一種多肽水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的應用及蛋白疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的應用及蛋白疫苗。
【背景技術】
[0002] 由自組裝多膚形成的水凝膠具有生物相容性好、生物活性高等特點和優點，相關 領域的研究是近20年的熱點。它已經在再生醫學、藥物控釋、分析檢測、組織工程等方面展 現了很高的應用前景。例如，由自組裝多膚形成的水凝膠可W應用于干細胞的定向分化、軟 骨組織的制備、抗癌藥物的可控釋放等。最近，美國芝加哥大學的化el Collier教授發現自 組裝多膚可W作為蛋白的疫苗佐劑，他們將自組裝多膚與短膚抗原或者蛋白抗原共價連接 在一起，然后與自組裝多膚按照一定的比例混合之后一起組裝成納米纖維，隨后將得到的 共組裝納米纖維在小鼠皮下進行免疫試驗。實驗結果表明：該共組裝體系產生的抗體滴度 與使用弗氏完全佐劑(CFA)時產生的抗體滴度相當，但是所述自組裝多膚本身(不含短膚抗 原和蛋白抗原)單獨使用時并不會提升抗體滴度。由于多膚極佳的生物安全性，自組裝多膚 在疫苗佐劑方面的應用具有很高的應用前景。但是現有技術需要將抗原與自組裝多膚共價 連接，大規模制備不易。疫苗佐劑是工業界疫苗研發中最為滯后的一環，截止到目前為止也 僅有一種可應用于人體的佐劑(侶佐劑），發展新型的疫苗佐劑具有重要的意義。

【發明內容】

[0003] 發明目的
[0004] 本發明的一個目的是提供一種多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的應用，該水凝膠具 有良好的生物相容性，簡便地與蛋白抗原物理混合后即能很好的刺激機體產生抗原特異性 的體液和細胞免疫應答。
[0005] 本發明的另一個目的是提供一種W上述多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的蛋白疫 苗。
[0006] 發明概述
[0007] 根據本發明的第一方面，本發明提供了一種多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的應 用，所述多膚結構式如（Ia)或（Ib)所示，
[000引
[0009]所述多膚水凝膠由結構式如（2a)或(2b)所示的憐酸化多膚水溶液在憐酸酶催化 作用下形成

[0012]上述結構式如（la)所示的多膚為L構型，結構式如Qb)所示的的多膚為D構型，憐 酸化多膚的序列為化P-GF巧Y-〇Me(pY表示憐酸化酪氨酸），結構式如（2a)所示的憐酸化多 膚序列為L構型，結構式如(2b)的憐酸化多膚為D構型。
[OOU]本發明所述憐酸化多膚均可根據現有技術自制，由FMOC-固相合成方法合成，Nap-GFFpY-OMe的合成方法及其結構可參考文獻 1 (Nanotechnology，2010，21 (22): 225606.);兩 種構型的憐酸化多膚可采用相同的合成方法，只需改用相應構型的氨基酸原料。憐酸化多 膚水溶液在憐酸酶催化作用下形成所述多膚水凝膠的方法也為公知技術。
[0014] 在本發明的第二方面，還提供了一種W上述多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的蛋白 疫苗。所述多膚水凝膠可W方便地與蛋白抗原物理混合得到蛋白疫苗。
[0015] 發明人驚奇地發現，該多膚水凝膠可簡便地與蛋白抗原物理混合得到蛋白疫苗， 負載了雞卵清蛋白（OVA蛋白）的多膚水凝膠能很好的刺激機體產生抗原特異性的體液和細 胞免疫應答。其中D構型的多膚水凝膠具有更好的佐劑效果。
[0016] 本發明的有益效果是：W生物相容性良好的水凝膠作為蛋白疫苗佐劑，其可W通 過簡便地與蛋白抗原物理混合負載蛋白抗原，負載了蛋白抗原的多膚水凝膠能很好的刺激 機體產生抗原特異性的體液和細胞免疫應答，其中D構型的水凝膠具有更好的佐劑效果。本 發明增加了免疫佐劑的種類，為開發能應用于人體的免疫佐劑提供了有價值的信息。
【附圖說明】
[0017] 圖1:不含OVA蛋白的k構型多膚水凝膠化-gel-1)和多膚水凝膠D-構型(D-gel-1) W及物理混合了 OVA蛋白的k構型多膚水凝膠化-gel-2)和D-構型的多膚水凝膠(D-gel-2) 的透射電鏡圖像。
[001引圖2:物理混合了 OVA蛋白的k構型化-ge 1 -2)、D-構型（D-ge 1 -2)多膚水凝膠W、 OVAW及混有侶佐劑的0VA(A1皿)引發免疫反應的抗體滴度。
【具體實施方式】
[0019] 下面用實施例進一步描述本發明，但所述實施例僅用于本發明而不是限制本發 明。
[0020] 實施例1
[0021] (1)根據文獻1，用FMOC-固相合成方法合成L構型憐酸化多膚Nap-GF巧Y-OMe，它的 核磁圖譜和質譜結果如下：
[0022] Ih NMR(400MHz，DMS0-d6)S8.48(d，lH，NH)，8.19-8.28(m，2H，NH)，8.06(d，lH，NH), 7.75-7.88(m，3H)，7.75(s，lH)，7.41-7.48(m，3H)，7.07-7.25(m，14H)，4.46-4.58(m，3H), 3.70-3.76(m,lH),3.6-3.68(s,4H),3.58(s,3H),2.92-3.03(m,4H),2.76-2.81(m,lH), 2.63-2.69(m，lH).MS:calc.M+ = 794.3,obsvd.(M+rfer = 817.3。
[0023] (2)取ImgL構型憐酸化多膚化p-GFFpY-OMe置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入150微升 PBS(抑=7.0)溶液，用碳酸鋼溶液將其抑值調節至7.0，在20~25°C下加入2微升2U/微升的 堿性憐酸酶，用PBS溶液定容于250微升，靜置約10分鐘后成膠，待反應基本完全(約2小時） 即得多膚水凝膠。所述多膚結構式如（Ia)所示；
[0024] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到(2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液定容 于500微升，進行物理混合，得到的混合物可作為蛋白疫苗（最終多膚的濃度為2mg/mL，0VA 蛋白濃度為〇.2mg/mL)。
[0025] 實施例2
[0026] (1)改用D構型的氨基酸原料，根據文獻1，用FMOC-固相合成方法合成D構型憐酸化 多膚Nap-GFFp Y-OMe,它的核磁圖譜和質譜結果如下：
[0027] 1hNMR( 300MHz，DMSO-ds) S8.50 (d，IH，畑），8.16-8.24 (m，2H，畑），8.10 (d，IH，NH)， 7.72- 7.85(m，3H)，7.74(s，lH)，7.40-7.46(m，3H)，7.08-7.24(m，14H)，4.47-4.59(m，3H), 3.72- 3.75(m,lH),3.58-3.68(s,4H),3.60(s,3H),2.90-3.04(m,4H),2.73-2.85(m,lH), 2.62-2.68(m,lH).MS:calc.M+ = 794.3,obsvd.(M+H)" = 795.3.
[002引 （2)取Im曲構型憐酸化多膚化P-GFFpY-OMe置于1.5毫升的玻璃瓶中，加入150微升 PBS(抑=7.0)溶液，用碳酸鋼溶液將其抑值調節至7.0，在20~25°C下加入2微升2U/微升的 堿性憐酸酶，用PBS溶液定容于250微升，靜置約10分鐘后成膠，待反應基本完全(約2小時） 即得多膚水凝膠。所述多膚結構式如（Ib)所示；
[0029] (3)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到(2)中制得的水凝膠中，用PBS溶液定容 于500微升，進行物理混合，得到的混合物可作為蛋白疫苗（最終多膚的濃度為2mg/mL，0VA 蛋白濃度為〇.2mg/mL)。
[0030] 用透射電鏡觀察實施例1中多膚水凝膠化-gel-1)和蛋白疫苗化-gel-2)、W及實 施例2中多膚水凝膠化-gel-1)和蛋白疫苗(D-gel-2)的凝膠形態，如圖1所示。結果表明，對 于本發明所述UD構型的多膚結構，加入OVA蛋白前后水凝膠里面的納米纖維形貌改變不 大，說明OVA蛋白是物理包裹在多膚水凝膠里面，并沒有和多膚一起共組裝成纖維。
[0031] 對比例1
[00創 （1)取40mg/mL的侶佐劑62.5微升，用PBS(pH = 7.0)溶液定容至250微升，得到侶佐 劑溶液。
[00削 （2)取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（1)中制得的侶佐劑溶液，用PBS溶液定 容于500微升，進行物理混合，得到的混合物可作為蛋白疫苗。（最終侶佐劑的濃度為5mg/ HiL，OVA 蛋白濃度為 0.2mg/mL)
[0034] 對比例2
[0035] 取5mg/mL的OVA蛋白溶液20微升，用PBS(抑= 7.0)溶液定容至500微升，得到不含 佐劑的蛋白疫苗(最終OVA蛋白濃度為0.2mg/mL)。
[0036] 免疫實驗
[0037] (1)小鼠第一次免疫
[0038] 取6-8周的小鼠，W第一次注射時間記為0天，取實施例1、實施例2、對比例1、對比 例2中制得的蛋白疫苗分別W每只老鼠100微升的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0039] (2)小鼠第二次免疫
[0040] 在第14天的時間點，取實施例1、實施例2、對比例1、對比例2中制得的疫苗分別W 每只老鼠100微升的劑量在小鼠腹股溝處進行皮下注射。
[0041 ] (3)抗體滴度的測量
[0042] 在第21天的時候取小鼠血清，用Elisa的方法并使用紫外分光光度計進行相應抗 體滴度的測量。結果如圖2所示。
[0043] 從圖2中的結果看出：與不含佐劑的OVA蛋白組(對比例2)對比，使用L構型多膚水 凝膠和OVA蛋白的組(實施例1)可提高抗體滴度209倍，使用D構型多膚水凝膠和OVA蛋白的 組(實施例2)可提高622倍，而使用侶佐劑和OVA蛋白的組(對比例1)僅可提高163倍。
【主權項】
1. 一種多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的應用，其特征在于，所述多膚序列為:化P-GFFY- OMe O2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述多膚結構式如（Ia)或（Ib)所示，3. 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述多膚水凝膠與蛋白抗原物理混合得 到蛋白疫苗。4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述蛋白疫苗中，所述蛋白抗原與多膚的摩 爾比為(1~2):10。5. 如權利要求1~4中任一項所述的應用，其特征在于，所述多膚結構式如（Ib)所示。6. -種蛋白疫苗，W多膚水凝膠作為蛋白疫苗佐劑，其特征在于，所述多膚序列為:化P-GFFY-OMe。7. 如權利要求6所述的蛋白疫苗，其特征在于，所述多膚結構式如（Ia)或（Ib)所示，8. 如權利要求6或7所述的蛋白疫苗，其特征在于，所述多膚水凝膠與蛋白抗原物理混 合得到蛋白疫苗。9. 如權利要求8所述的蛋白疫苗，其特征在于，所述蛋白疫苗中，所述蛋白抗原與多膚 的摩爾比為(1~2):10。10. 如權利要求6~9中任一項所述的蛋白疫苗，其特征在于，所述多膚結構式如（Ib)所 /J、- O
【專利摘要】本發明提供了一種多肽水凝膠作為蛋白疫苗佐劑的應用及蛋白疫苗，該水凝膠具有良好的生物相容性，簡便地與蛋白抗原物理混合后即能很好的刺激機體產生抗原特異性的體液和細胞免疫應答。所述應用中，所述多肽序列為Nap-GFFY-OMe。
【IPC分類】A61K39/39, A61K39/00
【公開號】CN105497891
【申請號】CN201510976962
【發明人】楊志謀, 王玲, 楊成彪, 王懷民
【申請人】南開大學
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月23日