專利名稱：：生產流感血凝素多價疫苗的方法生產流感血凝素多價疫苗的方法本申請是申請日為1995年5月26日，申請號為95197928.0，發明名稱為"生產流感血凝素多價疫苗的方法，，的發明專利申請的分案申請。發明肯景一般來說，本發明屬于重組流感疫苗領域。流感每年都發生，并且是世界范圍內顯著致病、致死的原因。兒童有最高的侵染率，而且對流感病毒在社會上的傳播負主要責任。老年人及有潛在健康問題的人對流感感染并發癥和住院治療有較高的危險。只在美國，在1956和1988年間的七個流感季節內，每個感染季節由于肺炎和流感都有10,000多人死亡，有凈艮告說2個季節中的每一個都有大于40,000人死亡(最新資料流感活動-美國及世界范圍，及1992-1993流感疫苗資料，致病致死周報,美國，健康及人類部門，公共健康服務中心，41/No.18:315-323,1992)流感病毒是由2個表面糖蛋白，血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)組成的高度多型的顆粒。HA價導病毒與宿主細胞的結合及在病毒侵入細胞過禾呈中病毒-細胞膜間的融合。流感病毒基因組由8條單鏈反義RNA片段組成，其中長度為第4的片段編碼HA基因。根據抗原差異流感病毒分為A、B和C型。流感A病毒通過包括亞型或型、地理來源、品系號及分離年代的命名法進行描述，如A/Beijing353/89。HA至少有13個亞型(-H13)，NA至少有9個亞型(N廣N9)。所有的亞型都發現于鳥中，但只有H廣ft和N廣N2發現于人類、豬和馬中(MurphyandWebster,"正粘病毒，，，在《病毒學》中,編者Fields,B.N.,Knipe,D.M.，Chanock,R.M.,1091-1152(Raven出版社，紐約，1990))。抗HA的抗體中和病毒并形成流感導致的感染的天然免疫的基礎(Clements,"流感疫苗，，，在疫苗免疫學問題的新探索，編者RonaldW.Ellis,pp.129-150(ButterworthHeinemarm,Stoneham，MA1992))。HA分子的抗原性變化造成了流感的頻繁爆發和利用免疫控制感染的局限性。HA的三維結構以及與其細胞受體唾液酸的相互作用已被廣泛研究(Wilson,等，"在3八°分辨率下流感病毒血凝素膜糖蛋白的結構"，直289:366-378(1981);Weis,等.，"與其受體唾液酸復合的流感病毒血凝素的結構，'，自然，333:426-431(1988);MurphyandWebster,1990)。HA分子在病毒粒子中以三聚體形式存在。每一單體包括兩條鏈，HA1和HA2，由一個二疏鍵連接。受感染的宿主細胞產生一個分子量約為85,000的糖基化的多肽前體(HA0)，然后被裂解為HA1和HA2。流感HA特異的中和IgG和IgA抗體的存在與其抗感染和疾病有關(Clements,1992)。滅活的完整病毒或部分純化的(分割的亞單位)流感疫苗以每抹的HA含量標定。流感疫苗通常含有7到25微克從三種流感的每一種中得到的HA。另一主要的表面糖蛋白NA在對流感的保護性抗體免疫和T-細胞應答中的作用還未確定。神經氨酸酶在純化和儲存過程中很不穩定(MurphyandWebster，1990)，并且目前的流感疫苗中NA的含量還沒有標準化。純化的HA而不是NA疫苗可以防止受流感攻擊的動物免于得病(Johansson,等.，"純化的流感病毒血凝素和神經氨酸酶在刺激抗體反應中是等價的但誘導相反類型的對感染的免疫"，病毒學雜志，《3:1239-1246(1989))。一種基于神經氨酸酶抗原的實驗性疫苗在對人的試驗中未發現有保護作用(Orga等，傳染病雜志135:499_506(1997))。批準的流感疫苗由從兩種流感A亞型(H1N1和H3N2)和一種流感B亞型病毒得到的福爾馬林滅活的完整的或化學裂解的亞基制品組成。在每一流感季節之前，美國^^品和藥品局疫苗f口相關生物咨詢委員會為即將來臨的季節推薦一種三價流感疫苗的組合物。1992-疫苗含有A/Texas/36/91-like(H1N1),A/Beijing/353/89-like(H3N2),和B/Panama/45/90病毒。FDA建議1993-94流感疫苗應包括相同的Texas和Panama株，以及一種新的流感ABeijmg抹(A/Beijing/32/92)。在每年流感季節之前，對高危人群接種疫苗是降低流感影響的最有效的措施。目前使用的疫苗的局限性包括低使用率、對老年人和兒童的效果差、產自雞蛋、抗原性改變以及副作用。疾病防治中心(CDC)估計每年不到30%的流感易感個體接種了疫苗(MMWR，1992)。目前的滅活疫苗在疫苗的抗原和流行的流感病毒十分相近的情況下會對正常健康成年人產生高效的抗病保護性。在老年人中，對疾病的保護率要差得多，特別是對那些養老院中的老年人(Clements，1992)。在Powers和Belshe(傳染病雜志167:584-592(1993))的最近一項研究中，65歲或以上的受試者中不到30%觀察到對一種三價亞病毒粒子流感疫苗產生明顯抗體反應。流感A和B疫苗的種子病毒在雞蛋尿嚢腔復制成高效價的自然產生抹。另外，流感A成分的病毒抹是一種含有正確表面抗原基因的重配病毒。重配病毒是指由于病毒基因組的片段化而含有每一親本病毒抹特征的病毒。當不止一種流感病毒抹侵染細胞時，這些病毒片段混合，產生含有來自雙親的各種基因分配的子代病毒。使用目前完整的或割裂的流感疫苗的保護作用是短期的，并且隨著流行的流感病毒抹的抗原漂變其保護性會逐漸消失。流感病毒產生抗原性漂變是對血凝素分子中具有氨基酸序列改變的病毒進行免疫選擇的結果。理想狀態下，疫苗病毒抹與致病流感病毒抹相符。但是，目前流感疫苗的生產過程因將病毒在具胚的雞蛋中繁殖而受到限制。不是所有的流感病毒抹在雞蛋中都能纟艮好地復制；因此病毒必須適應化或構建病毒重配子。與最初從感染個體分離的生長于哺乳動物細胞的流感病毒相比，產于雞蛋的流感病毒的血凝素出現廣泛的異源性(Wang，等.，病毒學171:275-279(1989);Rajakumar,等.，美國科學院學報87:4154-4158(1990))。在流感疫苗的選4爭和生產過程中，HA的變化會產生具有抗原性明顯不同的病毒亞群的混合物。因此疫苗中的病毒會不同于流行株中的變種，'導致低于最佳水平的保護。有嚴重雞蛋過敏的人會對疫苗中殘留的雞蛋蛋白產生立即過敏反應。1976年的豬流感疫苗伴隨著Guillain-Barre綜合癥頻率的增加。還未發現隨后的從其它流感病毒抹制備的疫苗引起這一稀有疾病的發生。—種不需在雞蛋中繁殖的生產流感疫苗的方法會產生更純的及引起有害免疫反應的可能性更小的產品。另外，純的疫苗制備物不需要病毒滅活或病毒膜組分的有機提取，因此避免抗原表面的變性和由疫苗中殘留化學物引起的安全顧慮。另外，不需雞蛋繁殖生產的流感疫苗可以避免在雞蛋中適應和傳代引起的遺傳異質性。這樣會得到與流感病毒流行抹更匹配的疫苗，產生更好的效果。因此提供一種不需在雞蛋中復制的生產流感疫苗的方法是本發明的一個目標。本發明的另一目的是提供一種迅速、花費有效、高度地生產流感疫苗的方法，它允許從流感的原始來源生產疫苗。本發明概述本發明提供了利用桿狀病毒表達系統在昆蟲細胞中經表達制備重組流感血凝素蛋白的方法。所得到的蛋白在制備基于從具有流行潛力的流感病毒克隆的重組血凝素抗原混合物的多價流感疫苗中是有用的。重組血凝素蛋白是全長的、未裂解的(HA0)糖蛋白，包含在非變性條件下純化至95%或以上，優選為99%純度的HA1和HA2亞單位(HAO)。還公開了一種利用特別設計的寡聚核苷酸探針和聚合酶鏈式反應(PCR)方法/人流感A和B病毒克隆流感血凝素基因的方法。在優逸的實施方案中，克隆的HA基因經刪除編碼天然疏水信號肽序列的核苷酸并代之以一條新的桿狀病毒信號肽進行^f務飾，產生一個編碼緊鄰血凝素的信號肽的序列。這種嵌合基因被引入桿狀病毒表達載體中，使得桿狀病毒多角體蛋白啟動子指導重組的HA蛋白在感染的昆蟲細胞中表達。18個氨基酸的桿狀病毒信號肽指導rHA的翻譯進入昆蟲細胞的糖基化途徑，而且它不存在于成熟的rHA津唐蛋白中。在優選的實施方案中，設計了一種在信號肽和血凝素蛋白之間不編碼任何間插氨基酸的載體。這種方法可以推廣到所有型的流感病毒，包括但不限于感染人類的流行性A(H1N1)亞型、A(H3N2)亞型和B型，以及感染其他哺乳動物和鳥類的流感病毒。公開了一種有效提取和純化產于昆蟲細胞的重組HA蛋白的一般方法用于純化來源于A亞型和B型流感病毒的rHA蛋白。重組疫苗可以從流感的原始來源形成，例如從受感染個體的鼻分泌物，而不用是從適應和培養于雞蛋的病毒形成。這使得可以直接從流行流感病毒抹快速形成疫苗，避免由病毒適應雞蛋培養而產生的問題以及病人對所產生的疫苗中的雞蛋污染物產生的反應。實施例證實了在含有從FDA為1993/1994和1994/1995流感流行季節推薦的三種流感病毒抹純化的rHA抗原的免疫劑量形式中疫苗的配方和臨床效果。利用定量結合流感血凝素、阻斷流感病毒凝集血紅細胞的能力或中和流感病毒的抗體的試-瞼，測量了功能免疫性。在對易受流感感染的動物中或在人類的攻擊實-驗中測量了rHA疫苗的保護性免疫應附圖的簡要描述圖1是從流感A抹由純化的病毒RNA制品克隆HA基因，表達的rHA的純化以及rHA的生物學特性的圖解。縮寫FDA,食品和藥品局；MDCK,MadinDarby狗腎；TPCK,甲苯磺酰笨丙氨酰氯甲酮；RNA,核糖核酸；cDNA，互補脫氧核糖核酸；HA,血凝素；FBS，胎牛血清；PCR,聚合酶鏈式反應；BV,桿狀病毒。圖2是將圖1的方法用于克隆和表達流感A/Texas/36/91抹的HA基因的更詳細的圖解。流感HA基因是從感染了流感A/Texas/36/91的MDCK細胞純化的RNA,利用逆轉錄酶和通用引物(SEQIDNO.1),接著經2輪PCR擴增和克隆獲得的。如圖所示，在第一輪PCR反應中，使用了5'末端引物SEQIDNO.2和3'末端引物SEQIDNO.3。在第二輪PCR反應中，使用了5'末端引物SEQIDNO.4和3'末端引物SEQIDNO.5。構建了一種桿狀病毒重組載體，該載體含有多角體蛋白啟動子和來源于桿狀病毒61K基因(分子量約為61,000的編碼信號肽的桿狀病毒基因)的信號肽序列，其后是完整的成熟HA蛋白的編碼序列。然后這一重組載體用于構建從本病毒抹產生HA的桿狀病毒表達栽體。圖3是小鼠在第42天的抗HA免疫應答的圖示，n=5,顯示了純rHA0-Fluzone⑧疫苗，rHA0鉛，在劑量為0.5^g(黑條帶)，O.lpg(陰影條帶)，0.02pg(點條帶)，0.004ng(空白帶)時的抗體滴度。圖4a、4b和4c是用rHA或批準的三價疫苗，1994-1995配方免疫的小鼠抗HA的免疫應答，接種疫苗后的星期數對HAIA/Texas/36/91(圖4a)，HAIA/Shangdong/9/93(圖4b),HAIB/Panama/45/90(圖4c),rHA(菱形)和培養于雞蛋的FLUVIRON⑧減毒疫苗(方塊)的HIA滴度。本發明的詳細描述描述制備重組流感疫苗的方法。利用培養的昆蟲細胞中的桿狀病毒表達載體生產從流感病毒得到的全長的、未被切割的(HAO)血凝素抗原，并在非變性條件下純化。將A^流感A和/或流感B抹純化得到的兩個或更多個血凝素抗原混合起來，產生多價流感疫苗。重組抗原可與一種輔助載體組合以增強效力。9附圖的簡要描述利用重組DNA^L術生產流感疫苗具有幾個優點重組DNA流感疫苗能在更安全和更嚴格控制的條件下進行生產；不需在雞蛋中感染流感來繁殖；重組HA蛋白能被更高度純化，實際上消除了由污染蛋白引起的副作用；重組HA的純化過程不必包含病毒的滅活或有機提取病毒膜慮；利用重組DNA^支術生產HA避免了因在雞蛋中適應和傳代而產生的遺傳異源性，這會使疫苗更好地與流感流行抹相匹配，導致其效力增強；重組方法還允許在該年的稍后時期進行病毒抹選擇，使得有時間基于更可靠的流行病學數據進行選擇。桿狀病毒表達系統桿狀病毒是5acw/oWn^3e科的DNA病毒。已知這類病毒具有較狹窄的宿主范圍，主要局限于Lepid叩teran種的昆蟲(蝴蝶和蛾)。桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)已成為桿狀病毒的原型，可在培養的敏感昆蟲細胞中高效復制。AcNPV有一條雙鏈閉合環狀DNA基因，約130,000bp，其宿主范圍、分子生物學及遺傳學特性都已比較清楚。包括AcNPV的許多桿狀病毒在感染細胞的核內形成大的蛋白晶體包含體。一種稱為多角體蛋白的多肽約占這些包含體蛋白質量的95%。在AcNPV病毒基因組中多角體蛋白基因以單拷貝存在。因為角體蛋白基因對病毒在培養細胞中的復制不是必需的，它可以很容易地被修飾用來表達外源基因。外源基因序列插入AcNPV基因中多角體蛋白啟動子序列3'端，使它受到多角體蛋白啟動子的轉錄控制。利用桿狀病毒DNA和含有目的基因序列的嵌合質粒之間的同源重組構建表達外源基因的重組桿狀病毒。可以通過它們特殊的噬菌斑形態和噬斑純化成均一性的特征檢測出重組病毒。桿狀病毒特別適用于作為真核細胞克隆和表達載體。由它們的宿主范圍狹窄，只局限制于節肢動物的特性，因此通常是安全的。美國環境保護機構(EPA)已經同意使用三種桿狀病毒控制害蟲。.在EPA實驗使用許可下，AcNPV已被用于作物許多年。AcNPV野生型和重組病毒在各種昆蟲細胞，包括從秋季粘蟲iS^ocfo/^era/rag/peWa(Lepidoptera;Noctuidae)產生的連續細胞系中復制。S./rwgz;ea/a細胞的群.體倍增時間為18到24小時，可在單層或游離的懸浮培養液中繁殖。重纟且HA蛋白可在來自Lepidopteran種iS/70do/^en2/rwg/》e/^a的細月包中生產，但并不局限于此種細胞。其他可以被桿狀病毒感染的昆蟲細胞，3口從Bo/w6z'義won',Ga〃ename//awowa、7V/'c/2//ww.am或丄ama"/72naw種得到的細胞，也可用作生產重組HA蛋白的合適的底物。最優選的利用重組桿狀病毒生產蛋白的宿主細胞系是Sf900+。另一優選的利用重組桿狀病毒生產蛋白的宿主細胞系是Sf9。Sf900+和Sf9是,人4火季豐占蟲S/x^o^^ra/rt/gwerda(Lepidoptera;Noctuidae)產生的非轉化的、非致瘤的連續細胞系。Sf900+和Sf9細胞在28±2。C,不供應二氧化碳下繁殖。用于Sf9細胞的培養基是TNMFH,—種鹽、維生素、糖和氨基酸的簡單混合物，另加10。/。的胎牛血清。除了胎牛血清外，沒有其他動物衍生產品(即胰蛋白酶等)用于細胞繁殖。無血清的培養基(用作Sf900培養基，GibcoBRL,Gaithersburg,MD)也可用于培養Sf9細胞，且優選用于Sf900+細胞的繁殖。$f9細胞的群體倍增時間為18到24小時，可在單層或懸浮培養液中繁殖。還沒有報道顯示S./n^,/eWa細胞支持任何已知的哺乳動物病毒的復制。本領域的4支術人員可以理解此表達載體不只局限于桿狀病毒表達系統。重組HA蛋白也可在其他表達載體如昆蟲痘病毒(昆蟲的痘病毒)、質型多角體病毒(CPV)以及用重組HA基因或組成型表達基因轉化的昆蟲細胞中表達。流感病毒抹的分離可從被疾病感染的個體中分離出一種或多種流感病毒林。優選的是，流感病毒抹是被食品和藥物局(FDA)或CDC鑒定的在隨后的流感季節中有流行潛力的病毒抹。本文描述的方法的優點是臨床樣品如受流感感染病人的鼻分泌物可用作病毒的直接原料。另外，這些也可乂人FDA或CDC得到。流感病毒抹的繁殖然后將病毒4朱在細胞中繁殖生產高病毒滴度，如MadinDarby狗腎(MDCK)細胞(可從美國典型培養物保藏中心獲得，保藏號為ATCCCCL34)。例如，在甲笨磺酰笨丙氨酰氯甲酮(TPCK)部分滅活的胰蛋白酶和能產生最高首代傳代病毒滴度的最佳胎牛血清濃度的存在下，感染MDCK細胞。以根據標準HA分析(Rosen,"血凝素與動物病毒，，在《病毒學基礎技術》中編者K.Habel和N.P.Salzman,pp.276-28(學術出版社，紐約1969)，本文引用其教導)測定的低感染復數(0.1到0.5)用流感病毒抹感染MDCK細胞。被感染細胞在33'C培育48小時，利用血凝活性分析檢測培養基中的病毒產量。能產生最高HA活性的條件被以后用來制備大批量流感病毒。病毒的純化用已知的純化方法，如蔗糖密度梯度離心法，從培養基中純化從第一代產生的病毒顆粒。例如，在感染24到48小時后，離心流感感染的MDCK細胞的離心培養基收獲病毒。將所得的病毒沉淀重懸于緩沖液中，并通過蔗糖梯度緩沖液離心。在梯度的40-45%蔗糖區收獲流感病毒帶，用緩沖液稀釋，經過在100,000xg下離心沉淀。用緩沖液重懸純化的病毒沉淀，-7(TC保存。流感血凝素基因的克隆圖1顯示了克隆HA基因方法的概要。基本上，用要克隆的流感病毒抹感染細胞。從細胞培養基中收獲病毒，分離出病毒RNA(對流感A抹)或mRNA(對流感B抹)。乂人純化的病毒顆粒中提取病毒RNA(_RNA),用標準程序在甲醛瓊脂糖凝膠上分析。對流感A抹病毒RNA用通用引物系統，或對流感B抹mRNA用隨機引物合成cDNA。用對所有流感A和B病毒血凝素RNA片^a都是同源的通用寡聚核苷酸引物(5'-AGCAAAAGCAGG-3'(SEQIDNO.1))合成正標準互補DNA(cDNA)(Davis等.，"含流感病毒WSN抹血凝素基因(HON1)的細菌克隆的構建和鑒定"基因，10:205-218(1980))。設計出與流感血凝素基因5'和3'端保守區同源的引物。在5'和3'引物末端都含有血凝素基因內未發現的限制性酶切位點。將合適的流感A或B引物和流感cDNA混合，用標準PCR程序擴增血凝素基因片段，所得的雙鏈DNA片段含有完整的編碼成熟血凝素的序列。用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增總HA基因，然后克隆到合適的細菌宿主如E丄'o/z中。測定5'端序列以鑒定HA基因的信號肽，然后用PCR擴增不含信號肽的HA基因。其后將其亞克隆到含AcNPV多角體蛋白啟動子的質粒轉移載體中。所得的轉移栽體含有以下5'->3'序列，來自桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾NPV的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，61K的桿狀病毒信號肽，成熟血;疑素的編碼序列，天然血凝素翻譯終止密碼子，多角體蛋白RNA聚腺苷酸化信號，及側翼桿狀病毒DNA。然后將含克隆的血凝素基因的純化的嵌合轉移質粒DNA與AcNPV野生型DNA混合，與鉤共沉淀，轉染進S./h^;;eMa細胞根據噬菌斑形態逸擇重組桿狀病毒，用附加的幾輪噬菌斑純化進行進一步純化。克隆的重組桿狀病毒進行血凝素表達篩選，其中一個桿狀病毒血凝素表達載體被選出生產主病毒庫。流感病毒A抹從純化的病毒RNA制品中克隆出來自流感病毒A抹的HA基因。從含有1,000-2,000血凝素單位(HAU)的100-200微升純化的流感A病毒顆粒中提取病毒RNA。1HAU是在標準凝集分析中能凝集50%血紅細胞的病毒量(Rosen,1969),用蛋白激酶K處理病毒顆粒以消化蛋白，然后用等體積苯酚和氯仿抽提病毒RNA，在tRNA載體的存在下用乙醇沉淀。重懸病毒RNA于緩沖液中，用不含RNA酶的DNA酶消化去除污染DNA，然后重復l是取和沉淀步驟。如Maniatis,等.,分子克隆實驗手冊.pp.86-96和366-367所述(冷泉港實驗室，冷泉港，紐約1982),用甲醛瓊脂糖凝膠分析病毒RNA(vRNA)。流感病毒B抹:從被流感病毒B抹感染的細胞中提取的總信使RNA(mRNA)中克隆出來自流感病毒B株的HA基因。然后從感染細胞中提取總RNA。在硫氰酸胍的存在下裂解收獲細胞，純化細胞總RNA，如用PharmaciaBiotechInc.(Piscataway,NJ)的RNA纟是取試劑盒。用寡聚(dT)-纖維素旋轉柱從細月包RNA中才是取總mRNA,如用PharmaciaBiotechInc.(Piscataway，NJ)的mRNA純化試劑盒。昆蟲細胞中重組血凝素的表達和加工重組血凝素抗原在被AcNPV-血凝素載體感染的S./n^gz;^ra^細胞中高水平地表達。最初的基因產物是未加工的、全長血凝素(rHA0)，它并不分泌，只是附著在感染細胞的外周膜上。重組HA0是分子量為68,000的蛋白，具N-連接的糖基化，其聚糖為高甘露糖型，不同于在哺乳動物和鳥類細胞中病毒蛋白表達產生的聚糖。有證據顯示rHAO在翻譯后形成三聚體，聚焦在細胞質膜上。HAO和其他蛋白的表達載體HAO是一更好的疫苗，因為它比HAI/HA2復合物的穩定性更好，并在純化和保存的過程中能保持正確折疊。這一優良的穩定性在B型病毒抹中表現得特別明顯，這使其滴度比從商業獲得的減毒B病毒抹高出約5倍。如下面實施例中所述，當用限制性酶切位點將HA基因克隆到pMGS12時，HA成熟信號肽被去除，代之以桿狀病毒幾丁質酶信號肽，即61kD信號肽。由于HA基因與幾丁質酶信號肽通過切割位點連接，因此根據所選限制性位點的不同，成熟HAO蛋白和61kD信號肽之間有3到5個氨基酸。盡管對流感病毒A林沒有問題，但B株表達的帶有添加的幾個氨基酸的HAO不能正確折疊。已有兩種方法克服這一問題。第一種是使用另一種新載體pMGS3，它不編碼61kD信號肽。將具有原始信號肽的HAO克隆到這個載體上，然后表達。當用SDS-PAGE鑒定時，用此載體表達的B抹HAO顯示出比在pMGS12上表達時更好的糖基化和加工。HAO折疊得很好，能從數量上轉化成HA1/HA2。遺憾的是根據Western印跡檢測，其產量不高。第二種方法利用pMGS12的61kD信號肽指導不用限制性酶插入的HA基因的表達增加了產量。這一新載體包含61kD信號肽和HAO基因，不含編碼外來插入氨基酸的序列，被稱為pMGS27。pMGS27可被用來在桿狀病毒表達系統中克隆和表達任何基因。目的基因不是通過限制性酶切和連接克隆到載體上，而是通過退火克隆到載體上。試劑是從Clontech在其PCR-指導克隆體系中得到的。pMGS27被設計成可在幾丁質酶信號肽編碼區末端線性化，用T4DNA聚合酶加dATP處理線性化的pMGS27,形成兩條長單鏈尾部。以一對設計成產生用T4DNA聚合酶和dTTP處理PCR片段后與處理的pMGS27的尾部互補的單鏈尾部的寡核苦酸，用聚合酶鏈式反應("PCR")或反轉錄-PCR("RT-PCR")擴增目的基因。然后簡單的退火可將兩分子結合為適于轉化宿主的環狀質粒。除了比傳統限制性酶切-連接法將HA基因克隆到pMGS12更迅速和簡單外，pMGS27還具有重要的優點，它不產生由幾丁質酶信號肽和成熟HA蛋白之間產生的限制性酶切位點編碼的多余的氨基酸。這些多余氨基酸有時會帶來一些困難，使信號肽酶不能切除信號肽，或象在B抹HA中那樣，所編碼的蛋白不能正確折疊。重組HA0的純化感染幾天后，可以用非變性、非離子去垢劑或其他本領域技術人員已知的用于從昆蟲細胞中純化重組蛋白的方法，包括但不限于親合或凝膠層析、抗體結合，從被AcNPV-血凝素感染的細胞的外周膜上選一斧提取rHA0。進一步用DEAE離子交換和knt止凝集素親合層析或其他本領在優選的實施方案中，使用更溫和且從流感病毒B抹中得到更高產量的rHAO的方法純化rHAO。此方法大致如下用pH值為9.5到10.5的相對粘滯的堿溶液抽提細胞，從可溶性蛋白、外周膜蛋白和大部分DNA和RNA中分離形成昆蟲細胞膜內在部分的HAO蛋白。當含有濃度約為250mM的蔗糖時，粘度增加。以有效防止混合物中蛋白的二硫鍵形成的濃度。加入二硫鍵還原劑，如{3-巰基乙醇將細胞懸浮于提取緩沖液，勻漿，然后離心。在堿性pH(電導性一般小于ImS,pH10.5)下含二硫鍵還原劑的低離子強度緩沖液中經勻漿洗滌沉淀，然后離心。從含0.3到1.5。/。去垢劑如Triton，一定量的能有效阻止因電荷相互作用形成復合物的解凝聚劑，如堿性pH下(優選9.5)0.3到l.OM甜菜堿或pMim^的緩沖液的沉淀中提取HAO。然后用陰離子交換層析隨后用陽離子交換層析純化上清中的HAO。在用含約1/10濃度的去垢劑和二疏鍵還原劑的緩沖液平衡柱后，將HAO過陰離子柱，如DEAE或Q-Sepharose(—種帶季胺集團的瓊脂糖珠柱)，使用與提取相同的緩沖液，但是要用另外的緩沖液稀釋至少1:2。然后降低pH值到約為8.5,洗脫HAO。將洗脫的HAO使用基本相同的緩沖液過陽離子交換柱，降低pH到約7.4,洗脫雜質。增加鹽濃度到0.15MNaCl,洗脫HAO。這一優選的純化方法將在下面詳細4又述。含重組HA的膜碎片的制備。將表達重組HA的細胞(來自于0.34L培養物的6.2g細胞)以100mg/mL懸浮于水冷的100mM焦磷酸鈉，lOOmM氯化鈉，250mM蔗糖，0.1%(3-巰基乙醇，pH10.5的緩沖液中。用polytror^勻漿器(BrinkmanInstrumentsInc.,Westbury,NY)在4檔破碎細胞2分鐘。需用堿性勻漿介質以增加雜質蛋白的可溶性及膜制品的純度。勻漿液在9.200g下離心30分鐘。棄上清，收集沉淀。隨后用低離子強度緩沖液洗滌膜餾份制品。沉積重懸于初始體積的冰冷的0.1%P-巰基乙醇，皿中，用Polytror^勻漿器在4檔勻漿2分鐘。勻漿液在9.200g下離心30分鐘。棄上清，收集沉淀。這次低離子強度洗滌去除了外周膜蛋白的多佘部分。所得膜餾份制品明顯富集了重組HA,去除了污染的核酸。重組HA的提取。在不使抗原變性的條件下，從膜沉淀中選擇提取重組HA。在41mL水冷的10mM乙醇胺pH9.5,1%TritonN101,0.1%p-巰基乙醇，25mMNaCl，40mM甜菜堿中，用Polytron勻漿器在4檔勻漿膜沉淀2分鐘。在23。C培養40分鐘后，在9.200g下離心混合物30分鐘。將含重組HA的上清傾析，然后用相同緩沖液2倍稀釋。用SDS聚丙烯酰胺凝聚電泳分析蛋白。在2%十二烷基磺酸鈉(SDS)和5%p-巰基乙醇存在的條件下，在沸水浴中破壞樣品10分鐘。然后用含O.l%SDS的11%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，用考馬斯藍染色。層析純化。簡化重組HA的層析純化，使用LealiL凝集素瓊脂糖凝膠的昂貴的親合層析被一種兩步的層析純化過程所代替，此法能制備未變性的、適于作為用于人的流感疫苗組分的高純度重組HA抗原。所使用的層析凝膠基質是PharmaciaQ-SepharoseFastFlow和CM-SepharoseFastFlow。陰離子交換層析。所有層析都是在室溫下進行。將如上所述制備的含重組HA的才是取物以lmL/分過PharmaciaQ-SepharoseFastFlow⑧柱(C10/10Pharmacia柱中含5mL)，柱先用10mM乙醇胺pH9.5,0.1%TritonN101,0.01%p-巰基乙醇，25mMNaCl，400mM甜菜堿平衡。然后用平衡緩沖液洗滌柱至流出液的UV吸收降至基線。在這種條件下，重組HA結合在柱上，而雜質部分流出。然后用30mM二乙醇胺pH8.5,0.1%TritonN101,0.01%P-巰基乙醇，25mMNaCl,400mM甜菜^咸洗脫部分純化的重組HA。陽離子交換層析。用30mM二乙醇胺pH8.5,0.1%TritonN101,0.01%p-巰基乙醇，10mMNaCl，400mM甜菜堿兩倍稀釋Q-Sepharose洗脫液(23mL)。然后用35mL10mM磷酸鈉pH7.4,0.1%TritonN101,0.01%p-巰基乙醇，10mMNaCl,400mM甜菜堿洗柱。這種處理使雜質從柱中洗脫，而重組HA仍結合在CM瓊脂糖上。然后經過用lOmM磷酸鈉pH7.4,10mMNaCl洗柱至流出、液的UV吸收降至基線來除去去垢劑。用磷酸鹽緩沖液pH7.5(PBS)洗脫純化的重組HA。將純化的rHA0重懸于等滲的緩沖溶液中。去除去垢劑后，純化的rHA0能有效地凝集血紅細胞。重組HA0的結構和生物特性將rHA0純化至至少95%純度，優選為99%。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上其遷移主要為單一的分子量為68，000的多肽。用電子顯微鏡技術、胰蛋白酶抗性、密度沉積分析和凝集紅細胞能力檢測純化的重組HA0抗原的四級結構。這些數據顯示重組HAO形成三聚體，組裝成花結。純化的rHAO在去除去垢劑之前不能凝集細胞，這表明為了交聯雞血紅細胞，抗原必須形成復合物(花結結構)。純化的rHA0凝集細胞的定量能力可用來測量抗原的相對應的稠度。1血凝素單位被定義為在用雞血紅細胞做標準血凝素分析時，凝集50%時所需的抗原數量。比較數據表明，純化的rHAO抗原凝集血紅細胞的能力與用完整流感病毒顆粒觀察到的相當。重組HA0可在二硫鍵處被裂解，引起構象改變，形成兩條鏈HA1和HA2，如Carr,C.M.和Kim,P.S.,"流感血凝素構象改變的跳躍負荷機制，，，73:823-832(1993)所述，此文已編入本文的參考文獻中。在下文實施例6中對重組HA0的裂解有更詳細的描述。可以確信，天然HAO被裂解為HA1和HA2后，由于獲得與細胞融合的能力，而具有感染性，從而產生增強的免疫應答。抗原如流感血凝素的加工經過抗原肽與主要組織相容性(MHC)分子的結合進行。抗原/MHC復合物被T細月包識別，啟動免疫應答，SoHarding和Geuze的綜述所述，Cw/re"r(9p,m'ow,"(>〃S,o/og少5:596-605(1993)，此文已編入本文的參考文獻中。然而，作為完整的分子，在桿狀病毒中生產的rHAO是高度穩定的和有免疫原性的。對在昆蟲細胞中表達的HAO上的糖分子進行比較表明該聚糖與在哺乳動物或鳥類細胞中表達的HAO是不同的。融合蛋白的制備當第二蛋白的抗原性較低或具有引起對多種抗原的免疫應答的優點時，可制備HAO與此第二抗原蛋白融合的融合蛋白。一種優選的第二抗原的例子是流感病毒產生的神經氨酸酶。此抗原可由細胞、病毒、或細胞蛋白，或包括至少5到8個氨基酸的其抗原性部分組成。其他抗原包括乙型肝炎抗原、HIV抗原和癌胚抗原。本文所用的"免疫應答"是指用產生的針對抗原的抗體測量的體液應答，或用介導的針對抗原的應答的T細胞釋放測量的細胞應答。在一些情況下，可在HA和抗原之間插入無抗原性的氨基酸"接頭"，與HA相比進一步增加了抗原的抗原性。這一過程包含構建一種DNA質粒，用于使用寡聚核苷酸探針和聚合酶鏈式反應(PCR)方法，融合目的抗原基因和全長或部分流感病毒HA基因。經去除天然疏水信號肽序列并代之以新的桿狀病毒信號肽來修飾HA目的抗原融合基因使其在昆蟲細胞能正確表達。將融合基因插入桿狀病毒表達載體，使桿狀病毒多角體啟動子指導融合蛋白在感染的昆蟲細胞中的轉錄。18氨基酸的桿狀病毒信號肽指導HA目的抗原融合多肽的翻譯進入昆蟲細胞糖基化途徑，但其不存在于成熟的融合蛋白。例如，質粒pA9440包含存在于如下所述的桿狀病毒轉移質粒pMGS12中的A/Beijing/32/92抹HA基因，用它作為模板，使用提供者(GeneAmpPCRCloningKit,PerkinEhnerCetus)推薦的方案，用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增HA基因。PCR反應混合物(lOOpil)含有設計成使部分HA基因退火的20pmol引物。5'和3'引物末端設計有HA基因內部沒有的限制性核酸內切酶位點，HA0和HA1片段的5'PCR引物(O-567)開始于天然HA基因編碼序列5'端下游52堿基對。刪除天然信號肽序列，5'端緊接HA編碼序列插入一個位點。HA2片段的5'PCR引物(O-651)開始于天然HA基因1108核苷酸處，緊接在編碼精氨酸殘基的密碼子后，在HA0裂解為HA1和HA2時，此殘基被去除。HA0和HA2片段的3'PCR引物(O-680)設計成在緊接HA編碼序列后加入一個位點，去掉天然終止密碼子。HA1的3'PCR引物(0-679)截短了緊靠在HAO裂解時去除的精氨酸殘基之前的基因。HA基因片段的擴增進行30次循環，每次包含94'C下變性1分鐘。55。C下引物退火2分鐘，以及72。C下延長2分鐘。擴增后的HA基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳，用GeneClean試劑盒(Bio101,Inc.)從凝膠中純化，連接到設計成接受PCR擴增片段的質粒(pCRII;Invitrogen)上。這樣就得到分別含有HAO、HA1或HA2基因片段的質粒pB142、pB144和pB330。用Smal和《/"I限制性酶/人質粒pB142、pB144和pB330上切去HA基因片段，然后用標準重組DNA^支術(Sambrook等.，1989)亞克隆到AcNPV轉移質粒pMGS12上。pMGS12質粒從5'到3'包含AcNPV多角體啟動子，一個ATG起始密碼子，一個編碼來源于分子量為61,000的桿狀病毒糖蛋白(61K)的可切割信號肽的序列，Smal和f戶I限制性酶克隆位點，以及一個TAA通用終止密碼子序列。這些調節區域側翼是AcNPV基因組的EcoRII片段的DNA(Summers和Smith,"桿狀病毒載體和昆蟲細胞培養程序的方法手冊，，，得克薩斯農業實驗站公告號，1555(1987))。用Sw"I和A:/"I切除pCEIL克隆載體的克隆的HAPCR片段，用瓊脂糖凝膠電泳和GeneClean試劑盒純化，并連接到同樣用S/""I和A^"I消化的pMGS12上。所得AcNPV轉移質粒pB879、pB1201和pB1205分別含有編碼HAO、HA1或HA2的區域。這些區域與來自于61K基因的可裂解的桿狀病毒信號肽和多角體啟動子在閱讀框內相連。AcNPV轉移質粒pB879、pB1201和pB1205可用來將HAO、HA1或HA2與任何感興趣的基因融合。構建HA-CEA融合基因轉移質粒的第二步是將CEA編碼序列插入到HA編碼結構中。在質粒pA9080PCR擴增時，在CEA基因兩端加入5"ma/和的限制性內切酶識另'j/切除位點。5'PCR引物，O-649,起始于離基因5'端82堿基對處，刪除了原始CEA信號肽序列。3'PCR引物、O-650,設計成刪除了編碼C-末端區域疏水序列的該基因3'端最后72個堿基對。CEA基因片段的擴增進行30次循環，每次包含94。C下變性1分鐘，55°C下退火2分鐘，以及72°C下延長2分鐘。所得的擴增的CEA基因片段進行瓊脂糖凝膠電泳，用GeneClean方法純化，按照生產廠家的使用說明，連接到pCRII(Invitrogen)上。所得質粒，pB806，包含CEA基因，此基因不含原始信號肽、C-末端疏水域或終止密碼子，但在該基因兩端都含有和A>I位點。大量制備質粒pB806，用5Vw"I或AT/"I消化DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和GeneClean試劑盒純化CEA編碼片l爻，然后將純化片ll連接到每個用相同限制性酶切過的編碼HA構建體(pB879、pB1201或pB1205)中。例如，將具有Smal酶切末端的CEA編碼片段分別與用Smal酶切的HA0-、HAl-和HA2-編碼構建體(pB879、pB1201和pB1205)連接，分別得到質粒pB1250、pB1555和pB1584。將具有《pml酶切末端的CEA編碼片段與用酶切的HAO-、HA1和HA2編碼構建體連接，得到質粒pB1264、pB1564和pB1593。在Smal位點插入CEA基因，使CEA編碼序列位于HA編碼序列的下游。對所有的構建體，設計PCR引物時使CEA泉因鳥HA插入閱讀框內，融合基因的翻譯將終止在KpnI位點下游pMGS12載體序列的通用翻譯終止信號處(TAATTAATTAA)(序列號No.4)。這種構建體可以通過刪除在如下所述的信號肽和HAO之間或HAO和融合基因之間的間插氨基酸得到改善以提高折疊和免疫原性。疫苗的制備和包裝利用流感疫苗領域技術人員所知的方法和材料，可將rHA單獨或與其他流感抗原一起進行制備和包裝。在優逸的實施方案中，將來自兩種A抹和一種B抹的HA蛋白結合組成一種多價疫苗。在特別優選的實施方案中，以有效提高對HA蛋白的免疫應答的量，將這些HA與一種佐劑結合。目前，廣泛用于人的唯一佐劑是釩(磷酸鋁或氫氧化鋁)。用于研究及獸醫應用的皂苷及它的純化組分QmiA_，Freund's完全左劑和其他左劑因為其毒性限制了它們在人類疫苗中的有效應用。但是，一些在化學上新限定的制品也應該是有用的，例如胞壁酰二肽、單褲酰脂A、如本文參考文獻包括的Goodman-Smtkoff等，免疫學雜志147:410-415(1991)所述的磷脂偶聯物、如本文參考文獻包括的Miller等，實驗方法雜志176:H39-H44(1992)所述的包含于蛋白脂質體內的蛋白膠嚢、包含在脂微嚢如NovasomeTM脂微嚢(MicroVescularSystems,Inc.,Nashua,NH)的蛋白月交嚢。在優選的實施方案中，疫苗以單劑量包裝用于非腸道(即肌肉內、皮內或皮下)用藥或鼻咽(即，鼻內)用藥免疫。如在隨后的實施例中所述確定了有效的劑量。載體一般為水或緩沖鹽水，含或不含防腐劑。可^i夸抗原凍干，月1用時重懸，或制成溶液。載體還可使用高分子緩釋系統。在制備可有效控制抗原釋放的疫苗時，合成高分子特別有用。一個較早的例子是據Kreuter,J.報道(MicrocapsulesandNanoparticlesinMedicineandPharmacology.M.Donbrow(Ed).CRCPress,p.125-148)的將甲基異丁烯酸聚合成直徑小于l微米的小球，稱為納球。對流感病毒感染的抗體反應及保護明顯比服用結合有氬氧化鋁的抗原要好。用其他微粒所做的實驗證明，這些高分子的輔助作用效果與微粒的大小和疏水性有關。微膠嚢已被用于微嚢包含的藥物的注射，使藥物受控釋放。許多因素影響微膠嚢高分子的選擇。合成髙分子的再生性和微膠嚢化過程，微膠嚢原料和生產過程的費用，毒性分布，各種釋放的動力學要求，以及高分子與抗原的物理化學相容性都是需要考慮的因素。有用的高分子的例子有聚碳酸酯、聚脂、聚氨基甲酸乙酯、polyorthoesters和聚酰胺,特別是那些可被生物降解的。藥物經常使用的、最近被用于抗原的載體是聚(d,l-Iactide-co-glycolide)(PLGA)。這是一種可生物降解的聚脂，長期以來被醫學上用來進行可降解性縫合、骨托架和其他臨時性修復、未表現出任何毒性。許多藥物包括肽和抗原配制進PLGA微膠嚢中。有關PLGA用于抗原的可控釋放改變的數據已有所積累，如Eldridge,J.H.,等的綜述CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,1989,146:59-66。口月良時，將抗原包于直徑為l到10微米的PLGA的微球內，具有明顯的輔助作用。PLGA微膠嚢化經過一個油包水乳化分離階段。將目的復合物制成水溶液。PLGA則溶于合適的有機溶劑如亞甲基氯和乙酸乙酯。這兩種不互溶的溶液在高速旋轉下共乳化。然后加入此高分子的非溶劑，使包裹在水滴周圍的高分子沉淀，形成胚肽形微膠嚢。收集微膠嚢，用一類試劑(聚乙烯醇(PVA),明膠，藻酸鹽，聚乙烯吡咯烷酮(PVP),甲基纖維素)之一使其穩定，經真空干燥或抽提去除溶劑。參考以下非限制性的實施例可對本發明有進一步的了解。實施例l:流感病毒的繁殖和純化從雞蛋尿嚢液的FDA中獲得以下流感疫苗林A/Beijing/353/89-like(H3N2)A/Beijmg/32/92-like(H3N2)A/Texas/36/91陽like(H1N1)B/Panama/45/90為繁殖從FDA得到的流感病毒原種，在TPCK處理的胰蛋白酶(SigmaChemicalCo.,StLouis,MO)和能獲得最大滴度第一代病毒的最適濃度的胎牛血清的存在下，感染MDCK細胞。依據標準HA分析實驗(Rosen,"用動物病毒的血細胞凝集作用"，在《病毒學基礎技術》，編者K.Habd和N.P.Salzman,pp.276-28(學術出版社，紐約1969)),用流感病毒株以低感染復數(0.1到0.5)感染MDCK細胞。被感染的細胞在33。C下培養48小時，用血細胞凝集反應活性分析法測量培養基中的病毒產量。產生最高HA活性的條件被用來制備大量流感病毒。對以上流感病毒的最適TPCK胰蛋白酶和胎牛血清濃度列于表1。表l.最適TPCK胰蛋白酶和胎牛血清濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>流感病毒的純化感染24-48小時后，經澄清流感感染的MDCK細胞的培養基(1,000xg，10分鐘)從10T175組織培養瓶中收獲病毒。IOO，OOOxg離心i小時，從培養基中沉淀病毒。所得病毒沉淀重懸于lmlpH7.4的褲酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在20ml20-60%(w/v)PBS蔗糖梯度中離心。在40-45%蔗糖梯度區收獲流感病毒帶，用PBS稀釋，100,000xg沉淀。純化的病毒沉淀重懸于0.5mlPBS,-70。C下保存。實施例2:流感病毒A/Texas/36/91HA基因的克隆圖2顯示了一個流感病毒HA基因的克隆步驟的具體實施例。如上所述提取從CDC得到的流感A/Texas/36/91病毒RNA。使用與流感RNA片段3'端5'-AGCAAAAGCAGG-3'(SEQIDNO,1)互補的通用引物，用Moloney鼠白血病病毒(M-MuLV)逆轉錄酶合成流感cDNAs。用PharmaciaInc.提供的首鏈cDNA合成試劑盒中的M-MuLV逆轉錄酶，以純化的病毒RNA或mRNA(5pg)為模板，合成cDNA。用于來自流感病毒A抹病毒RNA的cDNA的引物是合成的寡聚核苷酸引物(5'-AGCAAAAGCAGG-3')(SEQIDNO.1),它同所有病毒顆粒HA基因片段3'末端同源。用聚合酶鏈式反應(PCR)在標準反應條件下(GeneAmpkits;Cetus/PerkinElmer,Norwalk,CT)，從cDNA擴增HA基因。PCR反應混合物(100)^1)含有20pmol引物，根據表2所示從GeneBankDNA數據資料查到的共有序列確定該引物對流感病毒A(H3)或A(HI)或流感B抹HA基因5'和3'末端具有特異性。擴增進行30次循環，每次包含94。C下變性1分鐘，55。C下引物退火2分鐘，以及72'C下延長2分鐘。PCR產物在克隆前進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以確定其正確大小。在PCR中使用HA基因5'端PCR引物5'-GGGGGTACCCCCGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAA-3'(SEQIDNO.2)及HA基因3'端引物5'-GAAACGTCACGTCTTATACG/TTAG/TACTCCATGGCCC-3'(SEQIDNO.3)，產生全長的HA基因。從基因5'端設計一種新的5'PCR引物無信號序列5'端5'-GGGGGTACCCCCGGGGACACAATATGTATAGGCTACCAT-3'(SEQIDNO.4)及基因的3'端5'—GAAACGTCACGTCTTATACG/TTAG/TACTCCATGGCCC-3'(SEQIDNO.5)。在PCR中使用這些引物產生無信號肽序列的HA基因。然后將其插入用《p"/酶切的TA載體中。然后將用于桿狀病毒表達的61K信號肽和多角體蛋白啟動子插入舍無流感病毒信號肽序列的HA基因的TA栽體中。所得桿狀病毒重組載體含有多角體蛋白啟動子，61K桿狀病毒信號肽和流感病毒A/Texas/36/91的HA基因。從被流感病毒B抹B/Panama/45/90感染的MOCK細胞中提取總信使RNA(mRNA),從中克隆來自流感病毒B抹的HA基因。從5瓶TH5培養瓶被感染的細胞中制備總RNA。在石克氰酸胍的存在下，裂解收獲的細胞，如上所述純化總細胞RNA。如上所述，用寡聚(dT)纖維素旋轉柱從細胞RNA中^是取總mRNA。用于來自流感病毒B抹的mRNA的引物是隨機寡聚核苷酸DNA引物(Pharmacia,Inc.)。表2.PCR擴增使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>有一例cNDA合成產物使用流感病毒A/Texas/36/91病毒RNA為模板。編碼流感病毒蛋白的cDNA片^:的位置可用以下步驟確定。將純化的病毒RNA與通用單鏈DNA引物5'-AGCAAAAGCAGG-3'(SEQIDNO.1)在反應混合液中結合。如上所述，這一引物與流感病毒顆粒片段的3'端互補。反應還包括加入[a-^P]dCTP,以觀察在1.5%堿水解凝膠(Maniatis,etal.,1982)上分離的cDNA產物，并曝光到X-OMAT-A膜上。實施例3:克隆HA基因到細菌質粒上用TA克隆系統(Invitrogen,Inc.)將PCR擴增的rHA基因克隆到pUC-類質粒載體上。經過用限制性酶切分析經標準方法(Mamatis,等.，1982)純化的質粒DNA,i正實HA基因的存在。然后對rHA基因的5'端進行DNA序列分析，設計出去除了編碼HA蛋白N末端疏氷信號肽序列的新引物。然后用表2中所列的特異性5'和3'寡聚核苷酸引物對cDNA產物進行PCR擴增，并用標準克隆方法克隆到co"TA質粒載體(Invitrogen，Inc.)上。所得DNA克隆包含編碼成熟HA的序列。用標準方法(Maniatis等.，1982)將來自A/Texas/36/91,A/Beijing/353/89，A/Beijmg/32/92和B/Panama/45/90的rHA基因亞克隆到桿狀病毒表達載體中。用適當的限制性酶將HA基因從TA克隆質粒切除，純化的HADNA片段被插入桿狀病毒重組質粒中。所得細菌克隆用氨芐青霉素抗性篩選，然后用限制性酶切，釋放插入的HA基因，以確定其存在。用氯化銫-溴化乙錠梯度法(.Maniatis,等.，1982)純化含有HA基因的重組質粒。對質粒5'端進行測序，以確定存在正確的桿狀病毒信號(AcNPV多角體蛋白啟動子，ATG翻"^起始信號和桿狀病毒信號肽序列)以及HA編碼序列位于正確的讀碼框內。HA基因5'端DNA序列和側翼AcNPV多角體蛋白啟動子及桿狀病毒信號肽(每個氨基酸序列的前18個氨基酸殘基)列于序列表中。，SEQIDNO.6編碼A/Beijing/32/92的HA基因5'端序列(序列范圍1-481)。SEQIDNO.7是相應氨基酸序列(從SEQIDNO.6的起始密碼子"ATG"[核苦酸21]開始)。61K信號肽的氨基酸序列見SEQIDNO.7的1-18個氨基酸。SEQIDNO.8編碼A/Texas/36/91的HA基因5'端序列(序列范圍1-481)。SEQIDNO.9是相應氨基酸序列(從SEQIDNO.8的起始密碼子"ATG"[核苷酸21]開始)61K信號肽的氨基酸序列見SEQIDNO.9的1-18個氨基酸。SEQIDNO.10編碼B/Pa醒a/45/90的HA基因5'端序列(序列范圍1-434)。SEQIDNO.11是相應氨基酸序列(從SEQIDNO.10的起始密碼子"ATG"[核苷酸21]開始)。61K信號肽的氨基酸序列見SEQIDNO.11的1-18個氨基酸。在SEQIDNos6，8和10中，核苷酸1-20是多角體蛋白啟動子3'端，核苷酸21-74編碼61K信號肽，核苷酸75以后編碼HA基因的5'—山^^1^。實施例4:重組HA在昆蟲細胞中的表達純化含有克隆HA基因的嵌合重組質粒，取2/ig與l貼AcNPV野生型DNA混合。^!尋NDA與4丐共沉淀，用標準方法(Smith，Summers和Fraser,分子和細胞生物學3:2156-2165(1983))轉染進5.//'"g/;^ra^細胞。通過噬菌斑形態鑒別重組桿狀病毒，然后再用幾次噬菌斑純化法進一步純化。篩選表達rHA的經謹菌斑純化的重組桿狀病毒，選出一個桿狀病毒表達載體，進行進一步的實驗。用含有來自流感病毒抹B/Panama/45/90的HA基因的桿狀病毒載體感染6:/h^^e^"細胞。感染24、48和72小時后，用25(aCi[32S]甲硫氨酸脈沖1x106細胞，標記合成的蛋白。收集細胞，在有O.l%SDS的11%聚丙烯酰膠凝膠上分離蛋白。在X-OMAT-AR膜上曝光，檢測被放射性標記的蛋白。蛋白標準位置及其大小(千道爾頓kd)顯示，在感染48和72小時后，85kd重組HA蛋白是細胞合成的主要蛋白之實施例5:重組HA的制備和純化桿狀病毒表達載體A8611含有流感病毒A/Beijing/353/89的基因，其制備基本類似于如上所述在多角體蛋白啟動子控制下A/Beijing/32/92血凝素的制備。用它感染S./n^zpera^細胞。在加有10。/。胎牛血清的TNMFH培養基中(GibcoBRL,Ga他ersburg,MD),于27。C培養細胞至濃度為1x1(/'細胞/mL,用A86U重組桿狀病毒感染，感染復數(MOI)為1。感染期間，在桿狀病毒多角體蛋白啟動子的轉錄控制下，產生流感病毒A/Beijing/353/89血凝素。感染72小時后，3,400xg離心15分鐘，收獲細胞，在無血清的TNMFH培養基中重懸清洗，然后在10,400xg下離心30分鐘。棄上清，于-7(KC保存感染的細胞沉淀。已形成了一種在不使抗原變性的條件下，從感染細胞中選擇提取重組HA的方法。除非注明，所有提取過程都在4。C進行。將從OJL培養液中得到的細胞沉淀(約5xio8細胞)在40mL水冷的30mMTns-HC1,pH8.4,25mMLiCl，1%(V/V)Tween-20,lmg/mL亮抑蛋白酶肽中，使用PolytronTM勻漿器(BrinkmannInstrumentsInc.Wesbury,NY)破裂2分鐘。勻漿液在9,200xg下離心30分鐘。棄上清，收集沉淀。進一步從昆蟲細胞中去除了可溶性和膜周邊蛋白，而保留了如rHA的膜內在蛋白。為提取rHA,將沉淀在40mL水冷的30mMTris，lOmM乙醇胺，pHl1,25mMLiCl，2%Tween-20中以4檔勻漿2分鐘。水浴60分鐘后，用INHCl調勻漿液pH至8.4,9,200xg離心30分鐘，去除不溶性物質。傾析含有可溶性rHA的上清液，測pH,如果需要，在室溫下調pH至8.4。重懸不溶物于40mL水中，進行分析。HA膜內在蛋白在高pH、含Tween-20去垢劑的條件下溶解，在pH降低時保持溶解狀態。蛋白經SDS聚丙烯酰胺凝月交電泳分析。在2%十二烷基磺酸鈉(SDS)及5%(3-巰基乙醇的存在下，用沸水浴破裂樣品IO分鐘，然后在含O.l%SDS的11%聚丙烯酰胺;疑膠上電泳，再用考馬斯藍染色。已形成了一種層析純化方法，用來純化重組HA，可得到高純的、未變性的、適于作為人使用的流感疫苗組^f分的重組HA抗原。用以下方法從被重組病毒A8611感染的S./n/g,;pe^to細胞中純化A/Beijin/353/89的HA。用于從0.5L被感染的51./wg^e^a細胞中純化HA的層析凝膠介質是30mLPharmaciaDEAESepharoseFastFlow(于PharmaciaC16/20柱)和4mLPharmaciaLentil凝集素瓊脂糖4B(于PharmaciaCI0/10柱)。把DEAE柱的流出口與L^Qi丄凝集素柱的流入口相連，將如上所述制備的S/N2細胞才是取液過柱,流速為lmL/分鐘。用30mMTns-HC1,pH8.4,25mMLiCl,0.5%Tween-20洗脫，至LenliL凝集素柱流出液的280nm處UV吸收降到基線。在此條件下，大部分雜質蛋白與DEAE結合，而重組HA流過柱子。殘留的雜質經過凝集素柱，糖基化的rHA結合于LeniiL凝集素親合介質上。拆掉DEAE柱，用另40mL30mMTris-HC1，pH8.4,25mMLiCl，0.5%Tween-20洗凝集素柱。然后用40mL30mMTns-HC1,pH8.4，25mMLiCl，0.4%(V/V)脫氧膽酸鈉(DOC)洗柱。這一步用另一種去垢劑如DOC替代Tween-20去垢劑，DOC可通過透析/人蛋白上去除。然后用約20mL到40mL含0.3Ma-D-甲基甘露糖苦的30mMTris-HC1，pH8.4,25mMLiCl，0.4%(V/V)脫氧膽酸鈉洗脫重組HA。洗脫液用11%PAGE分析。由于流感病毒HA蛋白的遺傳多樣性，對每一種特殊的重組HA蛋白，以上的純化方法的細節可進《亍變化。例如，rHA可能結合在DEAE離子交換柱上，而并不流出。如果發生這種情況，應該用含更高濃度的LiCl、NaCl或其他鹽的緩沖液洗柱，從DEAE柱上分離rHA。為了除去DOC去垢劑和其他緩沖液組分，含有純化的rHA的凝集素柱的洗脫液在磷酸緩沖鹽水pH7.5(PBS)中透析。在SDS聚丙烯酰胺凝膠上分析，純化的重組HA的純度至少為95%。實施例6:rHA蛋白酶抗性分析成熟HA組裝成三聚體結構，抗多種能降解HA單體的蛋白酶，包括胰蛋白酶(Murphy和Webster，1990)。因此對胰蛋白酶的抗性可用來進行活性三聚體形成分析。以下方法被用來研究rHA對蛋白酶處理的抗性。將兩份在30mMTris-HC1，pH8.4,150mMNaCl中的純化的60|ug/mLrHA(A/Beijing/353/89)，在含有和不含50ng/mLTPCK處理的胰蛋白酶的條件下置于水上培養30分鐘。加入57.4mM苯甲基磺酰氟的異丙醇溶液至終濃度為lmM來終止反應。在3%SDS還原條件下，沸騰滅活每一份樣品，在11.5%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并用標準Western印跡法轉移至硝酸纖維素濾膜上。用針對純化的rHA制備的豚鼠抗HA血清及羊抗豚鼠IgG堿性磷酸酶偶聯物檢測HA多肽。未處理的rHA以HA前體(HA0)的大小遷移。蛋白酶處理出現兩條主要的帶，以預測的流感病毒凝集素HA1和HA2的大小遷移。結果顯示，胰蛋白酶裂解rHA蛋白一次，產生兩條預測為HA1和HA2大小的多肽。沒有進一步的蛋白裂解加工發生。這些結果證明用以上方法純化的HA抗蛋白酶降解。這一特性與純化的rHA以三聚體形式存在相符。實施例7:用標準小鼠效價分析rHA免疫原性一種測量抗原免疫原性的方法是測量引起小鼠可檢測的抗體反應所需的量(小鼠效價分析)。用標準小鼠效價分析測量rHAO疫苗的免疫原性。用含系列稀釋的rHA,即0.500j^g，O.lpg,0.02)ig和0.004^ig純化的rHA的疫苗對幾組小鼠免疫一次，每組含5-IO只小鼠。免疫28天后收集血清，在96孔微量盤中用標準酶聯免疫固相測定(ELISA)測量抗rHA抗原的抗體。如果28天抗血清1:100稀釋液的OD450大于小鼠免疫前血清OD450平均值三倍標準偏差，則小鼠有血清轉變。導致50%小鼠血清轉變所需的疫苗有效劑量(ED5。)是抗原免疫原性的一項測量指標。例如，四組小鼠，每組含10只小鼠，用0.1pg，0.02fig,0.004貼或0.0008pig(5倍稀釋)rHA0疫苗免疫一次。免疫28天后收集血清，對疫苗中的每一種rHA0抗原，用ELISA測量血清轉變。計算50%小鼠血清轉變所需的劑量(ED5Q)，建立了每一種rHA0抗原的最小ED50。最初的數據表明，單劑量0.O04^grHA0能使至少50%小鼠血清轉變。實施例8:與佐劑結合的rHA的服用及其與已有流感疫苗的比較用鋁或不用鋁(純凈的)測量從流感病毒A/Beijing/353/89純化的rHA的小鼠效價，并與含有流感病毒A/Beijign/353/89株的商業流感疫苗，FLUZONE(ConnaughtLaboratories，In6.Swiftwater,PA)比豐支。疫苗以0.5iug，CU^g,0.02pg和0.004ng的齊'J量月良用。在28天時用如上所述純化的rHA劑量加強免疫小鼠。42天時收集血清，用ELISA測定IgG抗HA抗體的滴度。結果列于圖3。無佐劑時，只有0.5^g的劑量產生明顯的抗體滴度(200,000)。有佐劑時，0.004(agrHA0的小劑量就可產生明顯的抗體。用rHA(純凈的)免疫的動物產生與商業疫苗大致相同水平的抗HA抗體。鋁增加了rHA的免疫原性，所產生的抗HA抗體滴度是不用佐劑的10倍或更高。總之，將純化的rHA0的免疫原性與一種流感完整病毒顆粒疫苗(FLUZONE,ConnaughtLaboratories,Inc.,Swiftwater,PA)進行比較，證明rHA0在42天期間使小鼠產生類似的免疫應答。用實施例7中所述方法檢測，鋁輔助的rHA0吸收能明顯增加純化的rHAO對小鼠的免疫原性。與鋁的結合使得IgG血凝素抗體高于Flllzone流感疫苗。實施例9:血凝抑制研究血凝抑制(HAI)抗體結合于血凝素的四個已知表位中的三個，阻止流感病毒凝集血紅細胞的能力(Wilson等.，"在3A分辨率下流感病毒血凝素膜糖蛋白的結構"自然,289:366-378(1981))。這些抗原決定簇聚集于血凝素三體的唾液酸受體結合位點周圍。針對這些位點的抗體會中和病毒的感染性(Weis等，"與其受體唾液酸復合的流感病毒血凝素的結構"，自然,333:426-431(1988))。HAI抗體的滴度和特異性是流感病毒疫苗針對類似和相關流感病毒抹感染的保護性的重要測量指標。在小鼠中進行的研究比較了純化的來自A/Beijing/353/89的rHA0與FLUZONE(ConnaughtLaboratories,Inc,Swiftwater,PA)的引起HAI抗體產生的能力。在0和28天對幾組小鼠，每組5只，注射0.Sng，O.ljig,0.02jag或0.004(agrHA0或三倍量的FLUZONE③血凝素，以便施用相同水平的重組或病毒A/Beijing/353/89血凝素。例如，用l.5"gFLUZONE⑧血凝素(來自每一抹的0.5)Ag血凝素)和0.5貼rHA0對高劑量組的小鼠免疫。FLUZONE⑧中來自另兩種流感病毒株的其它血;疑素抗原的存在導致產生交叉反應抗體。用標準稀釋F丄ISA測量針對純化的rHA0的抗血凝素抗體(血凝素IgG)。對4血凝素單位的以下抗原測量HAI抗體完整流感A/Beijmg/353/89病毒(A/Bei),純化的rHA0A/Beijing/353/89抗原，和FLUZONE。HAI滴度是指能抑制雞血紅細胞50%凝集的抗血清的最高稀釋度的倒數。表3總結了42天時小鼠血清血凝素IgG和HAI滴度。用重組rHA0疫苗生產了高水平的抗血凝素抗體。對比FLUZONE⑧的滴度約高10倍。最有意義的是rHA0疫苗可產生能較好抑制A/Beijing/353/89病毒和rHA0抗原引起的血紅細胞凝集的抗體滴度。因此，rHA0疫苗產生的HAI抗體，能同樣較好地識別免疫原以及流感A/Beijing病毒。對FLUZONE的低HAI滴度可能是因為抗血清不能抑制FLUZONE疫苗中其他兩抹血凝素的凝集作用。作為對照，當只針對其自身進行測量時，FLUZONE免疫的小鼠產生高HAI抗體。對流感A/Beijing/353/89病毒和rHA0抗原的HAI滴度明顯減少。在低劑量組的小鼠中，發現了同樣的結果。表3.對rHA0和FLUZONE②的HAI滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>這些數據還表明FLUZONE中的流感A/Beijing/353/89病毒抹與從FDA得到的HAI分析前在雞蛋中傳過一代的相同流感病毒4朱之間存在著遺傳差異。與從流感A/Beijing/353/89克隆的重組HA0反應所產生的抗體抑制此抹流感病毒及其自身對血紅細胞的凝集作用，這一事實證明了在克隆過程中，沒有發生逸傳改變影響純化的rHAO抗原的唾液酸受體結合位點。實施例10;—種1993/1994流感疫苗的配方及其臨床效果進行了一系列人體臨床試驗來鑒定一種含重組HA的實驗性流感疫苗在人體中的安全性和免疫原性，并收集有關此種疫苗在流感季節對自然感染的保護效果的原始數據。結果證明，按照本文描述的方法生產的含有重組流感血凝素(rHAO)的疫苗與從商業獲得的標準在雞蛋中生產的減毒流感疫苗相比，令人驚奇地導致更少的局部不良反應，而產生相當的或更好的免疫保護反應。才才泮+和方法疫苗。本研究中使用的重組HA疫苗含有來自流感A/Bdjing/32/92(H3N2)病毒的全長的未被切割的HA(HA0)糖蛋白。重組HAO(rHAO)在Lepidopteran(昆蟲)細胞培養物中生產，隨后與含編碼HA基因的cDNA插入片段的桿狀病毒載體接觸。經過用定量掃描光密度測量法對十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上電泳的大量抗原進行測定在非變性條件下純化表達蛋白至>95%。用氨基酸分析、N-末端測序和利用抗流感A/Beijing/32/92血清進行的Western印跡分析證實肽的鑒定。rHA0疫苗包含特定量的合成HA抗原，溶于磷酸鹽緩沖液中或以凝膠懸液形式吸附于磷酸鋁(4,幾)佐劑上。在本研究中使用的獲準的三價亞病毒顆粒疫苗含有15pg/劑的分別來自流感A/Texas/36/91(H1N1)、A/Bei_jing/32/92(H3N2)和B/Panama/45/90病毒(生產于雞蛋的FLUZONETM減毒流感疫苗，ConnaughtLaboratories,Swiftwater，PA)的一種HA。臨床研究。鑒別研究方法已獲得InstitutionalReviewBoardsofSaintLouisUniversity和UniversityofRochester的認同。18到45歲的J建康成年人在兩研究所招收。受試驗者一皮隨機分配，以雙盲法接受以下五種疫苗制劑之一(1)15)agrHA0;(2)pgrHA0加鋁；(3)90figrHA0;(4)獲準的三價滅活流感疫苗；或(5)鹽水安慰劑。肌肉內注射0.5ml疫苗。為了初步確定含rHA0的三種疫苗制劑的安全性，前25個接種疫苗的受試者^皮獨立于其他受試者隨機分組(即每研究組5人)，并在接種后48小時通過電話聯系密切監視。然后進行其余的接種。在接種后前6天，所有受試者都被建議填寫不良反應的每日報告卡，包括局部和系統癥狀。癥狀被自己按情況分為輕微、適中和嚴重幾級。對感到發熱的受試者，測量并記錄其口腔溫度。如果發現注射部位有局部腫大或紅斑，分別按其直徑大于或小于四分之一英寸分級。所有接種都在1993年十一月最后一星期和十二月第一星期進行。在接種時、接種3星期后和1994能三月末或四月流感病毒不再在當地人群中流行后至少2到3星期時，取血清樣品。每個研究所的志愿者都被建議當在冬季流感流行季節中有流感類似病癥時與研究中心聯系。流感類似病癥是指兩天或兩天以上持續有呼吸道癥狀，并伴隨有發熱和/或肌痛或寒冷等系統癥狀。報告有流感類似病癥的受試者被取鼻咽棉4式樣品，進行病毒培養和鑒定。臨床樣品:帔編號，并打亂處理。血清學。對每一種類型的血清學試驗，來自兩個研究所的樣品合成一批在同一單獨的實驗室中進行。用受體破壞酶去除非特異性抑制劑，并在4。C用血細胞吸附去除冷凝集素后通過標準微滴度試驗，測量血清中針對流感A/Beijing/32/93(H3N2)病毒抗原的血;疑抑制(HAI)抗體。滴度被定義為完全阻止4病毒抗原單位引起的血細胞凝集所需的最高血清稀釋液，其中起始稀釋為1:4。用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測量血清HA特異性免疫球蛋白G(IgG)抗體，用來自流感A/Beijing/32/92(H3N2)的純化rHA0作為包被抗原。從固相外周到內的試劑依次包括(I)純化的rHAO抗原；(2)血清樣品；(3)堿性磷酸酶偶聯的羊抗人IgG;和(4)對-硝基苯基磷酸二鈉底物。ELISA滴度以當含抗原槽的光密度至少是不含抗原的相應的對照槽的二倍時的最高稀釋度來表示。用以前Treanor,J.J.和Betts,R.F.(傳染病雜志168:455_459(l993))描述的微量中和檢測法測量中和抗體。簡單地"i兌，將熱滅活的血清的系列稀釋液與大約100TCID5o流感A/Beijmg/32/92(H3N2)病毒混合，在37。C培養1小時。室溫下，病毒-血清混合物吸附于96孔平板上匯合的單層Madin-Darby狗腎(MDCK)細胞上1小時。洗滌平^反，以除去殘留的接種物，重新加入含2pg/mU爽蛋白酶的無血清Dulbecco'sMEM，在5%C02中33。C下培養72小時。然后用甲醇固定細胞，用一組特異于流感A病毒基質和核蛋白(疾病控制中心，Atlanta,GA)的鼠單克隆抗體及隨后的堿性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG評價病毒復制。血清的終滴度定義為與非中和對照槽相比，導致高于50%的信號減少的最高稀釋度。病毒學。在每個研究所用標準技術進行鼻咽棉拭樣品的病毒培養。將樣品接種到MDCK或恒河猴腎細胞中并亍33。C培養"天。用0.4%豚鼠紅細胞對單層細胞進行血細^^吸附試^r。用H3-特異'f生抗血清(病毒控制中心)通過HAI在血細胞吸附陽性培養物中鑒定流感病毒。統計學分析。對HAI、ELISA、IgG和中和抗體的滴度的倒數取對數。進行統計學分析。對接種的明顯反應定義為接種前到接種后3星期血清樣品的抗體滴度升高了4倍或更高。流感A(H3N2)病毒感染的實驗證據定義為從鼻咽腔分泌物中分離出病毒，和/或在接種3星期后(流感季節前)12月收集的樣品與來年春季收集的相應流感季節后的樣品中，血清.HAI抗體滴度有4倍或更高的增加。用Fisher's精確試驗分析疫苗組間的差異，比較產生不良反應、顯著的抗體反應或實驗室證實的流感疾病或感染的受試者比例，并進行方差(ANOVA)分析，對接種后1og2抗體滴度的倒數的平均值進行比較。在適于進行多重可能的比較時進4亍改進的Bonferroni's不等性和Tukey-Kramer測試。結果反應原性。本研究中使用的HA0疫苗是安全的和可耐受的。產生不良反應的頻率不隨rHAO抗原劑量從15jig增加到90|ag而改變，但隨鋁的加入而略有增加。據報告，在服用獲準的亞病毒疫苗的受試者中，注射部位出現局部紅斑、疼痛和敏感的頻率明顯比力^用15)ig或90iLigrHA0鹽溶液的受試者高。除了一人在用獲準的疫苗免疫后胳膊出現中等嚴重的疼痛、敏感和石更化外，其他癥狀都是溫和的，一^殳持續1-2天。出現的局部紅斑和/或硬化其范圍都不超過四分之一英寸。免疫原性。在127名招收的受試者中，64名(50%)針對流感A/Bei」ing/32/92(H3N2)病毒的血清HAI抗體滴度的基線滴度低于或等于1:8。在四個疫苗組的每一組中，大部分受試者經HAI和ELISA測量具有HA特異性血清學反應(表4)。所有疫苗受試者中血清HAI抗體的接種后滴度都大于或等于1:32,除了接種了15pgrHA0的兩個和接種了獲準的疫苗的一人例外。在大部分志愿者中接種同樣與中和抗體的產生相關。用15ngrHA0免疫比用獲準的疫苗免疫后抗體滴度平均值高，而血清轉變率有輕微的降低，雖然這些差異在統計學上并不顯著。對rHA0的抗體反應不隨鋁的加入而增強。用90figrHA0免疫的受試者免疫后產生的平均HAI和ELISAIgG抗體滴度比其他三個疫苗組的任意一個中高2到5倍(比較血清HAI滴度時其差異在統計學上是顯著的)。保護效果。在監視期間，共有26人報告了總共28次流感類似疾病。其中4人(其中三個服用了安慰劑，另一個用15pgrHA0免疫)從鼻咽腔樣品培養物中分離出流感A(H3N2)病毒。在四例培養物證明的病例中，有三例在季節前和季節后血清樣品中的針對流感A/Beijmg/32/92的HAI抗體滴度有明顯增加，但其他報道過疾病的個體并不是這樣。隨后出現實驗確證有流感病癥的僅接受rHA0的受試者在免疫31天后得到的培養物為陽性，并有血清轉變，從接種前HAI滴度小于1:4變為接種后(流感季節前)的1:32。另兩名服用安慰劑和一名用獲準的疫苗免疫的志愿者在流感流行季節時具有感染了流感A(H3N2)病毒的血清學證據，但沒有臨床病狀。與所有免疫接種的受試者(或所有接受任何rHA0疫苗的受試者)作為一組相比，服用安慰劑的受試者中具有實驗確證的流感A(H3N2)疾病(p<,05)或被感染(p<.005)的比例明顯更大。的rHA0抗原的流感疫苗的耐受性較好，并能引起人類受試者的保護性免疫反應。甚至在90pg劑量時，本研究中評價的rHA0的反應原性不比鹽45fig)總HA抗原的三價亞病毒疫苗。與15ingrHA0制劑的中和、HA特異性抗體的反應與由亞病毒疫苗引起的相當，并在rHAO劑量增加到90嗎時有明顯提高。由于自然接觸流感A(H3N2)病毒循環流行株而產生的總的感染和致病率在接種的受試者中比服用安慰劑的受試者要明顯降低。這些數據顯示，rHAO特別是以高劑量的用藥時引起的保護性免疫與目前使用的疫苗相當或更好。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例ll:制備改善的HAO克隆載體的方法設計一個改善的表達成熟HA的克隆載體，其中編碼HA的基因緊接于編碼幾丁質酶信號肽的序列的下游。制成具單鏈尾部的線性pMGS27在質粒pMGS27中，HA克隆進緊接幾丁質酶信號肽下游的Sma/或《/"/位點。核酸和氨基酸序列分別列于SEQIDNO.22和SEQIDNO.23:5'-幾丁質酶信號肽Sw"/TGGTTGGTCGCCGTTTCTAACGCGATTCCCGGGGGTACCTRPLEUVALALAVALSERASNALAILEPROGLYGLYTHR在此區域發生寡聚核苷酸指導的誘變，生成pMGS27(突變的堿基下劃線表示)(SEQIDNO.24):5'TGGTTAGTCGCCGTQTCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTTGGTACCPstl用/\"/酶切將質粒pMGS27線性化(列出SEQIDNO.24的6-35堿基)AGTCGCCGTGTCCTGCA5'GGCCAGAGAGGCCTTCAGCGGCACAGG5'ACGTCCGGTCTCTCCGGA然后用T4DNA聚合酶與dATP處理線性pMGS27，產生如下所示的單鏈尾部(SEQIDNO.24的23-36石威基和6-18堿基的互補序列)A5'GGCCAGAGAGGCCTTCAGCGGCACAGG5'A將目的HA基因克隆到pMGS27中。步驟1.合成PCR引物。上游寡聚核苷酸(SEQIDNO.25):'5'GTCGCCGTGTCCAACGCG(成熟HA的5'端20個堿基)反向寡聚核苷酸(SEQIDNO.26的互補序列)(成熟HA的3'端20個堿基)ATTAACCGGTCTCTCCGG5'HA基因的PCR目的HA基因與兩寡聚核苷酸進行PCR,得到(SEQIDNO.25和SEQIDNO.26):375'GTCGCCGTGTCCAACGCG(成熟HA)CAGCGGCACAGGTTGCGC(成熟HA)TAATTGGCCAGAGAGGCC3'ATTAACCGGTCTCTCCGG將目的HA基因與pMGS27退火，轉化￡.co/z混合線性pMGS27和用T4DNA聚合酶處理的HA基因PCR片<a。兩分子退火，形成一環形質粒，可用于轉化五.co/,。圖中包括SEQIDNO.25和SEQIDNO.26，SEQIDNO.24的23-36和6-18^s威基。GTCGCCGTGTCCAACGCG(成熟HA)TAATTTTGCGC(成熟HA)ATTAACCGGTCTCTCCGG+AGGCCAGAGAGGCCTTCAGCGGCACAGGA到幾丁質酶信號肽終止GTCGCCGTGTCCAACGCG(成熟HA)TAATTGGCCAGAGAGGCCT如上所述，在信號肽和成熟HA之間沒有多余的氨基酸。實施例12:三價型A和B1995-1996流感病毒疫苗的制備及其效果。流感病毒疫苗，純化的重組血凝素，三價體，類型A和B(A/Texas/36/92\l(H1N1),A/Johanesburg/33/94(H3N2),和B/Harbin〃/94)是從純化的重組流感血凝素抗原(HA)得到的非感染性亞單位。HA基因從如上所述的疾病控制中心/食品和藥物局推薦的流感A和B病毒抹克隆，并用DNA測序分析確定每一克隆的基因。使用包含從流感病毒抹A/Texas/36/91(H1N1),A/Johanesburg/33/94(H3N2),B/Harbm74/94克隆的HA基因的桿狀病毒表達載體在培養的昆蟲細胞中產生重組HA抗原。重組的HA蛋白是全長的未被切割的血凝素(rHAO),分子量約為69,000。在無血清培養基中維持的5^^^feM/g^eM"(Lepidopteran)纟田胞系中生產rHAO。三價疫苗含有來自兩種流感A抹和一種B抹的純化的(純度大于95%,很可能大于99%)rHAO，按相同比例混合。此疫苗作為溶于磷酸鹽緩沖溶液的、不加防腐劑的純化的A和B型rHAO蛋白用于臨床。使用單價、二價和三價rHAO疫苗的動物實驗表明它們沒有明顯的毒性。在疫苗中沒有可檢測到的有毒或有害物質。在小鼠和豚鼠中對A/Beijing/32/92和A/Texas/36/91rHAO的一般安全性和免疫原性進行了研究。沒有發現不良反應。在小鼠中，用不加佐劑的1S微克rHAO抗原的單次免疫在2到3星期誘導高水平的抗HAIgG抗體、血凝素抑制(HAI)抗體和中和抗體。在一項研究中，用15微克純化的產于適應含10%胎牛血清的培養基的細胞中的rHAOA/Bdjing/32/92(H3N2)或產于在含IO%胎牛血清的培養基中適應的昆蟲細胞的rHAO或產于適應無血清培養基的昆蟲細胞的rHAO(rHAO-SF)免疫每組10只的小鼠組。注射2到3星期后，對小鼠取血制備血清樣品。測量每一血清樣品的抗HAIgG和HAI抗體。rHAO和rHAO-SF抗原產生相同的抗HA和HAI抗體滴度。單次免疫2星期后，大部分小鼠產生明顯的HAI抗體滴度，到第三星期每組中8/10的小鼠的HAI滴度為32或更高。這些及其他的生化和免疫學研究證明產于無血清昆蟲細胞培養物的rHAO與在含血清的發酵條件下生產的rHAO沒有區別。進行了一項研究，對三價rtiAO流感疫苗的1994-1995配方和一種獲準的純化病毒表面抗原疫苗，Fluvirin(—種在雞蛋中培養生產的減毒流感病毒疫苗)進行了對比。每種疫苗每0.5微升含有來自A/Texas/36/91(H1N1),A/Shangdong/9/93(H3N2)和B/Panama/45/90流感病毒抹的15微克rHAO或病毒HA。所有重組rHAO和Fluvim^疫苗都配制于磷酸鹽緩沖鹽水。在接種后O,2和3周，以十只小鼠為一組的數組被采血且制備血清。就抑制抗蛋-生長的流感病毒抗體的抗-HAIgG抗體，以及就抗來自于每一病毒抹的蛋-生長流感病毒的中和抗體測試血清樣品。如圖4a,4b和4c所示，重組rHAO和批準的流感疫苗誘導高水平的、抗來自于疫苗的三種流感毒抹的每一種的血凝素的血清IgG抗體。與批準的疫苗相比，rHAO疫苗誘導了4至10倍高的IgG抗體滴度。如圖5所示，亦用流感病毒A和B,株病毒制備了抑制雞紅細胞血凝素的抗體。與批準的疫苗相比，在接受了三價rHAO疫苗的小鼠中，針對三種流感病毒毒抹的每一種，HAI滴度是等同的或更高。在一標準微量滴定病毒試驗中，測得該疫苗亦誘導高水平的抗特異的流感A和B病毒毒抹的中和抗體。用rHAO免疫接種的小鼠與用批準的純化病毒表面抗原疫苗，Fluvim^免疫接種的小鼠相比，其幾何中和抗體滴度大約2倍高。這些結果表明，基于1994-1995型A和B流感毒抹的rHAO疫苗的三價制劑在誘導功能性HAI和中和抗疫苗中所有三種毒抹的血清抗體方面，與批準的亞單位流感疫苗是等同的或更優越。表5:三價rHAO疫苗與Fluvirin⑧的比較三價rHAO流感疫苗FluvirinGMT(n=10只小鼠)GMT(n=10小鼠)作為抗原的病毒牙朱抗HAIgG抗HAIgG0星期3星期o星期3星期A/Texas/36/92(HlNl)<1000103,000<100011，200A/Shangdong/32/92(H<1000162,400<100041,0003N2)B/Pai麗a/45/90<1000164,800<100026,000作為抗原的病毒^朱HAIA/Texas/36/92(H，)<81,522<8'i,GSSA/Shangdong/32/92(H<8494<84353N2)B/Panama/45/90<8174<842作為抗原的病毒株中和Ab中和AbA/Texas/36/92(HlNl)<1005,800<1002,720A/Shangdong/32/92(H<100840<1003603N2)B/Pana腿Z45/90<1001，300<100700用于制備和使用重組流感疫苗的本文所述的方法及組合物的改進和變動對本領域的4支術人員而言將是顯而易見的。這些改進和變動將包含于隨后的權利要求的范圍中。序列表(1)一般信息(i)申請人MicroGeneSys,Inc.(ii)發明名稱一種生產流感血凝素多價疫苗的方法(iii)序列數32(iv)聯系地址(A)聯系人PatreaL.Pabst(B)街道2800OneAtlanticCenter1201WestPeachetreeStreet(C)城市Atlanta(D)州GA(E)國別USA(F)郵政編碼30309-3450(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)搡作系統PC-DOS/MS-DOC(D)軟件PatentlnRelease#1.0,Version#1.25(vi)目前申請數據(a)申請號pct/us95/06750(b)申請日1995年5月26曰(c)分類(ix)電訊信息(a)電話(404)-873-8794(B)電傳(404)-873-8795(2)SEQIDNO.1信息(i)序列特征(A)長度12堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)有機體流感病毒(x)出版信息(A)作者Davis等(B)題目含有流感病毒WSN抹(NONl)血凝素基因的細菌克隆的構建和鑒定(C)期刊基因(D)巻10(F)頁205_218(G)日期1980(xi)序列描述SEQIDNO.1:AGCAAAAGCAGG12(2)SEQIDNO.2信息(1)序列特征fA)長度39喊基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO.2:GGGGGTACCCCCGGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAA39(2)SEQDNO.3信息(l)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO.3:(2)SEQIDNO.4信息(1)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQIDNO.4:(2)SEQIDNO.5信息(i)序列特征(A)長度35堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)亭列描述SEQIDNO.5:CCCGGTACCTCAKATKCATATTCTGCACTGCAAG35(2)SEQIDNO.6信息(i)序列特征(A)長度1793堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(m)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離A/Beijing/32/92rHA(ix)特征(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列編碼區(B)位置19到72(ix)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1728(ix)特征(A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點(B)位置1771到1777(ix)特征(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1776到1782(ix)特征(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1783到1793(xi)序列描述SEQIDNO.6:TAAAAAAACCTATAAATAATGCCC丁TGTACAAATTGTTAAACGT丁TTG丁GGTTGGTCGCCGTT丁CTAACGCGAT丁CCCGGGGACTTTCCAGGAAATGACAACAGCACAGCAACGCTGTGCGO120CTGGGACATCATGCAGTGCCAAACGGAACGCTAGTGAAAATGATCAA3VTT1B0GAAGTGACTAATGCTACTGAGC丁GGTTCAGAGTTCC丁CAACAGGTAGAATATGCGACAGT240CCTCACCGAATCCTTGATGGAAAAAACTGCACAC丁GATAGA丁GCTCTATTGGGAGACCC丁300CATTGTGATGGCTTCCAAAATAAGGAATGGGACCTTTTTGTTGAACGCAGCAAAGCTTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTACCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCA420TCAGGCACCC丁GGAGTTTATCAATGAAGACTTCAATTGGAC丁GGAGTCGCTCAGGATGGG480GGAAGCTATGCTTGCAAAAGGGGATCTGTTAACAGTTTCTTTAGTAGATTGAA丁TGGTTG540CACARATCAGAATACAAATATCCAGCGCTGAACGTGACTATGCCAAACAATGGCAAATTT600GACAAMTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGAGCACGGACAGAGACCAAACCAGCCTAS60TATGTTCGAGCATCAGGGAGAGTCACAGTCTCTACCAAAAGAAGCCAACAAACTGTAACC720CCGAATATCGGGTCTAGACCCTGGGTAAGGGGTCAGTCCAGTAGAATAAGCATCTATTGG780ACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTT丁GATTAATAGCACAGGGAATCTAATTGCTCCT840CGGGGTTACTTCAAAATACGAAATGGGAAAAGCTCAATAATGAGGTCAGATGCACCCATT900GGCACCTGCAGTTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCTTTT3S0CAAAATGTAAACAGGATCACATATGGGGCCTGCCCCAGATATGTTAAGCAAAACACTCTG1020AAATTGGCAACAGGGATGCGGAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTCGGCGCA1080ATCGCAGGTT丁CATAGAAAATGGT丁GGGAGGGAATGGTAGACGGTTGGTACGGTTTCAGG1140CATCAAAATTCTGAGGGCACAGGACAAGCAGCAGATCTTAAAAGCACTCAAGCAGCAATC1200GACCAAATCAACGGGAAACTGAATAGGTTAATCGAGAAAACGAACGAGAAATTCCATCAAATCGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTCGAGAAATATGTTGAA1320GACACTAAAATAGATCTCTGGTCTTACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCrGGAGAACCAA1380CATACAATTGATCTAAC丁GACTCAGAAATGAACAAACTG丁TTGAAAAAACAAGGAAGCAA1440CTGAGGGAAAATGCTGAGGACATGGGCAATGGTTGCTTCAAAATATACCACAAATGTGAC1500AATGCCTGCATAGGGTCAATCAGAAATGGAACTTATGACCATGATGTATACAGAGACGAAGCATTAAACAACCGG丁TCCAGATCAAAGGTGTTGAGCTGAAGTCAGGATACAAAGATTGG1620ATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGCT丁TTTGCTTTTGTGTTGTTTTGC丁GGGGTTCA丁CATG丁GGGCC丁GCCAAAAAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAGTGTATTAA1740TTAAAAACACCC丁TGTTTCTAGGATGATTCGGTACCAGATCTTAATTAATTAA1793(2)SEQIDNO.7信息(i)序列特征(A)長度570氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹A/Beijmg/32/92rHA(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到552(xi)序列描述SEQIDNO.7:MetProLeuTyrLysLeuLeuAsnValTrpValAlaValSer11015AsnAlalieProGlyAspPheProGlyAsnAspAsnSerThrAlaThr202530LeuCysLeuGlyHisHisAlaValPi:oAsnGlyThrLeuValLysThr354045工leThrAsnAspGin工leGluValThrAsnAlaThrGlulieuValGin5055SOSerSerSerThrGlyArg工leCysAspSerProHisArglieLieuAsp65707580GlyLysAsnCysThrIjeu工leAspAlaLeuIeuGlyAspProHisCys8590AspGlyPheGinAsnLysGluTrpAspLeuPheValGluArgSerLys100105110AlaTyrSerAsnCysTyrProTyrAspValProAspTyrAlaSerLieu11512D125SerLeuValAlaSerSerGlyThrGluPhelieAsnGluAsp,130135140PheAsnTrpThrGlyValAlaGinAspGlyGlySerTyrAlaCysLys0ArgGlySerValAsnSerPhePheSerArgLeuAsnTrpHisLys165170175SerGluTyrLysTyrProAlaLeuAsnValThrMetProAsnAsnGly180185LysPheAspLysLeuTyr工leTrpGlyValHisHisProSerThrAsp195200205ArgAspGinThrSerLeuTyrValArgAlaSerGlyArgValThrVal210215220SerThrLysArgSerGinGluThrValT,hrProAsnlieGlySerArg225230235240ProTrpValArgGlyGinSerSerArg工leSerlieTyrTrpThrlie245250255ValLysProGlyAsplieLeuLeulieAsnSerThrGlyAsnLeulie260270AlaProArgGlyTyrPheLys工leArgAsnGlyLysSerSerlieMet275280285ArgSerAspAlaProlieGlyThrCysSerSerGluCys工leThrPro300AsiiGlySerlieProAsnAspLysProPheGinAsnValAsnArg工le305310315320ThrTyrGlyAlaCysProArgTyrValL<ysGinAsnThrLeuL/ysLeu325330335AlaThrGlyMetArgAsnValProGluLysGinThrArgGly工lePhe340345350GlyAlalieAlaGlyPhe工leGluAsnGlyTrpGluGlyMetValAsp3553603S5GlyTrpTyrGlyPheArgHisGinAsnSerGluGlyThrGlyGinAla370375380AlaAspLeuLysSerThrGinAlaAla工leAspGinlieAsnGlyLys385400LeuAsnArgLieu工leGluIyysThrGluIyysPheHisGinlieGlu405410415LysGluPheSerGluValGluGlyArg工leGinAspLeuGluLysTyi:420430ValGluAspLys工leAspLeuTrpSerTyrAsnAlaGluLeuIjeu435440445ValAla450LeuGluAsiiGillHis455ThrAsnLysLeuPheGluLysThrArg470AspMetGlyAsnGly485CysPheL<ysCys工leGlySer500工leArgAsnGlyAspGluAla515LeuAsnAsnArgPheS20SerGly530TyrLysAspTrp工le535LeuPheLieuLeuCysValValLieuLeu545550LysGlyAsnlieArg5S5CysAsnlie工leAspLeuThr460AspSerGluMetItysGinLeu475ArgGluAsnAlaGlu480工leTyrHisliysCysAspAsiiAlaThrTyrAspHisAspValTyrArg505510GinlieLysGlyVal525GluLeuLysTrplieSerPhe540Ala工leSerCysGlyPhe工le555MetTrpAlaCysGin5S0Cyslie570(2)SEQIDNO.8信息(i)序列特征(A)長度1776堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(li)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Texas/36/91rHA(ix)特征(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號肽編碼區(B)位置19到72(ix)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點,(B)位置76至ij81(ix(ix)特征(A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點(B)位置82到87)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點(B)位置88到93特征A)名稱/符號成熟rHA編碼區B)位置73到1734(ix)特征A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點B)位置1744到1749(ix)特征A)名稱/符號BglII限制性酶切位點B)位置1750到1755(ix)特征A)名稱/符號通用翻譯終止信號(ix)B)位置:1756到1766(xi)序列描述::SEQIDNO.8:taaaaaaacctataaataatgcccttgtacaaattgt丁aaacgttttgtggt丁ggtcgcc60gtttctaacgcgattcccgggggtacccccggggacacaatatgtataggctaccatgcg120aacaactcaaccgacactgttcacacagtacttgagaagaacgtgacagtgacacactct180gtcaacctacttgaggacagtcacaacggaaaactatgtcgactaaagggaatagcccca240ctacaattgggtaattgcagcgttgccggatggatct丁aggaaacccaaaatgcgaatca300ctgttttc丁aaggaatcatggtcc丁acattgcagaaacaccaaaccctgagaatggaaca360tgttacccagggtatttcgccgactatgaggaactgagggagcaattgagttcagtatca420tcattcgagagattcgaaatattccccaaagaaagctcatggcccaaccacaccgtaacc480aaaggagtaacgagatca丁gctcccataatgggaaaagcagtttttacagaaatttgcta540tggctgacggagaagaatggcttgtacccaaatctgagcaagtcctatg丁aaacaacaaa600gagaaagaag丁ccttg丁ac:tatggggtgttcatcacccgtctaacataagggaccaaagg"0gccatc丁atcatacagaaaatgcttatgtctctgtagtgtcttcacattatagcagaaga720ttcaccccagaaatagcaaaaagacccaaagtaagagatcaagaaggaagaattaactac780TACTGGACTCTGCTGGAACCCGGGGACACAATAA丁ATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATA840GCGCCATGGTATGCTTTCGCACTGAGTAGAGGCTTTGGGTCAGGAATCATCACCTCAAAC900GCATCAATGGATGAATGTGACGCGAAGTGTCAAACACCCCAGGGAGCTATAAACAGTAGT960CTTCCTTTCCAGAATGTACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAAAGTATGTCAGGAGT1020ACAAAATTAAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCATCCATTCAATCCAGAGGTTTG1080TGGAGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACTGGAATGATAGATGGATGGTAT1140GGTTATCATCATCAGAATGAACAAGGATCTGGCTATGCTGCGGACCAAAAAAGCACACAA1200AATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAATTCTGTAATCGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGCAAAGAATTCAACAAATTAGAAAGAAGGATGGAAAACTTAAATAAA1320AAAGTTGATGATGGATTTCTGGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTGGTTCTACTG1380GAAAATGGAAGGACTTTGGATTTTCATGACTCAAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTA1440AAAAGCCAATTGAAGAATAATGCCAAAGAAATAGGGAACGGGTGTTTTGAATTCTATCAC1500AAGTGTAACAATGAATGCATGGAAAGTGTGAAAAATGGAACTTATGACTATCCAAAATAT15S0TCCGAAGAATCAAAG丁TAAACAGGGGAAAAATTGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGA1S20GTCTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCACTGGTGCTTTTGGTCTCC1S80CTGGGGGCAATCAGC丁TCTGGATGTGTTCTAATGGGTCTTTGCAGTGCAGAATATGAATC1740TGAGGTACCAGATCTTAATTAATTAA17"(2)SEQIDNO.9信息(i)序列特征(A)長度572氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性)分子類型肽)假擬結構無)反義無)片段類型N-末端)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹A/Texas/36/91rHA)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到554(xi)序列描述SEQIDNO.9:MetProLeuTyrLysIjeuLeuAsnValLeuTrpIjeuValAlaValSer151015AsnAla工leProGlyGlyThrProGlyAspThrlieCyslieGlyTyr202530HisAlaAsnAsnSerThrAspThrValAspThrValGluLysAsn354045ValThrValThrHisSerValAsnLeuLeuGluAspSerHisAsnGly505560LysLeuCysArgLeuLysGlylieAlaProIjeuGinLieuGlyAsnCysS5707580SerValAlaGlyTrplieLeuGlyAsnProLysCysGluSer]JeuPhe859095SerLysGluSerTrpSerTyrlieAlaGluThrProAsnProGluAsn100ios110GlyThrCysTyrProGlyTyrPheAlaAspTyrGluGluLeuArgGlu115120125GinLeuSerSerValSerSerPheGluArgPheGluliePheProLys130140GluSerSerTrpProAsiiHisThrValThrlaysGlyValThrArgSer14S150155ISOCysSerHisAsnGlyLysSerSerPheTyrArgAsnLeuIjeuTrpLeu175TlirGluLysAsnGlyIjeuTyrProAsnUeuSerLysSerTyrValAsn180185130AsnLysGluLysGluValLeuValLeuTrpGlyValHisHisProSer135200205AsnlieArgAspGinArgAlalieTyrHisThi:GluAsnAlaTyrVal21021S220SerValValSerSerHisTyrSerArgArgPheThrProGlulieAla22S230235240LysArgProLysValArgAspGinGluGlyArglieAsnTyrTyrTrp24S250255ThrLeuLeuGluProGlyAspThrlieliePheGluAlaAsnGlyAsn260265270LeuIle—AlaProTrpTyorAlaPheAlaLeuSerArgGlyPheGlySer27S280285GlyIlelieThrSerAsnAlaSerMetAsp.GluCysAspAlaLysCys295300GinThrProGinGlyAlalieAsnSerSerLeuProPheGinAsnVal305310315320HisProValThrlieGlyGluCysProLysTyrValArgSerThrLys325330335LeuArgMetValThrGlyLeuArgAsnlieProSerlieGinSerArg340345350GlyLeuPheGlyAlalieAlaGlyPhelieGluGlyGlyTrpThrGly3553S03S5Met工leAspGlyTrpTyrGlyTyrHisHisGinAsnGluGinGlySer370375380GlyTyrAlaAlaAspGinLysSerThrGinAsnAlalieAsnGlylie385390395400ThrAsnLysValAsnSerVal工leGluUysMetAsnThrGinPheThr405410415AlaValGlyLysGluPheAsnLysLeuGluArgArgMetGluAsnLeu420425Asn.LysLysValAspAspGlyPheJjeuAsplieTrpThrTyrAsnAla435440445GluL<euLeuValLeuljeuGluAsnGlyArgThrLeuAspPheHisAsp450455SerAsnValLiysAsnLieuTyrGluLysValLysSerGinLeuLysAsn4S5470475480AsnAlaLysGlulieGlyAsnGlyCysPheGluPheTyrHisLysCys485495AsnAsnGluCysMetGluSerValLysAsnGlyThrTyrAspTyrPro500505510LysTyrSerGluGluSerLysLeuAsnArgGlyLyslieAspGlyVal515520525LysLieuGluSerMe仁GlyValTyrGinlieLeuAla工leTyrSerThr530535540ValAlaSerSerLeuValLeuLieuValSerLeuGlyAla工leSerPheS4SSSO55STrpMetCysSerAsnGlySerLeuGinCysArglie565S70(2)SEQIDNO.IO信息:(i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型1799堿基對核酸單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型RNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離才朱B/Panama/45/90rHA(ix)特征(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號HA信號肽序列編碼區(B)位置19到69(ix)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點(B)位置22到27(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置70到1773(ix)特征(A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點(B)位置1777到1782(ix)特征(A)名稱/符號Bglll限制性酶切位點(B)位置1783到1788(ix)特征(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1789到1799(xi)序列描述SEQIDNO.10:TAAAAAAACCTATAAATAATGCCCGGGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGTAGTAACA60TCCAACGCAGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACTCACCTCATGTGGTCAAA120ACAGCTACTCAAGGGGAAGTCAATGTGACTCGTGTGATACCACTGACAACAACACCAACA180AAATC丁CATTTTGCAAATCTAAAAGGAACAAAGACCAGAGGGAAACTATGCCCAAACTGT240CTCAACTGCACAGATCTGGATGTGGCCTTGGGCAGACCAATGTGTGTGGGGACCACACCT300丁CGGCAAAAGCTTCAATACTCCACGAAGTCAGACCTGTTACATCCGGGTGCTttcctATA360ATGCACGACAGAACAAAAATCAGACAGCTACCCAATCTTCTCAGAGGATATGAAAATATC420AGATTATCAACCCAAAACGTTATCAACGCAGAAAGAGCACCAGGAGGACCCTACAGACTT480GGAACCTCAGGATCTTGCCC:TAACGTTACCAGTAGAGACGGATTCTTCGCAACAATGGCT540TGGGCTGTCCCAAGGGACAACAAAACAGCAACGAATCCACTAACAGTAGAAGTACCATAC600ATTTGTACCAAAGGAGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGTTCCATTCTGATAACAAAATC"0CAAATGAAAAACC丁CTATGGAG^CTCAAATCCTCAAAAGTTCACCTCATCTGCCAATGGA720GTAACCACACATTATGTTTC丁CAGATTGGTGGCTTCCCAAATCAAACAGAAGACGGAGGG780CTACCACAAAGCGGCAGAATTGTTGTTGATTACATGGTGCAAAAACCTGGGAAAACAGGA840ACAATTGTCTATCAAAGAGGTGTTTTGTTGCCTCAAAAGGTGTGGTGCGCAAGTGGCAGG900AGCAAGGTAATAAAAGGGTCCTTGCCTTTAATTGGTGAAGCAGATTGCCTTCACGAAAAA9S0TACGGTGGATTAAACAAAAGCAAGCCTTACTACACAGGAGAACATGCAAAAGCCATAGGA1020AATTGCCCAATATGGGTGAAAACACCTTTGAAGCTTGCCAATGGAACCAAATATAGACCT1080CCTGCAAAACTATTAAAGGAAAGGGGTTTCTTCGGAGCTATTGCTGGTTTCTTAGAAGGA1140GGATGGGAAGGAATGATTGCAGGTTGGCACGGATACACATCTCATGGAGCACATGGAGTG'1200GCAGTGGCAGCAGACCTTAAGAGTACGCAAGAAGCCATAAACAAGATAACAAAAAATCTC1260AATTCTTTGAGTGAGCTAGAAGTAAAGAATCTTCAAAGACTAAGTGGTGCCATGGATGAA1320CTCCACAACGAAATACTCGAGCTGGATGAGAAAGTGGATGATCTCAGAGCTGACACAATA1380義GCTCGCAAATAGAGCTTGCAGTCTTGCTTTCCAACGAAGGAATAATAAACAGTGAAGAT1440GAGCATCTATTGGCACTTGAGAGAAAACTAAAGAAAATGCTGGGTCCCTCTGCTGTAGAC1500ATAGGGAATGGATGCTTCGAAACCAAACACAAGTGCAACCAGACCTGCTTAGACAGGATA15S0GCTGCTGGCACCTTTAATGCAGGAGAATTTTCTCTTCCCACTTTTGATTCACTGAATATTiS20ACTGCTGCATCTTTAAATGATGATGGATTGGATAATCATACTATACTGCTCTACTACTCA1S80ACTGCTGCTTCTAGTT丁GGCTGTAACATTGATGATAGCTATTTTTATTGTTTATATGGTC1740TCCAGAGACAATGTTTCTTGTTCCATCTGTCTG丁GAGGXACCAGATCTTAATTAATTAA.1799(2)SEQIDNO.11信息(i)序列特征(A)長度585氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(")分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離^朱B/Panama/45/90rHA(ix)特征(A)名稱/符號HA信號肽(B)位置1到17(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置18到568(xi)序列描述SEQIDNO.11:MetProGlyLysAlalie工leValLeuLieuMetValValThrSer.Asn151015AlaAspArglieCysThrGlylieThrSerSerAsnSerProHis'Val202530ValLysThrAlaThrGinGlyGluValAsnValThrGlyVal工lePro354045LeuThrThrThrProThrLysSerHisPheAlaAsnIjeuEysGlyThr505$60LysThrArgGlyLysLeuCysProAsnCysLeuAs11CysThrAspLeu65707580AspValAlaLeuGlyArgProMetCysValGlyThr*ThrProSerAla85LysAlaSer工leLeuHisGluValArgProValThrSerGlyCysPhe100105110ProlieMetHisAspArgThrEyslieArgGinLieuProAsnLeuLieu115120125ArgGlyTyrGluAsn工leArgLeuSerThrGinAsnVallieAsnAla130135140GluArgAlaProGlyGlyProTyrArgLeuGlyThrSerGlySerCys0ProAsnValThrSerArgAspGlyPhePheAlaThrMetAlaTrpAla170175ValProArgAspAsnLysThrAlaThrAsnProThrValGluVal1801B5190ProTyrlieCysThrLysGlyGiuAspGinlieThrValTrpGlyPhe200205HisSerAspAsnLys工leGinMetLysAsnLieuTyrGlyAspSerAsn210215220ProGinLysPheThrSerSerAlaAsnGlyValThrThrHisTyrVal225230235240SerGin工leGlyGlyPheProAsnGinThrGluAspGlyGlyLeuPro24S2S0255GinSerGlyArg工leValValAspTyrMetValGinLysProGlyLtys2S0270ThrGlyThr工leValTyrGinArgGlyValEeuLeuProGluLysVal275280285TrpCysAlaSerGlyArgSerLysVallieLysGlySerLeuProLeu230235300lieGlyGluAlaAspCysLeuHisGluLysTyrGlyGlyLeuAsnLys305310315320SerLysProTyrTyrThrGlyGluHisAlaLysAlalieGlyAsnCys325330335Pro工leTrpValLysThrProLeuLysIjeuAlaAsnGlyThrLysTyr340345350ArgProProAlaLysLeuLysGluArgGlyPhePheGlyAla'工le355一3S0365AlaGlyPheLeuGluGlyGlyTrpGluGlyMetlieAlaGlyTrpHis370375380GlyTyrThrSerHisGlyAlaHisGlyValAlaValAlaAlaAspUeu385390400LysSerThrGinGluAla工leAsnLys工leThrLysAsnLieuAsnSer405410415LeuSerGluGluValLysAsnLieuGinArgLeuSerGlyAlaMet420425430AspGluLeuHisAsnGlu工leLeuGluLreuAspGluLysValAspAsp440445LeuArgAlaAspThr工leSerSerGin工leGluLeuAlaValIjeuLieu450455SerAsnGluGlylielieAsnSerGluAspGluHisLeuLeuAlaIjeu470475480GluArgLysLeuLysLysMetL<euGlyProSerAlaValAsplieGly485490495Asn,GlyCysPheGluLysHisLysCysAsnGinThrCysLeuAspS0050S510Arg工leAlaiiaGlyThrPheAsn^laGlyGluPheSerLeuProThr515S20525PheAspSerLeuAsnlieThrAlaAlaSerLeuAsnAspAspGlyLeuS30535540AspAsnHisThrlieLeuLeuTyrTyrSer.ThrAlaAlaSerSerLeu545550555SSOAlaValThrLeuMetlieAla工lePhelieValTyrMetValSerArg565570575AspAsnValSerCysSer工leCysLeu5B0.585(2)SEQIDNO.12信息(i)序列特征(A)長度1811堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈'(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)('ii)布i擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)有機體流感病毒(C)個體分離抹B/Netherlands/13/94rHA(ix)特征(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1至ij18(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列編碼區(B)位置19到72(ix)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1785(ix)特征(A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點(B)位置1789到1794(ix)特征(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1795到1800(ix)特征(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1801到1811(xi)序列描述:SEQIDNO.12:TAAAAAAACCTATAAATAATGCCCTTGTACAAATTGTTAAACGTTTTGTGGTTGGTCGCC—60GTTTCTAACGCGATTCCCGGGGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAAATCACCT120CATGTAGTCAAAACAGCTACTCAAGGGGAGGTCAATGTGACTGGTGTGATACCACTGACG180ACAACACCAACAAAATCTCATTTTGCAAATCTCAAAGGAACAAAGACCAGAGGGAAACTA240TGCCCAAACTGTCTCAACTGCACAGATCTGGATGTCGCCTTGGGCAGACC■AATGTGTGTG300GGGATCACACCTTCGGCAAAAGCTTCAATACTCCACGAAGTCAGACCTG丁TACATCCGGG360TGCTTTCCTATAATGCATGACAGAACAAAAATCAGACAGCTACCCAATCTTCTCAGAGGA420TATGAAAACATCAGACTATCAACCCAAAACGTTATCAACGCAGAAAAGGCACCAGGAGGA480CCCTACAGACTTGGAACCTCAGGATCTTGCCCTAACGTTACCAGTAGAACCGGATTCTTC540GCAACAATGGCTTGGGCTGTCCCAAGGGACAACAAAACAGCAACGAATCCACTAACAOTA600GAAGTACCATACATTTGTACGAAAGGAGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGTTCCATTCTS60GATAACAAAACCCAAATGAAAAACCTCTATGGAGACTCAAATCCTCAAAAGTTCACCTCA720TCTGCCAATGGAGTAACCACACATTATGTTTCTCAGATTGGTGGCTTCCCAGATCAAACA780GAAGACGGAGGACTACCACAAAGCGGCAGAATTGTTGTTGATTACATGGTGCAAAAACCT840GGGAAAACAGGAACAATTGTCTATCAAAGAGGTATTTTGTTGCCTCAAAAGGTGTGGTGC900GCAAGTGGCAGGAGCAAGGTAATAAAAGGGTCCTTGCCTTTAATTGGTGAAGCAGATTGC960CTTCACGAAAAATACGGTGGATTAAACAAAAGCAAGCCTTACTACACAGGAGAACATGCA1020AAAGCCATAGGAAATTGCCCAATATG-GGTGAAAACACCTTTGAAGCTTGCCAATGGAACC1080AGATATAGACCTCCTGCAAAACTATTAAAGGAAAGGGGTTTCTTCGGAGCTATTGCTGGT1140TTCTTAGAAGGAGGATGGGAAGGAATGATTGCAGGTTGGCACGGATACACATCTCACGGG1200GCACATGGAGTGGCAGTGGCAGCAGACCTTAAGAGTACGCAAGAAGCCATAAACAAGATA12S0ACAAAAAATCTCAATTCTTTGAGTGAGCTAGAAGTAAAGAACCTTCAAAGACTAAGTGGT1320GCCATGGATGAACTCCACAACGAAATACTCGAGCTGGATGAGAAAGTGGATGATCTCAGA13B0GCTGACACAATAAGCTCGCAAATAGAGCTTGCAGTCTTACTTTCCAACGAAGGAATAATA1440AACAGTGAAGATGAGCATCTATTGGCACTTGAGAGAAAACTAAAGAAAATGCTGGGTCCC1500TCTGCTGTAGACATAGGGAATGGATGCTTCGAAACAAAACACAAGTGCAACCAGACCTGCTTAGACAGGATAGCTGCTGGCACCTTTAATGCAGGAGAATTTTCTCTTCCCACTTTTGATTCACTGAATATTACTGCTGCATCTTTAAATGATGATGGATTGGATAATCATACTATACTG1SBOCTCTACTACTCAACTGCTGCTTCTAGTTTGGCTGTAACATTGATGATAGCTATT'm'ATT1740GTTTATA丁GGTCTCCAGAGACAATGTTTCTTGTTCCATCTGTCTGTGAGGTACCAGATCT1800TAATTAATTAA1811信息:589氨基酸氨基酸單鏈(2)SEQIDNO.13(i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型(D)拓樸結構線性ii)分子類型肽iii)jl擬結構無iv)反義無v)片段類型N-末端vi)原始來源A)生物體流感病毒C)個體分離抹B/Netherlands/13/94rHA特征A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列B)位置1至!J18.(ix)特征A)名稱/符號成熟rHAB)位置19到571序列描述SEQIDNO.13:((ix)C(xi)MetProAsnAlaSerProLeuTyrLysLeuLeuAsnVallieu510lieProGlyAspArglieCysThr202SHisValValLysThrThrGin3540TrpLieuValAlaValSer15Gly工leThrSerSerLys30GlyGluValAsnValThr45<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>(2)SEQIDNO.14信息:(i)序列特征(ii(iii(iv(vi(IX(ix(ix(ix(ix(ix(ixA)長度1757堿基對B)類型核酸C)鏈型單鏈D)拓樸結構線性分子類型DNA(基因組)假擬結構無反義無原始來源A)生物體流感病毒C)個體分離抹A/Shandong/9/93rHA特征A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)B)位置1到18特征A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列編碼區B)位置19到72特征A)名稱/符號Smal限制性酶切位點B)位置76到81特征A)名稱/符號成熟rHA編碼區B)位置73到1728特征A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點B)位置1735到1740特征A)名稱/符號BglII限制性酶切位點B)位置1741到1746特征A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1747到1757(xi)序列描述SEQIDNO,14:TAAAAAAACCTATAAATAATGCCCT丁GTACAAATTGTTAAACGTTTTCTGGTTGG丁CGCCSDGTTTCTAACGCGATTCCCGGGCAAGACCTTCCAGGAAATGACAACAGCACAGCAACGCTG.120TGCC丁GGGACATCATGCAGTGCCAAACGGAACGCTAGTGAAAACAATCACGAATGATCAA180ATTGAAGTGACTAATGCTAC丁GAG丁TGGTTCAGAGTTCCTCAACAGGTAGAATATGCGGC240AGTCCTCACCGAATCCTTGATGGAAAAAACTGCACACTGATAGJVTGCTCTATTGGGAGAC.300CCTCATTGTGATGGCTTCCAAAATAAGGAATGGGACCTTTTTGTTGAACGCAGCAAAGCT3S0TACAGCAACTGTTACCC丁丁ATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGCTCACTAGTTGCC420TCATCAGGCACCCTGGAG丁T丁ATCAATGAAGACTTCAATTGGACTGGAGTCGCTCAGGAT480GGGGGAAGCTATGCTTGCAAAAGAGGATCTGTTAACAG丁TTCTTTAGTAGATTGAATTGG540TTGCACAAATTAGAATACAAATATCCAGCGCTGAACGTGACTATGCCAAACAATGGCAAA600TTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGAGCACGGACAGTGACCAAACCAGC6S0CTA丁ATGTTCGAGCATCAGGGAGAGTCACAGTCTCTACCAAAAGAAGCCAACAAACTGTA720ACCCCGAATATCGGGTCTAGACCCTGGGTAAGGGGTCAG丁CCAGTAGAATAAGCATCTAT780TGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTGATAGCACAGGGAATCTAATTGCT840CCTCGGGGTTACTTCAAAATACGAAATGGGAAAAGCTCAATAATGAGGTCAGATGCACCC900ATTGGCAACTGCAGTTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAAGCATTCCCAATGACAAACCTTTTCAAAATGTAAACAGAATCACATATGGGGCCTGCCCCAGATATGTTAAGCAAAACACT1020CTGAAATTGGCAACAGGGATGCGGAATGTACCAGAGAAACAAACTAGAGGCATATTCGGC1080GCAATCGCAGGTrTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTAGACGGTTGGTACGGTTTC1140AGGCATCAAAATTCTGAGGGCACAGGACAAGCAGCAGATCTTAAAAGCACTCAAGCAGCA1200ATCGACCAAATCAACGGGAAACTGAATAGGTTAATCGAGAAAACGAACGAGAAATTCCAT1260CAAATCGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTCGAGAAATATGTT1320GAAGACACTAAAATAGATCTCTGGTCTTACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAAAACAAGGAAG1440CAACTGAGGGAAAATGCTGAGGACATGGGCAATGGTTGCTTCAAAATATACCACAAATGT1500:GACAATGCCTGCATAGGGTCAATCAGAAATGGAACTTATGACCATGATG丁,ATACAGAGACGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAAGGTGTTGAGCTGAAGTCAGGATACAAAGATTGGATCCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGCTTTTTGCTTTGTGTTGTTTTGCTGGGG1S80TTCATCATGTGGGCCTGCCA.AAAAGGCAACATTAGGTGCA.ACATTTGCATTTGAGOTACC1740;AGATCTTAATTAATTAA1757(2)SEQIDNO.15信息(i)序列特征(A)長度571氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹A/Shandong/9/93rHA(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到553(xi)序列描述SEQIDNO.15MetProLieuTyrLyslieuAsnValL>euTrpLeuValAlaValSer10ISAsnAla工leProGlyGinAspLeuProGlyAsiiAspAsnSerThrAla202530ThrLeuCysLeuGlyHisHisAlaValProAsnGlyThrIjeuValLys354045Thr工leThrAsnAspGinlieGluValThrAsiiAlaThrGluUeuVal5055SOGluSerSerSerThrGlyArg工leCysGlySerProHisArglieL>eu707580AspGlyLysAsncysThrL>eu工leAspAlalieuLieuGlyAspProHis859SCysAspGlyPheGluAsnLys(iluTrpAspLeuPheValGluArgSer100105110LysAlaTyrSerAsiaCysTyrProTyrAspValProAspTyrAlaSer115120125LeuArgSerLeuValAlaSerSerGlyThr!<euGluPhelieAsnGlu130135140AspPheTrpThrGlyValAlaGinAspGlyGlySerTyr'AlaCys145150155ISOUysArgGlySerValAsnSerPhePheSerArgLeuAsnTrplieuHis165170175LysLeuGluTyrLysTyrProAlaLeuAsnValMetPreAsnAsii180185190GlyLysAspLysLeuTyrlie200TrpGlyValHisProSerThrAspSer210AspGinThrSerLieuTyrValArgAlaSer220GlyArgValThrValSerThrLysArgSerGinGinThrValThrProAsnlieGlySer225230235240ArgProTrpValArgGlyGinSerSerArg工leSer工leTyrTrpThr245250255lieValLysPro260GlyAsp工leLeuLeu2S5lieAspSerThrGly270AsnIjeu工leAlaPro275ArgGlyTyrPheLys280工leArg"AsnGlyLys285SerSerlieMetArg290SerAspAlaProlieGlyAsnCysSerSer300GluCys工leThrProGlySerlieProAspLysProPheGinAsnValAsnArg30531D315320lieThrTyrGlyAlaCysProArgTyrValLysGinAsnThrIjSuLys325330335L>euAlaThrGlyMetArgAsnValProGluLysGinThrArgGly工le345350PheGlyAlalieAlaGlyPhe工leGluAsnGlyTrpGluGlyMetVal、35S365AspGlyTrpTyrGlyPheArgHisGinAsnSerGluGlyThrGlyGin370375380AlaAlaAspLeuLysSerThrGinAlaAlalieAspGin工leAsnGly385390400UyslieuAsnArgLeulieGluLysThrAsnGluLysPheHisGin工le405410415GluLysGluPheSerGluValGluGlyArg工leGinAspGluLys420425TyrValGluAspThrLyslieAsp440I^uTrpSerTyrAsn445AlaGluVal450AlaGluAsnGin455HisThrlieAspLeuThrAspSerGluMetAsnLysLeuPheGluLysThrLysGinArgGluAsnAla4S5470475480GluAspMetGlyAsnGlyCysPheLys工leTyrHisLysCysAspAsn485AlaCys工leGlySer工leArgAsnGlyThrTyrAspHisAspValTyr500505S10ArgAspGlu515AlaLeuAsnAsnArg520PheGin工leL<ysGly525ValGluLeuLysSerGlyTyrLysAspTrplieLeuTrpUeSerPheAla工leSer530535540CysPheLieuLeuCysValValLeuLeuGlyPhelieMetTrpAlaCys545SSO555560GinLysGlyAsnlieArgCysAsnlieCys工le56一5570(2)SEQIDNO.16信息(i)序.列特征(A)長度1814堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無反義無原始來源A)生物體流感病毒C)個體分離抹B/Shanhai/4/94rHA特征A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)B)位置1到18特征A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列編碼區B)位置19到72特征A)名稱/符號B)位置76特征A)名稱/符號B)位置82特征A)名稱/符號B)位置73特征A)名稱/符號B)位置1804到1814序列描述SEQIDNO.16:GCCCTTGTACAAATTGTTAAACGTTTTGTGGTTGGTCGCCGGGTACCGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACAGCTACTCAAGGGGAGGTCAATGTGACTGGTGTGATACCAATCTCATTTTGCAAATCTCAAAGGAACAAAGACCAGAGGGCAACTGCACAGATCTGGATGTGGCCTTGGGCAGACCAATGGGCAAAAGCTTCAATACTCCACGAAGTCAGACCTGTTACAGCACGACAGAACAAAAATCAGACAGCTACCCAATCTTCTCATTATCAACCCAAAACGTTATCAACGCAGAAAAGGCACCAAACCTCAGGATCTTGCCCTAACGCTACCAGTAGAAGCGGAGGCTGTCCCAAGGGACAACAACAAAACAGCAACGAATCCA(iv)(vi)(((ix)(ix)((ix)((ix)((ix)(C(ix)(C(xi)TAAAAAAACCTATAAATAATGTTTCTAACGCGATTCCCGGTCACC丁CATGTGGTCAAAACCTGACAACAACACCAACAAAAAACTATGCCCAAACTGTCTTGTGTCGGGACCACACCTTCTCCGGGTGCTTTCCTATAATAGAGGATATGAAAATATCAGGGAGGACCCTACAGACTTGGTTTTTCGCAACAATGGCTTG:Smal限制性酶切^f立點到81:Kpnl限制性酶切位點到87:成熟rHA編碼區到1794通用翻譯終止信號so03S0420480540&00CTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGCACATTCCATTCTGATAACAAACCCCAAATGAAATTCACCTCATCTGCTAATGGAGTAACCACAGATCAAACAGAAGACGGAGGGCTACCACAACAAAAACCTGGGAAGACAGGAACAATTGTCGTGTGG丁GCGCTAGTGGCAGGAGCAAAGTAGCAGATTGCCTTCACGAAAAATACGGTGGAGAACATGCAAAAGCCATAGGAAATTGCCCAAATGGAACCAAATATAGACCTCCTGCAAAAATTGCTGGTTTCT丁AGAAGGAGGATGGGAATCTCACGGAGCACATGGAGTGGCAGTGGCAAACAAGATAACAAAAAATCTCAATTCTTTGCTAAGTGGTGCCATGGATCAACTCCACAACGATCTCAGAGCTGACACAATAAGCTCGCAAGGAATAATAAACAGTGAAGATGAGCATCTACTGGGTCCCTCTGCTGTAGACATAGGAAATCAGACCTGCTTAGACAGGATAGCTGCTGGCACTTTTGATTCACTGAATATTACTGCTGCAACTATACTGCTCTACTACTCAACTGCTGCTATTTTTATTGTTTATATGGTCTCCAGAGACTCTTAATTAATTAAAAAGGAGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGSSOAACCTCTATGGAGACTCAAATCCTCAAAAG720CATTATGTTTCTCAGATTGGCGGCTTCCCA780AGCGGCAGAATTGTTGTTGATTACATGGTG840TATCAGAGAGGTGTTTTGTTGCCTCAAAAG900ATAAAAGGGTCCTTGCCTTTAATTGGTGAATTAAACAAAAGCAAGCCTTACTACACAGGA1020ATATGGGTGAAAACACCTTTGAAGCTTGCC1080CTATTAAAGGAAAGGGGTTTCTTCGGAGCT1140GGAATGATTGCAGGTTGGCACGGATACACA1200GCAGACCTTAAGAGTACGCAAGAAGCCATA12SOAGTGAGCTAGAAGTAAAGAATCTTCAAAGG1320GAAATACTCGAGCTGGATGAGAAAGTGGAT1380ATAGAACTTGCAGTCTTGCTTTCCAACGAAl"OTTGGCACTTGAGAGAAAACTAAAGAAAATG1500GGATGCTTCGAAACCAAACACAAG丁GCAAC1560ACCTTTAATGCGGGAGAATTTTCTCTTCCCTCTTTAAATGATGATGGATTGGATAACCATIS80TCTAGTTTGGCGGTAACATTGATGATAGCT1740AATGTTTCTTGCTCCATCTGTCTGTGAGGA18001814(2)SEQIDNO.17信息(i)序列特征(A)長度592氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片4爻類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹B/Shanhai/4/94rHA(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號肽(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到574(xi)序列描述SEQIDNO.17:MetProLeuTyrLysLeuIjeuAsnValLieuTrpIjeuValAlaVslSer151015AsnAla工leProGlyGlyThrAspArglieCysThrGly工leThrSer202530SerA^nSerProHisValValLysThrAlaThrGluGlyGluValAsn35-4045ValThrGlyVallieProIjeuThrThrThrProThrLysSerHisPhe505560AlaAsnLeuLysGlyThrLysThrArgGlyLysIjeuCysProAsnCys65707580LeuAsnCysThrAspIeuAspValAlaLeuGlyArgProMetCysVal8590GlyThrThrProSerAlaLysAlaSerlieLieuHisGluValArgPro100105110ValThrSerGlyCysPheProlieMetHisAspArgThrLyslieArg115120125GinIjeuProAsnLeuLeuArgGlyTyrGluAsn工leArgLeuSerThr130135140GinAsnVal工leAsnAlaGluLysAlaProGlyGlyProTyrArgLieu145150155ISOGlyThrSerGlySerCysProAsnAlaThrSerArgSerGlyPhePhe165170175AlaThrMetAlaTrpAlaValPr*oArgAspAsnAsnUysThrAlaThr180185190ProLeuThrValGluValProTyrlieCysThrLysGlyGluAsp195200205GinlieThrValTrpGlyPheHisSerAspAsnLysProGinMetLiys210215220AsiiLeuTyrGlyAspSerAs11ProGinLysPheThrSerSerAlaAsn225230235240GlyValThrThrHisTyrValSerGlu工leGlyGlyPheProAsdGin245250255ThrGluAspGlyGlyLeuProGinSerGlyArg工leValValAspTyr2S0265270MetValGillLysProGlyLysThrGlyThrlieValTyrGinArgGly275280285ValL>euProGlxiLysValTrpCysAlaSerGlyArgSerLysVal290295300lieLysGlySerLeuProUeulieGlyGluAlaAspCysLeuHisGlu305.310315320L>ysTyrGlyGlyLeuAsnLysSerL>ysProTyrTyrThrGlyGluHis325330335AlaLysAla工leGlyAsnCysProlieTrpValLysThrProlieuLys340345350LeuAlaAsnGlyThrLysTyrArgProProAlaLysIjeuLeuLysGlu3553S03SSArgGlyPhePhe370GlyMetlieAla385ValAlaValAla工leThrLysAsn420GinArgLeuSer43SLeuAspGluLys一450lieGluLeuAla4S5AspGluHisLeuProSerAlaVal500CysAsnGinThr515GlyGluPheSerS30SerLeuAsnAsp545SerThrAlaAlalieValTyrMet580GlyAla工leAla375GlyTrpHisGlyAlaAspLeuLys405LeuAsnSerLeuGlyAlaMetAsp440ValAspAspLeu45SValLeuLeuSer470lieuAlaLeuGlu485AsplieGlyAsnCysLeuAspArg520IaeuProThrPhe535AspGlyLteuAsp5S0SerSerLeuAlaValSer:ArgAspGlyPheLieuGlu380TyrThrSerHisSerThrGillGlu410SerGluLeuGlu425GluLeuHisAsnArgAlaAspThr460AsnGluGlylie475ArgLysLeuLys490GlyCysPheGlu505工leAlaAlaGlyAspSerlieuAsn540AsnHisThrlie555ValThrLeuMetS70AsnValSerCys585GlyGlyTrpGluGlyAlaHisGly400AlalieAsiiLys41SValLysAsnLeu430GlulieLeuGlu445lieSerSerGinlieAsnSerGlu480LysMetLieuGly435ThrLysHisLys510Thr■PheAsnAla525lieThrAlaAlaL>euLeuTyrTyr560lieAlalieP^ie575SerlieCysIjeu590(2)SEQIDNO.18信息(i)序列特征(A)長度1802i威基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹B/Harbin/7/94rHA(ix)特征(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號HA信號肽序列編碼區(B)位置19到69(ix)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點(B)位置22到27(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置70到1776(ix)特征(A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點'(B)位置1780到1785(ix)特征(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1786到1791(ix)特征(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1792到1802(xi)序列描述SEQIDNO,18:TAAAAAAACCTATAAATAATGCCCGGGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGTAGTAACA60TCCAACGCAGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACTCACCTCATGTGGTCAAA120ACAGCTACTCAAGGGGAAGTCAATGTGACTGGTGTGATACCACTGACAACAACACCAACA180AAATCTCATTTTGCAAATCTAAAAGGAACAAAGACCAGAGGGAAACTATGCCCAAACTGT240CTCAACTGCACAGATCTGGATGTGGCCTTGGGCAGACCAATOTGTGTGGGGACCACACCT300TCGGCAAAAGCTTCAATACTCCACGAAGTCAGACCTGTTACATCCGGGTGCTTTCCTATA3S0ATGCACGACAGAACAAAAATCAGACAGCTACCCAATCTTCTCAGAGGATATGAAAATATC420AGATTATCAACCCAAAACGTTATCAATGCAGAAAAAGCACCAGGAGGACCCTACAGACTT480GGAACCTCAGGATCTTGCCCTAACGCTACCAGTAGAAGCGGATTTTTTGCAACAATGGCT540TGGGCTG丁CCCAAGGGACGACAACAAAACAGCAACGAATCCACTAACAGTAGAAGTACCASOOTACGTTTGTACAGAAGGAGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGTTCCATTCTGATAACAAA"0GCCCAAA丁GAAAAACCTCTATGGAGACTCAAATCCTCAAAAGTTCACCTCATCTGCTAAT720GGAGTAACCACACATTATGTTTCTCAGATTGGCGGCTTCQCAGATCAAACAGAAGACGGA780GGGGTACCACAAAGCGGCAGAATTGTTGTTGAT^ACATGGTGCAAAAACCTGGGAAAACA840GGAACAATTGTCTATCAAAGAGGTGTTTTGT丁GCCTCAAAAGGTGTGGTGCGCGAGTGGC900AGGAGCAAAGTAATAAAAGGGTCCTTGCCTT丁AATTGGTGAAGCAGATTGCCTTCACGAA9S0aaatacggtggattaaacaaaagcaagccttactacacaggagaacatgcaaaagccata1020ggaaattgcccaatatgggtgaaaacacctttgaagcttgccaatggaaccaaatataga1080cctcctgcaaaactattaaaggaaaggggtttcttcggagctattgctggtttcttagaa1140ggaggatgggaaggaatgattgcaggttggcacggatacacatctcacggagcacatgga1200gtggcagtggcagcagacc丁TAAGAGTACGcaagaagccataaacaagataacaaaaaat1260ctcaattctttgagtgagctagaagtaaagaatcttcaaagactaagtggtgccatggat1320gaactccataacgaaatactcgagctggatgagaaagtggatgatctcagagctgacact1380ataagctcgcaaatagaacttgcagtcttgctttccaacgaaggaataataaacagtgaa1440gatgagca丁ctattggcacttgagagaaaactaaagaaaatgctgggtccctctgctgta1500gacatagggaatggatgcttcgaaaccaaacacaagtgcaaccagacctgcttagacagg15s0atagctgctggcacctttaatgcaggagaattttctctccccacttttgattcactgaat1s20AttacTGCTGcatctttaaatga丁gatggattggataatcatactatactgctctactac1s80丁caactgctgcttctagtttggctgtaacattgatgatagctatttttattgtttatatg1740gtctccagagacaatgtt丁catgctccatctgtctgtgaggtaccagatcttaattaatt1800aa1802(2)SEQIDNO.19信息i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型586氨;氨基酸單鏈(D)拓樸結構線性ii)分子類型多肽iii)假擬結構:無iv)反義無V)片^殳類型N-vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹B/Harbin/7/94rHAix)特征(A)名稱/符號HA信號肽(B)位置1到17ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA1(B)位置:18到569xi)序列4;g述:SEQIDNO.19:MetProGlyLysAlalielieValLeuLeuMetValValThrSerAsn11015AlaAspArglieCysThrGly工leThrSerSerAsnSerProHisVal202530ValLysThrAlaThrGinGlyGluValAsnValThrGlyValliePro354045LeuThrThrThrProThrLysSerHisPheAlaAsnLeuLysGlyThr5055SOLysThrArgGlyLysLeuCysProAsnCysLeuAsnCysThrAspLeuS5707580AspValAlaLeuGlyArgProMetCysValGlyThrThrProSerAlaB5SOLysAlaSerlieLeuHisGluValArgProValThrSerGlyCysPhe100105110Pro工leMetHisAspArgThrLyslieArgGinLeuProAsnLeuLeu115120125ArgGlyTyrGluAsn工leArgLeuSerThrGinAsnVallieAsnAla130135140GluLysAlaProGlyGlyProTyrArgLieuGlyThrSer*GlySearCys14S150155160ProAsnAlaThrSerArgSerGlyPhePheAlaThrMetAlaTrpAla17017SValProArgAspAspAsnLysThrAlaThrAsnProLeuThrValGlu180185ValProTyrValCysThrGluGlyGluAspGin工leThrValTrpGly20020SPheHisSerAspAsnLysAlaGinMetLysAsnLeuTyrGlyAspSer210215220AsnProGinLysPheThrSerSerAlaAsnGlyValThrThrHisTyr230235240ValSerGin工leGlyGlyPheProAspGinThrGluAspGlyGlyLeu24525025SProGinSerGlyArglieValValAspTyrMetValGinLysProGly2602S5270L*ysThrGlyThxlieValTyrGinArgGlyValIeuLeuProGinLys275280285ValTrpCysAlaSerGlyArgSerLysVal工leLysGlySerLeuPro230295300:LeulieGlyGluAlaAspCysLeuHisGluLiysTyrGlyGlyIjeuAsn305310315320LysSerLysProTyrTyrThrGlyGluHisAlaLysAlalieGlyAsn325330335CysPro工leTrpValLysThrProLeuLysLeuAlaAsnGlyThri*ys3403S0TyrArgProProAlsLysLeuLeuLysGluArgGlyPhePheGlyAla355365lieAlaGlyPheLeuGluGlyGlyTrpGluGlyMet工leAlaGlyTrp370375380HisGlyTyrThrSerHisGlyAlaHisGlyValAlaValAlaAlaAsp385390335400UeuLysSerThrGinGluAla工leAsnLyslieThrLysAsnLeuAsn405410415SerLeuSerGluLeuGluValLysAsnLieuGluArgLeuSerGlyAls420425430MetAspGluHisAsnGlulieLeuGluLieuAspGluUysValAsp435440445AspljeuArgAlaAspThrlieSerSerGinlieGluLeuAlaValLeu450455LeuSerAsnGluGlylie工leAsnSerGluAspGluHisLeuLeuAla46547047S480IjeuGluArgLysLeu485LysLysMetLieuGly490ProSerAlaValAsplieGlyAsnGlyCysPheGluThrLysHisL>ysCysAsnGinThrCysLeuSOO505510AspArglie515AlaAlaGlyThrPhe520AsnAlaGlyGluPhe525SerLeuProThrPhe530AspSerLeuAsnlie535ThrAlaAlaSerIjeu540AsnAspAspGlyLeuAspAsnHisThrlieL<euLieuTyrTyrSerThrAlaAlaSerSerS455505555S0LeuAlaValThxLeuMet工leAla工lePhelieValTyrMetValSer565570575ArgAspAsnVal580SerCysSer工leCys585Ijeu(2)SEQIDNO.20信息(i)序列特征(A)長度1757堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬結構無(iv)反義無(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離抹A/Johannesburg/33/94rHA(ix)特征(A)名稱/符號多角體蛋白mRNA先導鏈(部分)(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號肽編碼區(B)位置19到72(ix)特征(A)名稱/符號Smal限制性酶切位點(B)位置76到81(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA編碼區(B)位置73到1731(ix)特征(A)名稱/符號Kpnl限制性酶切位點(B)位置1735到1740(ix)特征(A)名稱/符號BglII限制性酶切位點(B)位置1741到1747(ix)特征(A)名稱/符號通用翻譯終止信號(B)位置1747到1757(xi)序列描述SEQIDNO,20:TAAAAAAACCTATAAATAATGCCCTTGTACAAATTGTTAAGTTTCTAACGCGATTCCCGGGCAGGACCTTCCAGGAAATGTGCCTGGGACACCATGCAGTGCCAAACGGAACGCTAGTGAATTGAAGTGACTAATGCTACTGAGCTGGTTCAGAGTTCCCAGTCCTCACCGAATCCTTGATGGAAAGAACTGCACACTGACCTCATTGTGATGGCTTCCAAAATAAGGAATGGGACCTTTTACAGCAACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTThA丁CAGGCACCCTGGAGTTTATCAACGAAAACTTCAATTGGGAAAAGCTATGCTTGCAAAAGGGGATCTGTTAACAGTTTTGCACAAATTAGAATACAAATATCCAGCGCTGAACGTGATTTGACAAATTGTACATTTGGGGGGTTCACCACCCGAGCACTATATGTCCGAGCATCAGGGAGAGTCACAGTCTCTACCAATCCCGGATATCGGGTATAGACCATGGGTAAGGGGTCAGTTGGACAATAGTAAAACCGGGAGACATACTTTTGATTAATACCTCGGGGTTACTTCAAAATACGAAATGGGAAAAGCTCAAATTGGCAACTGCAGTTCTGAATGCATCACTCCAAATGGAATTTCAAAATGTAAACAGGATCACATATGGGGCCTGCCCCACTGAAATTG。CAACAGGGATGCGGAATGTACCAGAGAAACGCAATCGCAGGTTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGAGGCATCAAAATTCTGAGGGCACAGGACAAGCTGCAGATCATCGACCAAATCAACGGGAAACTGAATAGGTTAGTCGAGAACGTTTTGTGGTTGGTCGCCGOACAACAGCACAGCAACGC丁G120AAACAATCACGAATGATCAA1B0CAACAGGTAGAATATGCGAC240TAGATGCTCTATTGGGAGAC300TTGTTGAACGCAGCAAAGCT3S0CCCTTAGGTCACTAGTTGCC420GGACTGGAGTCGCTCAGGAT480TCTTTAGTAGATTGAATTGG540CTATGCCAAACAATGGCAAA600CGGACAGTGACCAAACCAGCS60AAAGAAGCCAACAAACTGTA720CCAGTAGAATAGGCATCTAT780GCACAGGGAATCTAATTGCT840TAATGAGGTCAGATGCACCCS00GCATTCCCAATGACAAACCT3S0GATATGTTAAGCAAAACACT1020AAACTAGAGGCATATTCGGC1080TAGACGGTTGGTACGGTTTC1140TTAAAAGCACTCAAGCAGCA1200AAACGAACGAGAAATTCCAT1260CAAATCGAAAAAGAATTCTCAGAAGTAGAAGGGAGAATTCAGGACCTCGAGAAATATGTT1320GAAGACACTAAAATAGATCTCTGGTCTTACAATGCGGAGCTTCTTGTTGCTCTGGAGAAC1380CAACATACAATTGATCTAACTGACTCAGAAATGAACAAACTGTTTGAAAGAACAAGGAAG1440CAACTGAGGGAAAATGCTGAGGACATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGT1500GACAATGCCTGCATAGGGTCAATCAGAAATGGAACTTATGACCATGATGTATACAGAGAC1560GAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAAGGTGTTGAGCTGAAGTCAGGATACAAAGAT1S20TGGATTCTATGGATTTCCTTTGCCATATCATGCTTTTTGCTTTGTGTTGTTTTGCTTGGG1680TTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAGGTACC1740AGATCTTAATTAATTAA17S7(2)SEQIDNO.21信息(i)序列特征(A)長度571氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型多肽(iii)假擬結構無(iv)反義無(v)片段類型N-末端(vi)原始來源(A)生物體流感病毒(C)個體分離株A/Johannesburg/33/94rHA(ix)特征(A)名稱/符號AcNPV61K蛋白信號序列(B)位置1到18(ix)特征(A)名稱/符號成熟rHA(B)位置19到569(xi)序列描述SEQIDNO.21:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>LysSerGlyTyrLysAspTrplieLeuTrp工leSerPheAlalieSer530535540CysPheLeuLeuCysValValLeuLeuGlyPhelieMetTrpAlaCys545550555""…GinLysGlyAsn工leArgCysAsnlieCyslie5S5570560(2)SEQIDNO.22信息(i)序列特征(A)長度(B)類型(C)鏈型39堿基核酸單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.22:TGGTTGGTCGCCGTTTCTAACGCGATTCCCGGGGGTACC(2)SEQIDNO.23信息(i)序列特征(A)長度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQIDNO,23:TrpLeuValAlaValSerAsnAlalieProGlyGlyThr1510(2)SEQIDNO.24信息(i)序列特征39(A)長度(B)類型(C)鏈型43堿基對核酸單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.24(2)SEQIDNO.25信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.25:GTCGCCGTGTCCAACGCG18(2)SEQIDNO.26信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.26:TAATTGGCCAGAGAGGCC18(2)SEQIDNO.27信息(i)序列特征(A)長度39堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.27:GGGGGATCCGGTACCAGCAAAAGCAGGGGATAATTCTAT39(2)SEQIDNO.28信息(i)序列特征(A)長度38堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.28:GGGGGTACCCCCGGGGACTTTCCAGGAAATGACAACAG38(2)SEQIDNO.29信息(i)序列特征(A)長度44堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.29:(2)SEQIDNO.30信息(i)序列特征(A)長度47堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.30:GGGGAATTCGGTACCCCCGGGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGT47(2)SEQIDNO.31信息(i)序列特征(A)長度36堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.31:GGTACCCCCGGGGATCGAATCTGCACT^GGATAACA36(2)SEQIDNO.32信息(i)序列特征(A)長度50堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(xi)序列描述SEQIDNO.32:GGGGAATTCGGATCCGGTACCTCACAGACAGATGGARCAAGAAACATTGT50權利要求1.一種在培養的昆蟲細胞中的桿狀病毒表達系統中表達的重組流感HAO血凝素蛋白。2.權利要求1的蛋白，進一步包括直接偶聯到HAO蛋白上，不含間插氨基酸的桿狀病毒信號肽。3.權利要求1的蛋白，進一步包括藥用上可接受的載體以作為疫苗用藥。4.權利要求1的蛋白，進一步包括佐劑和藥用上可接受的載體，作為疫苗用藥。5.權利要求3的蛋白，其中藥用上可接受的載體是高分子傳遞系統。6.權利要求1的蛋白，其中流感病毒選自流感病毒A抹和流感病毒B抹。7.權利要求6的蛋白，其中流感病毒感染人類。8.權利要求1的蛋白，進一步包括另一種與血凝素融合的蛋白。9.權利要求8的蛋白，選自乙肝病毒蛋白、HIV蛋白、癌胚抗原和神經氨酸酶。10.—種用于制造重組流感HAO血凝素蛋白的載體，包含以下5'-〉3'序列來自桿狀病毒的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，信號肽，編碼來自一抹流感病毒的成熟血凝素的序列，翻譯終止密碼子，以及多角體蛋白RNA聚腺苷酸化信號。11.權利要求10的載體，其中信號肽是分子量約為61K的桿狀病毒蛋白，氨基酸序列列于序列表IDNO.7的前18個氨基酸。12.權利要求10的載體，其中信號肽是流感血凝素蛋白啟動子。13.權利要求10的載體，其中編碼信號肽和血凝素的序列不編碼任何間插氨基酸。14.權利要求10的載體，進一步包括編碼第二種蛋白的序列，該蛋白與血凝素以融合蛋白的形式表達。15.權利要求10的載體，轉染進培養的昆蟲細胞中。16.—種制造重組流感血凝素蛋白的方法，包括用載體感染培養的昆蟲細胞，該載體包含以下5'-〉3'序列來自桿狀病毒的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，信號肽，編碼來自選自流感病毒A株和流感病毒B抹的流感病毒的血凝素的序列，翻譯終止密碼子和多角體蛋白RNA聚腺苷酸信號，以及在營養培養基中培養細胞。17.權利要求16的方法，進一步包括從細胞中分離HAO流感血凝素蛋白，使其純度至少為95%。18.權利要求17的方法，其中經過在堿性pH下，^v非膜蛋白中分離血凝素，洗膜結合蛋白以洗脫血凝素，從其他結合于陰離子交換樹脂的其它蛋白中通過改變pH值分離血凝素，以及從其他結合于陽離子交換樹脂的蛋白中通過改變鹽濃度分離血凝素來分離該蛋白。19.一種制造載體的方法，該載體包含以下5'-〉3'序列來自桿狀病毒的多角體蛋白啟動子，ATG翻譯起始密碼子，信號肽，編碼來自一抹選自流感病毒A抹和流感病毒B抹的流感病毒的血凝素的序列，翻譯終止密碼子和多角體蛋白RNA聚&良苷酸信號，該方法包括從細胞培養基中收獲病毒，就流感病毒A抹分離病毒RNA，或就流感病毒B抹分離mRNA;合成cDNA，對來自流感病毒A抹的病毒RNA,用通用引物(5'-AGCAAAAGCAGG-3'(SEQIDNO.l)),對來自流感病毒B抹的mRNA,用隨機引物，其中5'和3'引物末端含血凝素基因中沒有的限制性酶切位點；擴增混合有血;疑素基因片^:的流感病毒A或B引物和流感病毒cDNA,產生含有完整成熟血凝素編碼序列的雙鏈DNA片段；鑒定血凝素基因的信號肽，然后擴增無信號肽的血凝素基因；和將無信號肽的血凝素基因克隆到含AcNPV多角體蛋白啟動子的載體中。20.權利要求19的方法，其中用PCR將血凝素基因克隆到載體上，從而使此載體編碼的信號肽直接連于血凝素上，不含任何間插氨基酸。21.權利要求19的方法，進一步包括將載體轉染進昆蟲細胞，選擇表達血;疑素的細胞。'22.—種針對流感病毒接種動物的方法，包括給動物施用有效量的在培養的昆蟲細胞中的桿狀病毒表達系統中表達的重組流感血凝素蛋白HAO。23.權利要求22的方法，進一步包括施用存在于高分子傳遞系統中的蛋白。24.權利要求22的方法，其中流感病毒選自流感病毒A抹和流感病毒B抹。25.權利要求22的方法，其中動物選自哺乳動物和鳥類。26.權利要求22的方法，其中動物是人。全文摘要本發明涉及生產流感血凝素多價疫苗的方法。本發明提供了使用DNA技術制備重組流感疫苗的方法。所產生的疫苗是多價的，優選三價的，基于從具有流行潛能的流感病毒克隆的重組血凝素抗原混合物的流感疫苗。重組的血凝素抗原為全長的，未被切割的(HAO)，從培養昆蟲細胞內的桿狀病毒表達載體產生，并在非變性的條件下純化的糖蛋白。在優選的實施方案中，通過切除天然的疏水信號肽序列并代之以一個新的桿狀病毒幾丁質酶信號肽來對克隆的HA基因進行修飾。還公開了用于從A亞型和B型流感病毒中純化rHA蛋白的有效提取和純化從昆蟲細胞中產生的重組HA蛋白的一般方法。文檔編號A61P31/00GK101353375SQ20081009016公開日2009年1月28日申請日期1995年5月26日優先權日1995年5月26日發明者A·I·沃茲內森斯基,B·E·維爾金森,C·S·哈克特,F·沃爾沃維茨,G·E·史密斯申請人:Mg-Pmc有限公司