清學研究，觀察抗該病毒的抗體在豬和人中的發生率。約10％的豬和30％的人具有針對該病毒的抗體。另外的實驗數據顯示所述病毒可感染白鼬(人感染研究的替代者)，并在白鼬傳播。在第三方面，本發明提供了該新型丙型流感病毒的部分基因組。在另一個方面，本發明提供了檢測動物中這種新型丙型流感病毒的方法。
【專利說明】丙型流感病毒和疫苗
[0001] 通過引用并入
[0002] 本申請要求2012年1月27日提交的美國專利申請系列號13/385,004的優先權， 將其公開內容通過引用并入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 丙型流感病毒是人的常見病原體，因為大部分個體在兒童時已被感染。丙型流 感病毒引發與普通感冒相似的輕微呼吸道疾病。中國有一則關于從豬分離出丙型流感 病毒的報導（Yuanji 和 Desselberger 1984, J. Gen. Virol. 65:1857-72)。此外，該工作 顯示豬丙型流感病毒可感染豬并在豬間傳播。幾篇其它論文已在豬中鑒定了與丙型流 感病毒反應的抗體，表明豬是丙型流感病毒的儲藏庫或人極普遍地將該病毒傳播給豬 (Kimura 等人 1997, Virus Res. 48:71-9 ;Yamaoka 等人 1991，J Gen Virol. 72:711-714; Brown 等人 1995,Epidemiol. Infect. 114:511-20 ;0hwada 等人 1987,Microbiol Immunol. 31:1173-80)。
[0005] 發明概述
[0006] 由于丙型流感病毒僅在一篇論文中被報導，因此在豬中發現其非常罕見。已被分 離和表征的病毒是丙型流感病毒的一種非常獨特的變體。該病毒與已知的丙型流感病毒的 總體百分比同源性僅為約65%，顯示這是一個從未描述過的并且與已描述過的病毒僅有遠 緣關系的全新病毒譜系。該低水平的同源性表明針對典型人丙型流感病毒制備的疫苗不能 保護免受C/swine/Oklahoma/1334/2011的侵害。"通用"丙型流感病毒引物組也不能檢測 該病毒的發現也說明其新穎性。此外，人和豬中抗體滴度的發現以及該病毒在豬和白鼬中 復制的能力表明該病毒能夠引發豬和人的疾病。我們顯示我們可產生保護豬免受感染的疫 苗，并且科學文獻也支持該疫苗可保護人類。
[0007] 在一個方面，本發明是一種與先前鑒定的任何丙型流感病毒僅具有低同源性的新 型丙型流感病毒。攻擊研究顯示該病毒可感染豬，并且可在豬間傳播。此外，丙型流感病毒 通常被認為是人病原體，并且已進行了血清學研究，以查看抗該病毒的抗體在豬和人中的 發生率。約10%的豬和30%的人具有針對該病毒的抗體。進一步的實驗數據顯示該病毒 可感染白鼬（人感染研究的替代者）并在其間傳播。
[0008] 在第二方面，本發明是針對該新型丙型流感病毒的疫苗。
[0009] 在第三方面，本發明是該新型丙型流感病毒的部分基因組。
[0010] 在另一個方面，本發明是檢測動物中該新型丙型流感病毒的方法。
[0011] 附圖概述
[0012] 圖1是本發明的新型丙型流感病毒的電子顯微鏡照片。
[0013] 圖2是顯示接種和非接種的豬中HI滴度的圖。
[0014] 圖3是顯示接種和非接種的豬中實時PCR閾值的圖。
[0015] 圖4是顯示用本發明的病毒攻擊的白鼬的組織培養物感染劑量的圖。
[0016] 優選實施方案的詳述
[0017] 病毒的分離
[0018] 提交給Newport實驗室的樣品是來自顯示流感樣疾病體征的豬的鼻拭子。通過實 時逆轉錄PCR顯示樣品對于甲型流感是陰性的。將樣品的等分施加于豬睪丸（ST)細胞的 匯合單層以試圖生長其中存在的任何病毒。5天后，致細胞病變效應顯著，表明病毒正在豬 睪丸細胞中生長。通過QPCR分析細胞培養上清液樣品的甲型流感，樣品呈陰性。分析細胞 培養上清液使火雞紅細胞發生紅血球凝集（紅細胞凝集測定）的能力。按照下列方案（實 施例#1)進行紅細胞凝集測定。
[0019] 實駘 #1
[0020] 1.0 導言
[0021] 定量豬流感病毒。
[0022] 2. 0 材料
[0023] ?儲液池
[0024] · 96孔微量滴定V型底板
[0025] ?多通道移液器和吸頭（10-200 μ L)
[0026] · 100-1000 μ L 移液器
[0027] · 10-100 μ L 移液器
[0028] ?移液器吸頭
[0029] ?個人防護設備（ΡΡΕ:實驗工作服、防護眼鏡、手套）
[0030] ?生物安全操作箱
[0031] ?蓋板/蓋
[0032] ?定時器
[0033] · 50mL falcon 管
[0034] ?離心機
[0035] 3. 0試劑/培養基
[0036] ?來自Lamp ire的火雞紅細胞（TRBC)
[0037] · IX DPBS
[0038] 4.0培養基制劑
[0039] 火雞紅細胞溶液（0· 5% )
[0040] · TRBC到達Alsevers溶液。在50mL圓維形管中以2000rpm離心10分鐘。吸取 并棄去上清液。
[0041] ?通過添加等于起始血液的體積的IX DPBS洗滌RBC。顛倒和輕輕搖動。離心并 棄去上清液。再重復2次。將沉積細胞于4°C貯存。
[0042] ?將50mL IX DPBS添加入50mL的管。取出250 μ L IX PBS。添加250 μ L的沉積 火雞RBC。輕輕混合。每板需要5mL。在4°C貯存稀釋的細胞。
[0043] 5.0 方法
[0044] 制備
[0045] ?將8個樣品在96孔板上進行水平運行。基于待測試的樣品計算需要多少板，填 寫適當的文書。
[0046] ?備選設置：將12個樣品在96孔板上垂直運行。
[0047] 測試方法
[0048] ?用50 μ L DPBS填充板的所有孔。
[0049] ?將50 μ L樣品#1置于孔A1中；將樣品#2置于B1中，等。
[0050] ?對于每一個測試組的板，在最后一個板上運行陰性對照（僅DBPS)。
[0051] ?利用50 μ L從第1列至第12列（不包括陰性對照行）稀釋板，棄去剩余的50 μ L。
[0052] ?在板被稀釋后，用50yL的0.5% TRBC充填所有孔（顛倒管以混合血細胞，不渦 旋）。輕輕敲打板，覆蓋板，在室溫溫育達到2小時。
[0053] ?備選設置：垂直運行12個樣品，將50 μ L樣品#1置于孔A1中；將樣品#2置于 Α2中。
[0054] ?利用50 μ L從第Α行開始至第Η行（不包括陰性對照列）稀釋板，棄去剩余的 50 μ L〇
[0055] ?在板被稀釋后，用50yL的0.5% TRBC充填所有孔（顛倒管以混合血細胞，不渦 旋）。輕輕敲打板，覆蓋板，在室溫溫育達到2小時。
[0056] 6.0 讀數
[0057] ?將板傾斜30-45°以進行讀取。當讀數時，無完全淚滴的最后一個孔是終點。標 記在對應的文書上。
[0058] · HA滴度列于對應的文書上。
[0059] ?陰性對照行（或列）應當全是淚滴，顯示無血凝集。
[0060] 該未鑒定的病毒具有使crbc凝集的能力，滴度為1280。許多病毒包含編碼血凝素 蛋白的基因，所述蛋白使病毒能夠結合細胞，包括紅細胞。流感病毒具有使紅細胞凝集的能 力。
[0061] 實駘 #2
[0062] 將一瓶用該未知病毒感染的ST細胞送至University of Minnesota獸醫診斷實 驗室以進行電子顯微鏡檢查。該病毒的圖像與正粘病毒科一致（圖1)。該家族由甲型、乙 型、丙型流感病毒和索戈托病毒組成。
[0063] 實駘 #3
[0064] 利用被設計來特異性檢測甲型、乙型或丙型流感的引物嘗試PCR(表1)。所有PCR 反應是陰性的。此外，使用神經氨酸酶底物甲基傘形酮N-乙酰神經氨酸進行神經氨酸酶活 性測定。該病毒不具有神經氨酸酶活性（甲型和乙型流感病毒具有神經氨酸酶）。隨后利 用4-硝基苯基乙酸酯（Sigma Aldrich N8130)進行酯酶活性測定。病毒顯示酯酶活性。 使紅細胞凝集的能力以及具有酯酶活性是丙型流感病毒和冠狀病毒科的一些成員的特征。 基于血凝素酯酶活性和電子顯微鏡檢查，該病毒被初步鑒定為丙型流感病毒，盡管通過PCR 檢測為丙型流感病毒陰性。
[0065] 表1.用于實時逆轉錄PCR講行病毒檢測的引物和探針。（IABkQ=#荷華黑洞萍 滅劑）
[0066]
【權利要求】
1. 一種用于保護哺乳動物免受丙型流感病毒的分離株感染的疫苗，其包含可接受的載 體和免疫有效量的能夠感染哺乳動物的所述丙型流感病毒分離株的殺死細胞。
2. 權利要求1的疫苗，其中從豬中分離到所述丙型流感病毒分離株。
3. 權利要求2的疫苗，其中所述丙型流感病毒分離株能夠感染白鼬。
4. 權利要求2的疫苗，其中所述疫苗保護豬免受所述丙型流感病毒分離株感染。
5. 權利要求1的疫苗，其中從所述丙型流感病毒分離株產生的cDNA文庫與人丙型流感 病毒的株系的基因組具有少于約85%的同源性。
6. 權利要求5的疫苗，其中從所述丙型流感病毒分離株產生的cDNA文庫與人丙型流感 病毒的株系的基因組具有少于約50%的同源性。
7. 權利要求1的疫苗，其中隨機樣品中約8%的豬擁有具有針對所述丙型流感病毒分 離株的抗體的血清。
8. 權利要求1的疫苗，其中樣品中約28%的人擁有具有針對所述丙型流感病毒分離株 的抗體的血清。
9. 一種能夠感染哺乳動物的分離的豬丙型流感病毒，其中從所述分離的豬丙型流感病 毒產生的cDNA文庫與人丙型流感病毒的株系的基因組具有少于約85%的同源性。
10. 權利要求9的分離的豬丙型流感病毒，其中從所述分離的豬丙型流感病毒產生的 cDNA文庫與人丙型流感病毒的株系的基因組具有少于約50%的同源性。
11. 權利要求9的分離的豬丙型流感病毒，其中通過血凝抑制測定分析的隨機樣品中 約8%的豬擁有具有針對所述丙型流感病毒分離株的抗體的血清。
12. 權利要求9的分離的豬丙型流感病毒，其中通過血凝抑制測定分析的樣品中約 28%的人擁有具有針對所述丙型流感病毒分離株的抗體的血清。
13. -種用于測定至少一個樣品中權利要求9的豬丙型流感病毒的存在的方法，其包 括以下步驟： (a) 使用至少一個包含正向和反向引物的純化的寡核苷酸引物對從樣品擴增至少一個 核酸的一個或多個區段，其中所述正向引物包含SEQ ID NO: 1，所述反向引物包含SEQ ID NO: 2,產生至少一個擴增產物；和 (b) 檢測擴增產物，從而測定所述樣品中豬丙型流感病毒的存在。
14. 權利要求13的方法，其中（b)包括測定樣品中所述豬丙型流感病毒的量。
15. 權利要求13的方法，其中（b)包括逆轉錄實時聚合酶鏈式反應。
16. -種包含SEQ ID N0:4的分離的核酸。
17. 權利要求16的分離的核酸，其編碼SEQ ID N0:5的蛋白質。
18. 權利要求17的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒聚合酶2具有至少 71 %的同源性。
19. 一種包含SEQ ID N0:6的分離的核酸。
20. 權利要求19的分離的核酸，其編碼SEQ ID NO:7的蛋白質。
21. 權利要求20的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒聚合酶亞基PB1具有 至少85 %的同源性。
22. -種包含SEQ ID N0:8的分離的核酸。
23. 權利要求22的分離的核酸，其編碼SEQ ID N0:9的蛋白質。
24. 權利要求23的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒聚合酶3具有至少 66 %的同源性。
25. -種包含SEQ ID NO: 10的分離的核酸。
26. 權利要求25的分離的核酸，其編碼SEQ ID NO: 11的蛋白質。
27. 權利要求26的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒血凝素酯酶具有至少 66 %的同源性。
28. -種包含SEQ ID NO: 12的分離的核酸。
29. 權利要求28的分離的核酸，其編碼SEQ ID NO: 13的蛋白質。
30. 權利要求29的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒核蛋白具有至少59% 的同源性。
31. -種包含SEQ ID NO: 14的分離的核酸。
32. 權利要求31的分離的核酸，其編碼SEQ ID NO: 15的蛋白質。
33. 權利要求32的分離的核酸，其中所述蛋白質與Μ基因的丙型流感病毒未剪接產物 具有至少58 %的同源性。
34. -種包含SEQ ID NO: 16的分離的核酸。
35. 權利要求34的分離的核酸，其編碼SEQ ID NO: 17的蛋白質。
36. 權利要求35的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒非結構蛋白1具有至 少48 %的同源性。
37. 權利要求34的分離的核酸，其編碼SEQ ID NO: 18的蛋白質。
38. 權利要求37的分離的核酸，其中所述蛋白質與丙型流感病毒非結構蛋白2具有至 少48 %的同源性。
【文檔編號】A61K39/145GK104203972SQ201380012424
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年1月28日 優先權日:2012年1月27日
【發明者】R·R·西門遜, E·A·科林, B·M·豪瑟 申請人:新港實驗室股份有限公司