Trop2嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種Trop2特異性嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞，T淋巴細胞表面表達Trop2特異性嵌合抗原受體，其中Trop2特異性嵌合抗原受體由人抗Trop2單鏈抗體，人IgG1分子FC區的CH2CH3，CD28的胞內區，CD137的胞內區，及CD3ζ的胞內區串聯構成。本發明還公開了上述Trop2特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。本發明還公開了上述T淋巴細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【專利說明】
Trop2嵌合抗原受體修飾的T淋己細胞及其應用
技術領域
[0001] 本發明設及細胞免疫技術領域，尤其設及一種Trop2特異性嵌合抗原受體修飾的T 淋己細胞及其應用。
【背景技術】
[0002] T淋己細胞介導的針對腫瘤的特異性免疫反應在機體清除腫瘤細胞的的反應過程 中發揮重要作用。但是由于宿主的免疫耐受W及腫瘤的局部免疫抑制微環境等因素的影 響，T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用常常受到限制。研究發現，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor ,CAR)修飾的T細胞技術能夠有效提高T淋己細胞在體內的增值能力、存 活時間W及對腫瘤的祀向殺傷作用，成為新近熱口的細胞免疫治療技術之一。CAR包含胞外 區即針對腫瘤抗原的特異性受體、跨膜區及胞內共刺激信號區。W胞內共刺激信號區的演 變，將CAR分為五代:第一代CAR只含有一個胞內的信號分子為CD3C或化ERI 丫。第二代CAR增 加了一個協同共刺激因子;第S代CAR含有兩個協同共刺激因子;而第四代CAR引入細胞因 子、自殺基因等;現在的第五代CAR為敲除T淋己細胞TCR和CD52的通用CAR。
[0003] 目前腫瘤過繼免疫治療主要有NK細胞，DC-CIK、基因修飾T細胞等，其中DC-CIK，NK 等治療方法因難W在體外制備、殺瘤效果不理想等因素限制了其在臨床上的應用。基因修 飾技術改造T淋己細胞主要有TCR轉基因技術和CAR修飾T細胞(CART)技術。TCR轉基因技術 是指將腫瘤特異性的TCR基因通過載體整合到T細胞中，從而使受體T細胞表達腫瘤特異性 TCR，獲得抗原特異性。但是TCR修飾的T細胞發揮作用受血1邱良制且只能識別蛋白類抗原，對 糖、糖脂類抗原無作用。另外，轉基因TCR可能與T細胞內源性產生的TCR基因發生錯配，存在 潛在風險。CAR修飾T細胞表達CAR分子，通過CAR分子識別相關的腫瘤表面抗原來特異性殺 傷腫瘤細胞。運種改造的T細胞除了具有更好祀向性、更強的增值能力、殺傷能力和更長的 存活時間外還不受主要組織相容性復合體的限制(MHC)，并且能夠W蛋白質、糖W及糖脂作 為祀點。
[0004] 人滋養層細胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2，化〇口- 2)是一種單次跨膜的表面糖蛋白，在人正常組織中不表達或者低表達，但是被發現在多種 上皮癌中過表達，例如宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等，是一種與多種腫瘤的侵襲行為 密切相關的腫瘤相關抗原，有促進腫瘤細胞侵襲和轉移的作用，可W作為許多惡性腫瘤祀 向治療的祀點。

【發明內容】

[0005] 基于【背景技術】存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種化op2特異性嵌合抗 原受體修飾的T淋己細胞。
[0006] 本發明的目的還在于提供上述化op2特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序 列。
[0007] 本發明的目的還在于提供上述化op2特異性嵌合抗原受體修飾的T淋己細胞的應 用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明提出的一種Trop2特異性嵌合抗原受體修飾的T淋己細 胞，所述T淋己細胞表面表達所述化op2特異性嵌合抗原受體。
[0009] 優選地，所述TropS特異性嵌合抗原受體由人抗化op2單鏈抗體，人IgGl分子FC區 的C肥C冊，CD28的胞內區，CD137的胞內區，及CD3C的胞內區串聯構成。
[0010] 優選地，所述Trop2特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011]優選地，所述化op2特異性嵌合抗原受體的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012] 優選地，所述人抗化op2單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013] 優選地，所述人抗化op2單鏈抗體的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014] 優選地，所述人抗化op2單鏈抗體的重鏈分子和輕鏈分子之間有一個連接膚，其氨 基酸序列為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
[001引優選地，人IgGl分子FC區的C肥C冊，CD28的胞內區，CD137的胞內區，及CD3C的胞內 區串聯構成的結構為信號傳導結構域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016] 優選地，所述信號傳導結構域的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0017] 本發明提出的上述化op2特異性嵌合抗原受體修飾的T淋己細胞在制備抗腫瘤藥 物中的應用。
[0018] 本發明根據實驗室從全人源抗體庫篩選出化op2抗體化b，經過密碼子優化，在5' 端加上信號膚，全基因合成嵌合抗原受體Trop2-ScFv-CH2C冊-CD28-CD3C，并將合成的ScFv 序列克隆到逆轉錄病毒載體中，構建出抗人化〇p2-CAR表達質粒。再通過Gateway重組克隆 技術將合成的CD137片段克隆到化op2-ScFv-C肥C冊-CD28-CD3C中，即獲得本發明的嵌合抗 原受體 Trop2-ScFv-C肥 C冊-CD28-CD137-CD3C。
[0019] 利用該嵌合抗原受體與逆轉錄病毒的包裝質粒RD114env在GP293T細胞中對病毒 進行包裝，利用此逆轉錄病毒感染T淋己細胞，使T細胞表達該嵌合抗原受體。將獲得的CART 細胞在體外與腫瘤細胞共培養，通過流式細胞術檢測CART細胞表面抗原表達情況，CCK8法 檢測該CART細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷活性，W證實該嵌合抗原受體修飾的T淋己細胞 對腫瘤的特異性殺傷作用。因此本發明所述的嵌合抗原受體Trop2-ScFv-CH2CH3-CD28- CD137-CD3C可W在相關腫瘤治療中得到應用。
[0020] 本發明提供的嵌合抗原受體lYopS-ScFy-C肥C冊-CD28-CD137-CD3C采用了逆轉錄 病毒技術，可體外感染人T淋己細胞，所獲得的CART細胞可W通過CAR的單鏈抗體部分特異 性識別表達化〇p2的腫瘤細胞，同時激活CART細胞，使其釋放多種細胞因子，實現對腫瘤細 胞的特異性殺傷作用。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發明實施例1所得化〇p2-scFv可變區序列條帶的電泳圖，其中1為SOOkD核 酸分子量標準，2為hopS-ScFv Vk序列部分，3為hopS-ScFv VH序列部分。
[0022] 圖2為本發明實施例1所得Trop2特異性嵌合抗原受體目的片段的電泳圖，其中1為 DLlOOOOkD核酸分子量標準，2為未酶切的CAR載體，3為CAR載體經XbaI和Bam HI酶切釋放的 逆轉錄病毒載體，4為CAR載體經Xba巧日Bam HI酶切釋放的Trop2-ScFv-CH2畑3-CD28- CD137-CD3G。。
[0023] 圖3為本發明實施例2中采用Western Blotting檢測本發明所得化op2特異性嵌合 抗原受體轉染293T細胞后的表達，其中1為轉染CD19-CAR的載體的293T細胞，2為轉染 Trop2-CAR的載體的293T細胞，3為對照的293T細胞。
[0024] 圖4為Western Blotting檢測不同的對數生長期腫瘤細胞中化op2的表達，其中1 為冊8910細胞蛋白，2為SK0V3細胞蛋白，3為A375細胞蛋白。
[0025] 圖5為本發明所得Trop2特異性嵌合抗原受體修飾的T細胞對腫瘤細胞的殺傷檢 測。
[0026] 圖6為本發明所得化op2特異性嵌合抗原受體修飾的T細胞在受到化op2抗原刺激 后IFN-丫的表達。
【具體實施方式】
[0027] 下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0028] 實施例1:化op2特異性嵌合抗原受體慢病毒載體的構建
[0029] 1.根據本實驗室隧菌體展示技術篩選到的抗化op2胞外區的人化b序列的VH鏈和V K鏈的氨基酸序列，利用化timumGeneTM基因設計軟件優化密碼子序列，在不改變氨基酸序 列的情況下使其更適合人的表達系統。在VH和Vk之間加入連接膚，構建獲得的嵌合抗原受 體的5〇。巾部分結構為:￥1〇-(617456')3-￥化對應的核酸序列如56〇10^.4)，該片段合成后 克隆在pU巧7載體中，連接處引入甜a巧郵am HI酶切位點，載體命名為:pUC57-Trop2-ScFv
[0030] 2.Trop2-scFv-pUC57用限制性內切酶NcoI和BamH I酶切，酶切體系如下：2iig Trop2-scFv-pUC57、化L Ncol、化L BamH I、化L IOX酶切緩沖液，用水補到20化，37°C水浴 中過夜，酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下切取目的條帶，采用DNA凝膠回收試劑 盒(AXYGEN公司）回收目的片段;其結果如圖1所示，pUC57-Trop2-ScFv載體經化Ol和BamH I 酶切釋放目的條帶。
[0031] 用同樣的方法NcoI和BamH I酶切PSFG-CH2C冊-CD28-CD3C載體，用瓊脂糖凝膠電 泳，回收目的片段。將回收后的化〇p2-ScFv與酶切載體通過T4DNA連接酶連接，反應體系如 下：2化化op2-ScFv、2化載體酶切產物、化L 10 X連接緩沖液、1化連接酶，用水補到10化， 16°C水浴中過夜。取連接產物加入到DH5a感受態中[參考《分子克隆》第=版中大腸桿菌感 受態制備(CaCb法）]，放置37°C細菌培養箱中過夜培養。挑取單個菌落，擴大培養，提取陽 性克隆的質粒，經酶切和測序，將正確的載體命名為Trop2-scFv-C肥C冊-CD28-CD3C。.
[0032] 3通過gateway重組技術將CD137的序列克隆到lYopS-scFy-CHSC冊-CD28-CD3C的 CD28和CD3C分子之間，（技術方法參考申請號為201310053109的《嵌合抗原受體及其用途》， 【公開日】為2013年06月12日，公開號為103145849A)。質粒構建完成后用Xba I和Bam HII進行 酶切鑒定，其結果如圖2所示。由圖2可知：陽性克隆能釋放目的條帶。再進行測序驗證，其測 序結果正確。
[0033] 實施例2: Trop2特異性嵌合抗原受體表達鑒定
[0034] 參照無內毒素質粒大提試劑盒內（天根生物）的操作說明書提取逆轉錄病毒載體 Trop2-scFv-CH2C冊-CD28-CD137-CD3C，提取的質粒，用PI轉染試劑轉染到人胚腎細胞293T 中，4化后，用PBS洗一遍，用細胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細胞，提取轉染后的293T細胞的 蛋白經10 %的SDS-PAGE進行分離后，恒流(300mA，化)轉印至PVDF膜上，用抗CD3C (1:1000) 抗體解育，4°C解育過夜。用PBST洗涂3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗（1:5000)室溫解育Ih。加 入E化顯色后，用Bio-Rad公司的化emiDoc XRS System進行成像，其結果如圖3所示。
[0035] 由圖3可知：本發明所構建的重組質粒能夠檢測到目的條帶的表達，大小與陽參 CD19-致，而未轉染的293T細胞沒有條帶。
[0036] 實施例3:化op2特異性嵌合抗原受體修飾的T淋己細胞的制備
[0037] 1.含抗化op2嵌合抗原受體慢病毒的包裝
[0038] 用無內毒素質粒大提試劑盒內（天根生物）的操作說明書提取逆轉錄病毒包裝質 粒PRD114和lYopS-scFv-CHSCHS-CDSS-CDlSy-CDSC逆轉錄病毒質粒在LB培養基中大量培 養，用無內毒素質粒大提試劑盒內（天根生物）的操作說明書大量提取質粒。將質粒共轉染 至化P-293T細胞中，轉染后4她收集細胞上清，40(K)rpm離屯、IOmin。收集上清，用0.45皿的濾 膜過濾，-80°C分裝凍存。
[0039] 2. T淋己細胞的制備
[0040] 采取20mL健康志愿者的新鮮抗凝血，用淋己分離液(GE公司）分立外周血單核細胞 (PBMC)。分離后的細胞用CD3和CD28平板刺激4她，用T淋己細胞培養基GT-T55UTAKARA公 司）加1:5000IL2進行誘導培養，得到T淋己細胞。
[0041 ] 3. CAR-T細胞的制備
[0042] 用50yg/mL的RetroNectin(TAKARA公司）包被非組織培養板24孔板，每孔加入50化 L，4°C過夜。每孔再加入500化病毒上清，37°C解育30min。去除病毒上清，再加入50化L病毒 上清，37°C解育30min，除病毒上清，每孔加入1. SmL病毒上清，再加入0.5mL稀釋后的T淋己 細胞。從而獲得化〇p2-scFv-C肥C冊-CD28-CD137-CD3CT細胞即hops特異性CAR-T細胞。
[0043] 實施例4:化op2特異性CAR-T細胞對化op2相關腫瘤的殺傷作用
[0044] 1.Western Blotting檢測腫瘤細胞中Trop2的表達
[0045] 選取對數生長期的卵巢癌細胞冊8910、卵巢癌細胞SK0V3和黑色素瘤細胞A375,用 細胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細胞，提取細胞蛋白，進行WesternBlotting檢測，檢測結果 如圖4所示。
[0046] 2. CAR-T細胞對腫瘤的殺傷力檢測
[0047] 將腫瘤細胞用培養基調整到5 XioVmL,每孔50化，按E:T(效應細胞和祀細胞比） 為16:1、8:1、4:1、2:1，分別加入腫瘤細胞2.5 X 1〇6個、1.25 X 1〇6個、6.25 X 1〇5個、3.125 X IO5個;待細胞完全貼壁后，收集T細胞和CAR-T細胞，調整細胞濃度為1 X lOVmL，每孔50化， 培養12h。棄上清加入10化L 10倍稀釋的CCK8,解育4~6小時，酶標儀檢測0D450的吸光值。 [004引上述腫瘤細胞為卵巢癌細胞冊8910、卵巢癌細胞SK0V3和黑色素瘤細胞A375。
[0049] 檢測結果如圖5所示:CAR-T細胞對化op2高表達的卵巢癌細胞H08910的殺傷率高 于化op2低表達的的卵巢癌細胞SK0V3,而對化op2低表達的卵巢癌細胞SK0V3的殺傷率又高 于未能檢測到化〇p2表達的黑色素瘤細胞A375。另外CAR-T細胞對腫瘤細胞殺傷作用高于T 細胞，高于單純培養基。
[0050] 3.ELISPOT檢測CAR-T細胞在受至ljTrop2抗原刺激后IFN- 丫的表達
[0051] 用無菌包被液稀釋IFN-丫抗體后加入化ISP0T(Millipore，Cat.No.MAIPS4510)平 板中，每孔10化L，4°C放置過夜。第二天用無菌的包被液將平板洗涂2遍。每孔加入20化L完 全培養基，室溫封閉比。洗去含血清的細胞培養液RPMI-1640,用PBS洗S遍。準備化op2胞外 區多膚，稀釋在含血清的細胞培養液RPMI-1640,調至終濃度化g/ml。每孔10化L。調整待檢 測CAR-T細胞濃度為1 X lOVmL，每孔加入100化，37°C，5 %C〇2放置2地，棄去細胞及培養基， 用ELISPOT洗涂液洗涂3遍。每孔加入生物素標記的檢測抗體，10化L/孔，4°C放置過夜。再用 ELISPOT洗涂液洗涂4遍。每孔加入HRP標記的親和素，100化/孔，室溫放置45min。用化ISPOT 洗涂液洗涂3遍后，用PBS洗涂2遍。每孔加入10化L ACE顯色底物，室溫顯色20~60min。待出 現明顯集落點后，用無菌水洗涂3遍終止反應。空氣中驚干平板，用化ISPOT讀板機計算形成 的斑點數如圖，其結果如圖6所示。由圖6可知:結果表明CAR-T細胞在特異性Trop2抗原刺激 下能夠分泌IFN-丫。
[0052] W上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明掲露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加 W等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種Trop2特異性嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞，其特征在于，所述T淋巴細胞表面 表達所述Trop2特異性嵌合抗原受體。2. 根據權利要求1所述T淋巴細胞，其特征在于，所述Trop2特異性嵌合抗原受體由人抗 Trop2單鏈抗體，人IgGl分子FC區的CH2CH3，CD28的胞內區，CD137的胞內區，及0)3ζ的胞內 區串聯構成。3. 根據權利要求1或2所述T淋巴細胞，其特征在于，所述Trop2特異性嵌合抗原受體的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 根據權利要求1-3任一項所述T淋巴細胞，其特征在于，所述Trop2特異性嵌合抗原受 體的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。5. 根據權利要求1-4任一項所述T淋巴細胞，其特征在于，所述人抗Trop2單鏈抗體的氨 基酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. 根據權利要求1-5任一項所述T淋巴細胞，其特征在于，所述人抗Trop2單鏈抗體的核 酸序列如SEQ ID NO.4所示。7. 根據權利要求1-6任一項所述T淋巴細胞，其特征在于，所述人抗Trop2單鏈抗體的重 鏈分子和輕鏈分子之間有一個連接肽，其氨基酸序列為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser〇8. 根據權利要求1-7任一項所述T淋巴細胞，其特征在于，人IgGl分子FC區的CH2CH3， CD28的胞內區，CD137的胞內區，及CD3G的胞內區串聯構成的結構為信號傳導結構域，其氨 基酸序列如SEQ ID NO.5所示。9. 根據權利要求8所述T淋巴細胞，其特征在于，所述信號傳導結構域的核酸序列如SEQ ID NO .6所示。10. 如1-9任一項所述T淋巴細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/17GK105925536SQ201610483208
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】朱進, 馮振卿, 許國貞, 劉振云, 唐小軍, 唐奇, 徐亞如
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司