一種關于hpv病毒的新型佐劑疫苗組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及以磷酸鈣-聚合物復合顆粒為佐劑的疫苗組合物，及該疫苗組合物的 制備方法及其在藥中的用途。本發明尤其針對由HPV蛋白制成的疫苗組合物及其在治療或 預防HPV病毒藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 人乳頭瘤病毒（Humanpapillomaviruses，HPV)是無囊膜的雙鏈DNA病毒，主要由 病毒外殼和基因組DNA組成（King，Adamsetal.2012)。HPV病毒外殼是由360個L1蛋白 (形成72個五聚體）和至多72個L2蛋白構成的二十面體結構，直徑55_60nm(Howleyand Lowy2007)。病毒外殼蛋白具有自組裝特性，在體外L1蛋白單獨或與L2蛋白共同自組裝 形成類病毒樣顆粒（Virus-likeParticle，VLP)(Chen，Garceaetal.2000，Clementsand Griffiths2002,Chen，Nietal. 2011，WangandRoden2013)。目前的HPV疫苗都是以 VLP作為靶抗原，已有兩種基于HPVLIVLP預防性疫苗上市，均以鋁鹽為佐劑（Jansenand Shaw2004,HowleyandLowy2007,Buonaguro,Torneselloetal. 2009,Harper2009, Frazer,Leggattetal. 2011,Hariri,Dunneetal. 2011,Malagon,Droletetal. 2012, LehtinenandDillner2013，Shaw2013)。2006 年 6 月 8 日，美國食品與藥品管理局 (FDA)正式批準美國Merck公司生產的GardasilHPV預防性疫苗上市；它是由釀酒酵母表 達并純化的HPV16/18/6/11LIVLP四價宮頸癌預防性疫苗，以無定形羥基磷酸鋁硫酸鹽 (amorphousaluminumHydroxyphosphatesulfate，AAHS)為佐劑，被批準用于預防 6 ~26 歲女孩和婦女HPV16、18、6、11型感染所引起的宮頸癌、癌前病變和生殖器疣，這是FDA通 過的世界上第一個腫瘤疫苗（Villa，Costaetal· 2005，Villa，Aultetal· 2006，Bryan 2007,Olsson,Villaetal. 2007,GoldstoneandVuocolo2012) 〇 隨后英國葛蘭素史 克（GSK)公司生產的商品名為Cervarix的HPV預防性疫苗也成功上市，它是由來源于昆 蟲表達系統的HPV16/18LIVLP二價宮頸癌預防性疫苗，采用AS04佐劑（氫氧化鋁復合 MPL)(Paavonen,Jenkinsetal. 2007,Garcon,Moreletal. 2011,Kreimer,Gonzalezet al· 2011,Szarewski2012) 〇
[0003] 佐劑是指能非特異性地改變或增強機體對抗原的特異性免疫應答，而本身并無抗 原性的物質，又稱免疫佐劑或抗原佐劑。傳統疫苗直接來源于細菌和病毒，具有較高的免 疫原性，但存在較大的安全性問題。隨著生物技術的高速發展，利用基因重組、生物合成及 化學合成獲得的亞單位疫苗、合成肽疫苗等，結構簡單，易于純化，安全穩定，但是抗原的免 疫原性減弱，難以誘導良好的免疫保護性應答，必須添加免疫佐劑來增強免疫效果（Singh andSrivastava2003,Zepp2010)〇
[0004] 目前，磷酸鈣、MF59、鋁佐劑在歐洲許多國家已經被批準用于人類疫苗（Singh, Carlsonetal· 1998,He，Mitchelletal· 2000)。鋁佐劑是目前應用最為廣泛的一類佐 劑，也是長期以來一度是被美國食品和藥品監督管理局（FDA)批準用于人類疫苗的唯一 佐劑（Glenny，Popeetal· 1926，GuptaandSiber1995，Gupta1998，Baylor，Eganet al. 2002,ClementsandGriffiths2002,Lindblad2004,Lindblad2004)。盡管鋁佐劑 可以有效增強免疫應答，但也存在一些不足。鋁佐劑僅在注射部位形成貯庫效應（Gupta， Changetal. 1996,Hem2002,Verdier,Burnettetal. 2005,HemandHogenEsch2007, 1^〇6，6代6116七31.2010)，通過炎癥反應吸引樹突狀細胞（0(])(]\1〇代1161(1，3〇1?)1〇￥81^6七 al. 2005,Kool,Soullieetal. 2008,Sharp,Ruaneetal. 2009,Flach,Ngetal. 2011, Ghimire，Bensonetal· 2012)、巨嗤細胞（Μφ) (Hamilton,Byrneetal· 2000，Jordan, Millsetal· 2004，Rimaniol，Grasetal· 2004，Rimaniol，Grasetal· 2007)等抗原呈 遞細胞（antigen-presentingcell,APC)，這些細胞通過吞嗤作用攝取抗原并經NLRP3炎 性小體激活免疫應答（DeGregorio，Trittoetal.2008，Dostert，Petrillietal· 2008， Eisenbarth,Colegioetal· 2008,FranchiandNunez2008,Kool,Petrillietal.2008, Li,Willinghametal. 2008,Cassel,Jolyetal. 2009,Demento,Eisenbarthetal. 2009, Duewell，Konoetal.2010，Davis，Wenetal· 2011)。同時，錯佐劑通過刺激IL-10 分泌等 機制對細胞免疫產生抑制作用（Chen，Nietal. 2011)，而對于病毒感染而言，細胞免疫效 果將發揮更好地免疫保護和免疫防治作用（(VHaganandValiante2003，Demento，Cuiet al. 2012,LevitzandGolenbock2012,Olive2012,Cain,Sandersetal. 2013,HogenEsch 2013)。而且，鋁佐劑可引起IgE介導的過敏反應（如注射部位肉芽腫）以及神經系統不 良反應等，從而引起人們對錯佐劑安全性的擔憂（Petrik，Wongetal.2007,Bystrianyk 2009,ShawandPetrik2009,Munks,McKeeetal. 2010,TomljenovicandShaw2011) 〇 另外，錯佐劑對流感（AtmarandKeitel2009)、痕疾（Lew,Andersetal_1988，Schwartz， Brownetal· 2012)、單皰瘆病毒（Geerligs，Weijeretal· 1989)誘導的佐劑免疫效應比 較微弱。為此，需要針對HPV抗原的候選疫苗開發新型免疫佐劑（CampoandRoden2010， MarianiandVenuti2010,Chen,Nietal. 2011,Foged2011,Gattoc,Nairetal.2013, Koff，Burtonetal.2013，Shaw2013，Tomlenovic，Spinosaetal.2013)。新型免疫佐劑的 設計思路應具有較低的副作用，增強免疫耐受，同時誘導體液免疫應答、細胞免疫應答和粘 膜免疫應答。而且具備生物可降解性，相容性，安全性的優點，且易于制備。另外，理想的佐 劑可以有選擇性的激發免疫應答，例如由CD4+T細胞介導的Thl型細胞免疫應答和由CD8+T 介導的細胞免疫應答，并具有對抗原的廣譜性和等效適用性（He，Mitchelletal. 2000)。
[0005] 磷酸鈣作為天然骨骼的主要礦物成分，具有優越的的生物相容性、生物可降解性、 生物活性（deGroot1983，Aoki1991，Goto，Katoetal.l993，LeGeros2008)。在歐洲一 些國家，磷酸1丐已經作為佐劑，已經被批準用于疫苗佐劑（Aggerbeck，Fengeretal. 1995， Gupta1998，Jiang,Premachandraetal· 2004)，例如用于預防白喉、破傷風疾病，以及過 敏原的脫敏治療。磷酸鈣佐劑可以誘導有效的細胞免疫應答和細胞毒性T淋巴細胞免疫效 應，從而彌補鋁鹽佐劑只能誘導微弱的或抑制細胞免疫方面的不足。