專利名稱：流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及醫用生物藥品流感病毒疫苗，特別是流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法。
流感是甲、乙、丙三型流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。本病發病急，傳播快，發病率高，具有一定的死亡率，在兒童和老弱患者中死亡率較高，給人類造成嚴重的社會和經濟后果。至今人類尚無有效的治療方法，唯一的方法就是接種流感疫苗進行預防，因此流感疫苗的研制具有十分重要的社會和經濟效益。
目前，國際上流感病毒疫苗主要包括流感病毒滅活疫苗(純化的，三價的全屬毒粒滅活疫苗)；裂解疫苗；亞單位疫苗三種如

圖1，三種流感病毒疫苗的結構所示。它們各有利弊，前者制備簡單，但有時會引起不良反應；裂解的，可降低不良反應，但制備過程中需加和去除裂解劑；而后者安全性好，可對兒童進行免疫接種，但抗體應答效果差，同時造價高。
流感全病毒滅活疫苗于1941年在美國首次被批準使用。這種疫苗接種后，局部和全身反應都很強。本世紀60年代，超速離心機和層析色譜技術的應用，使毒粒純化操作大大提高，制成了全毒粒疫苗。然而，兒童使用時仍可出現不良反應。以后又研制出裂解的純化疫苗，不良反應大為減少，接著研制出多種化學裂解劑，如乙醚，3-N-丁基酸鹽(Tri-N-butylphosphate)，聚山梨酸酯80(Polysorbate80)，脫氧膽酸鈉(Sodium deoxy cholate)，三硝基甲苯X100(TritonX100)等，生產出了裂解疫苗。此種疫苗1968年在美國首次被批準使用。
本世紀70和80年代，在裂解疫苗的基礎上，又研制出了毒粒亞單位和表面抗原(HA和NA)疫苗。英國在臨床疫苗試用中，證實了免疫效果與裂解疫苗相同，并可用于兒童。80年英國首次批準使用，而后擴展到其它國家。
在實踐中發現，毒粒亞單位和表面抗原疫苗接種后雖然不良反應有所減少，但其免疫原性都不如純化的全毒粒疫苗，從而就開展了佐劑研究工作。從根本上講裂解疫苗，亞單位疫苗的免疫原性目前還尚未完全解決。
本發明目的是針對現有技術不足。提供一種利用納米技術裂解流感病毒的方法，取代化學試劑和去污劑制成亞單位疫苗，可以簡便快速、安全可靠地滿足工業化生產的需求。
流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法；單價全病毒懸液經檢定合格后，置4-8℃冰箱中保存備用，防止凍融；將選定好的納米對撞機放置于4-8℃無菌室中，接通電源，調節電壓，選定10nm極超微粒子通道，用無菌超純水沖洗容器和管道，分別或合并進行病毒單價懸液處理；處理完畢，沖洗干凈容器和管道，對裂解后的流感病毒超微粒子再層析純化，去除病毒核衣殼和基質蛋白，獲得高度純化的流感病毒表面抗原HA和NA亞單位。
納米科學，是人們研究納米尺度——即100納米至0.1范圍之內的物質所具有的特異現象和物異功能的科學，而納米技術則是指此基礎之上制造新材料、研究新工藝的方法和手段。納米科學技術不是某一學科的延伸，也不是某一工藝產物，而是基礎理論學科與當代高新技術的結晶。它以物理、化學的微觀研究理論為基礎，以當代精密儀器和先進的分析技術為手段，是一個內容廣闊的多學科群。
納米技術不僅是指它能制造超細粉末或納米液體技術，它還泛指在掃描隧道顯微鏡下，直接觀察和操縱單個原子和分子，按人們意愿組成需要的超微型器件。
(一)納米尺度的定義納米又稱毫微米，符號為nm或mu，是1微米的千分之一。如果以我們日常生活中常用的單位“米”(m)(1m＝3市尺)作為主單位的話，納米在長度單位中換算所處的位置如圖2所示。
可見，1納米等于10-9米(十億分之一米)，是人類肉眼不能分辨出來的很小的長度單位。一般人類頭發絲的直徑在70微米左右，即為70000納米。
組成自然界的最基本的單位是原子，它們的大小必須用埃這個單位來量度。而由原子構成的分子，則大小不等。一般有機小分子在幾個納米至幾十納米之間，與生命有關的生物分子則大得多。
(二)納米技術裂解流感病毒的理論依據1、流感病毒的形態結構眾所周知，甲、乙型流感病毒是有囊膜病毒，呈現多型性，常為球隊型，直徑為80-120nm。主要包括HA和NA以及M2三種蛋白。核衣殼呈現螺旋對稱，直徑9-15nm。RNA為單股負鏈。甲、乙型流感病毒的結構示意圖(見圖3)。
2、流感病毒主要多肽成分及其抗原性質(見圖4)根據流感病毒各抗原成分的性質及分子量大小可以看出，其主要保護性抗原可分為HA和NA，亞單位的大小分別為70kDa，其顆粒直徑在10nm以下。所以，我們選用10nm級對撞機對流感病毒進行技術處理，既保持其病毒的免疫原性，又能充分裂解病毒顆粒。用這種方法裂解的流感亞單位疫苗只含有濃縮和純化的流感病毒外殼抗原即血凝毒和種經氨酸酶；而不含有病毒核酸及其他外來蛋白質。這就是我們用納米技術處理流感病毒，制作亞單位疫苗的理論依據。
(三)納米對撞機的選型及工作原理目前尚無國產納米對撞機問世，從日本進口的納米對撞機主要有兩個型號LEH-2和PEH-1，(見圖5)。我們選用LEH-2型納米對撞機進行了中等規模的流感病毒亞單位疫苗生產，基本可以滿足實際需要。如果進行較大規模的生產，可采用PEH-1型機。
納米對撞機的基本工作原理是對對撞機中的單晶金剛石開了兩個“X”通道，反應物和介質在2000個大氣壓驅動通過這兩個“X”通道，在通道的交叉處瞬間被粉碎、分散和乳化。粉碎的粒度只有幾個納米，粒度小，粒度分布窄，而且粒度大小是可調控的。這與一般情況和一般能量下的反應顯然不同，肯定會發生質的變化。
本發明創造是利用高新物理技術和生物技術處理流感病毒的方法。取代化學試劑和去污劑制成亞單位疫苗的一次革命。
三十年前，生物學就遇到了可見光儀器的局限問題。一般的光學顯微鏡由于分辨率不夠不能對病毒進行觀測。電子濕微鏡雖然有很高的放大倍數，但是不能用于對活細胞的研究。而許多基本的生物學問題，必須在活的機體中去研究。
納米技術的發展使上述問題有了解決的辦法。在這個用埃或納米作單位的范圍中，病毒就好比是大象了。而原子就象是棋盤上的棋子，可以一個一個搬動。
納米技術在生物學中的應用既可能在掃描隧道顯微鏡下，直接觀察和操縱單個原子或分子，又可以粉碎生物材料，制造納米粉末或液體。我們應用納米技術處理流感全病毒(80-120nm)，裂解為10nm左右大小的顆粒，取代化學試劑和去污劑制成亞單位疫苗。實踐證明是完全可以的。它不僅手段先進科學，方法簡便快速，而且非常安全。表面抗原生物活性指標好。流感全病毒經納米級裂解超微化后，顆粒小，表面積大。產物易純化，收產率高，一般可提高抗原的免疫原性提高15-20％，影響安全的因素少，不殘留任何化學物質，具有特殊的生物物理性能。
(一)納米技術裂解流感病毒的電鏡結果。(見圖5)(二)納米技術裂解(物理方法)與化學試劑裂解流感病毒滅活亞單位疫苗各項質控指標檢測的比較。(見圖6)由圖6可看出化學方法裂解需要清除化學裂解劑，工藝復雜，影響安全因素多、疫苗免疫原性低；而納米技術處理表面抗原活性指標高，而且技術先進，方法簡使快捷，適于工業化生產，宜于普及推廣。
本發明創造附圖1為三種流感病毒疫苗的結構示意圖；圖2納米長度換算單位圖表；圖3甲、乙型流感病毒的結構示意圖；圖4流感病毒主要多肽成分及其抗原性質圖表；圖5為納米對撞機的型號與功能圖表；圖6納米技術裂解流感病毒的電鏡結果；圖7納米技術與化學裂解流感病毒亞單位疫苗各項質控指標、檢測結果比較。
下面結合實施例具體描述本發明創造。
實施例11、按國家規定的質量標準和工藝生產出的合格流感三價滅活全病毒粒懸液取30ml。
2、將合格的流感三價病毒粒懸液，放入調試好的納米對撞機，對流感病毒進行納米處理，調節電壓、壓力、流量，使病縣液裂解至10nm大小顆粒，以15分鐘處理30ml，經納米機處理后，再放入4-8℃冰箱內。
實施例21、按國家規定的流感病毒滅活疫苗生產方法進行收集單價病毒粒懸液約1000毫升作為中試樣品。
2、選下中小型納米對撞機，30分鐘能處理1000毫升產樣品，裂解病毒懸液顆粒均為10nm。
實施例31、流感病毒納米技術裂解亞單位滅活疫苗產業化大規模生產，生產環境條件必須符合GMP要求，疫苗生產全程工藝及質量指標，必須按流感疫苗WHO規定要求進行，人員、技術、設備、工藝環境必須綜合配套。
2、納米對撞機需用大中型一流設備，每小時能處理流感三價病毒粒懸液15000ml以上，安置于生產流感病毒疫苗最佳工藝環節，一般固定不動，納米對撞機每次處理流感三價病毒粒懸流技術參數不宜有變動，以確保量的穩定性。
本流感病毒滅活疫苗系由甲1、甲3及乙型流感病毒經納米技術處理后純化的病毒亞單位，經磷酸鹽緩沖液稀釋而成。每0.5ml含有血凝素甲1、甲3及乙型都在15μg以上。
經三價流感病素滅活疫苗免疫小白鼠后，血清中和試驗證明疫苗免疫后血清對甲1、甲3及乙型流感病毒的中和指數分別達到1.6×105，2.5×105，1.6×105以上，以保證疫苗免疫效果。
流感病毒納米裂解亞單位滅活疫苗再經皮下接種小白鼠，腹腔接種豚鼠，觀察7天。全部小白鼠及豚鼠體重增加，健康存活，無任何異常表現。證明疫苗安全性及毒性試驗合格。并經過敏原性檢測，證明不存在有過敏原。
通過納米技術裂解流感病毒粒懸液經實驗室、中試，產業化等不同規模應用，證實既能有效裂解流感病毒，提抗高免疫原性，又不殘留化學試劑，能顯著縮短工藝時間，又簡便價廉，很適合現代產業化生產。
權利要求
1.一種流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法，單價全病毒懸液經檢定合格后，置4-8℃冰箱中保存備用，防止凍融；將選定好的納米對撞機放置于4-8℃無菌室中，接通電源，調節電壓，選定10nm級超微粒子通道，用無菌超純水沖洗容器和管道，分別單價或三價并進行病毒懸液處理；處理完畢，沖洗干凈容器和管道，對裂解后的流感病毒超微粒子再層析純化，去除病毒核衣殼和基質蛋白，獲得高度純化的流感病毒表面抗原HA和NA亞單位。
2.根據權利要求1所述的流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法，按國家規定的質量標準和藝生產出的合格流感三價滅活全病毒粒懸液取30ml，放入微型納米對挖機內，進行納米技術處理，使流懸液裂解至10nm大小顆粒，以15分鐘處理30ml，經納米機處理后，再放入4-8℃冰箱內。
3.根據權利要求1所述的流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法，按家規定的流感病毒滅活疫苗生產方法進行收集單價病毒粒懸液約1000ml試樣品；選定小型納米對撞機，30分鐘能處理1000ml裂解病毒懸液顆粒均為10nm。
全文摘要
流感病毒納米技術裂解工藝制造亞單位疫苗的方法,將合格的流感病毒粒懸液,放入調試好的納米對挖機,對流感病毒進行納米技術處理,使病毒粒懸液裂解至10nm大小顆粒。是利用當代高壓物理學與生物學技術結合的一種嘗試,取代化學試劑和去污劑制成亞單位疫苗,可以簡便快速、安全可靠地滿足工業化生產的需求。
文檔編號A61P31/16GK1269244SQ00110210
公開日2000年10月11日 申請日期2000年3月16日 優先權日2000年3月16日
發明者茍仕金, 茍鴻鷹, 王成余 申請人:遼寧天成生物制藥研究所