具有針對T細胞受體beta恒定區的抗原結合域的嵌合抗原受體(CAR)的制作方法
【專利摘要】本公開涉及嵌合抗原受體(CAR)，其包含選擇性結合TCR beta恒定區1(TRBC1)或TRBC2的抗原結合域；細胞；包含此類CAR的此類T細胞；以及此類細胞用于受試者中T細胞淋巴瘤或白血病的治療的用途。
【專利說明】具有針對T細胞受體beta恒定區的抗原結合域的嵌合抗原受 體(CAR) 發明領域
[0001 ]本發明涉及在T細胞淋巴瘤或白血病的治療中有用的細胞和試劑。
[0002] 發明背景
[0003] 淋巴樣惡性腫瘤在很大程度上可以分為來源于T細胞或B細胞的那些。T細胞惡性 腫瘤是臨床上和生物學上異質性的病癥組，總共包括10-20%的非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤 和20 %的急性白血病。最普遍的經鑒定的病理亞型是外周T細胞淋巴瘤，非特指型 (peripheral T-cell lymphoma，not otherwise specified)(PTCL_N0S);血管免疫母細胞 1'細胞淋巴瘤（&叫;[0-;[1]11111111〇131&81:;[(3 1'-0611171]^11〇1]1&，4111^)和間變性大細胞淋巴瘤 (anaplastic large cell lymphoma,ALCL)。在所有急性淋巴母細胞白血病(ALL)中，約 20 %是T細胞表型的。
[0004] 與例如B細胞惡性腫瘤相比，這些狀況通常表現為侵襲性的，其中估算的5年存活 率為僅30%。在T細胞淋巴瘤的情況下，它們與高比例的呈現播散性疾病（disseminated disease)的患者，不利的國際預后指標（International Prognostic Indicator)(IPI)評 分和結外(extra-nodal)疾病的盛行相關。單獨化療通常不是有效的，且少于30%的患者使 用目前的治療得到治愈。
[0005] 此外，不像B細胞惡性腫瘤，其中免疫療法例如抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗 (rituximab)具有顯著改善的結果，目前不存在同等有效的，最低限度毒性的免疫療法可用 于T細胞惡性腫瘤的治療。開發用于T細胞病癥的免疫療法的重大困難是克隆性和正常T細 胞的標志物表達的相當多的重疊，其中沒有單個抗原明確地能夠鑒定克隆性(惡性)細胞。
[0006] 當靶向全B細胞抗原以治療B細胞惡性腫瘤時存在相同的問題。然而，在這種情況 下，對B細胞區室的伴隨的耗竭導致相對輕微的免疫抑制，這是易于被大多數患者忍受的。 此外，在導致特別是正常B細胞區室的長期耗竭的療法中，其喪失可以在很大程度上通過施 用匯集的免疫球蛋白來消除。當靶向T細胞惡性腫瘤時，情況完全不同。這里，T細胞區室的 伴隨耗竭導致嚴重的免疫抑制和嚴重的毒性。此外，不存在令人滿意的方法來減輕T細胞區 室的喪失。
[0007] 毒性部分通過治療性單克隆抗體阿侖單抗(Alemtuzumab)的臨床效果所揭示。該 試劑裂解表達CD52的細胞并在T細胞惡性腫瘤中具有一些效力。該試劑的效用被深切的細 胞免疫缺陷大大限制，很大程度上由于T細胞的耗竭，伴隨著升高的感染風險。
[0008] 因此，對于不與以上缺點相關的，用于T細胞惡性腫瘤的靶向治療的新方法存在需 要。
[0009] 附圖簡述
[0010] 圖1:αβτ細胞受體/CD3復合物的示意圖。T細胞受體由6種不同的蛋白鏈形成，其必 須在內質網中組裝以表達在細胞表面上。CD3復合物的四種蛋白（⑶3ζ，CD3 γ，⑶3ε和⑶3δ) 覆蓋(sheath)T細胞受體(TCR)。該TCR給所述復合物注入對特定抗原的特異性并由兩條鏈 組成:TCRa和TCRi3。每條TCR鏈具有膜遠端的可變組分和膜近端的恒定組分。幾乎所有的T細 胞淋巴瘤和許多T細胞白血病表達TCR/⑶3復合物。
[0011] 圖2:T細胞受體重排期間T細胞受體β-恒定區（TRBC)-l和TRBC-2的分隔 (segregation)。每條TCR beta鏈從特定beta可變(V)，多樣性(D)，連接(J)和恒定(TRBC)區 域的基因組重組形成。人基因組含有兩個非常相似且功能上等同的TRBC基因座，稱作TRBC1 和TRBC2。在TCR基因重排期間，J-區與TRBC1或TRBC2重組。該重排是永久性的。T細胞在它們 的表面上表達單個TCR的許多拷貝，因此每個T細胞將表達TCR，其β-鏈恒定區由TRBC1或 TRBV2編碼。
[0012] 圖3:人TRBC1和TRBC2在氨基酸水平的比對。由TRBC1和TRBC2編碼的TCR0恒定鏈僅 通過4個氨基酸差異而不同：TRBC位置3處的K/N;TRBC位置4處的N/K; TRBC位置36處的F/Y; TRBC位置135處的V/E。
[0013]圖4:明確證明J0VI-1抗體結合TRBC 1而不結合TRBC2。細胞的遺傳工程用于明確證 明J0VI-1單克隆抗體識別TCRi3恒定鏈的TRBC1變體。生成了三-順反子逆轉錄病毒基因盒 (tri-cistronic retroviral cassette)。這編碼人TCR的TCRa和TCRP鏈兩者，所述人TCR識 別次要組織相容性抗原HA1，以及截短的人⑶34作為方便的標志物基因。天然地，HA1TCR是 TRBC2。生成了第二逆轉錄病毒基因盒，除了 TCRi3恒定區中的4個殘基以外其與第一個相同， 所述TCRi3恒定區中的4個殘基(其區分TRBC1與TRBC2)改變為由TRBC1編碼的那些。使用任一 載體轉導Jurkat T細胞，其的TCRa和TCRi3鏈兩者都被敲除。這些細胞使用全-TCR/CD3抗體 或單克隆J0VI-1與針對CD34的抗體聯合染色，并在流式細胞儀中分析。上排揭示了使用全-TCR/⑶3抗體對⑶34 (轉導的標志物）的染色，下排揭示了使用J0VI -1對⑶34的染色。轉導的 細胞表現出相似的TCR/CD3染色，但僅TRBCl+ve細胞使用J0VI-1染色。因此J0VI-1對TRBC1 是特異性的且進一步使用抗體區分TRBC1和2的TCR是可能的。
[0014] 圖5:J0VI-lmAb通過識別TRBC的殘基3和4區分TRBC1與TRBC2。為了精確地確定 J0VI-1如何區分TRBC1與TRBC2,突變上文詳細描述的HA1TCR TRBC2構建體以制備兩種 TRBC1/2雜交體。生成了另外的變體使得僅TCRi3恒定區的殘基3和4從TRBC2的那些改變為 TRBC1中存在的那些。制成了進一步的變體，其中僅殘基36從TRBC2中存在的改變為TRBC1。 使用這些新的構建體轉導TCR敲除的Jurkat T細胞。圖4中描述的初始的TRBC2和TRBC1轉導 的Jurkat用作對照。Jurkat T細胞使用J0VI-1染色并使用流式細胞儀分析。將J0VI-1的染 色重疊在非轉導的TCR敲除的Jurkat T細胞的染色上。J0VI-1染色表達TRBC1TCR而不是 TRBC2TCR的JurkaUjOVI-l染色其中僅TRBC殘基3和4是TRBC1的那些殘基的TRBC1/2雜交 體。J0VI-1不染色其中僅TRBC殘基36是TRBC1的殘基的Jurkat T細胞。
[0015]圖6:TRBC1的正常供體T細胞表達的例子。正常供體外周血單核細胞使用針對⑶3、 CD4、CD8的抗體和J0VI-1染色并通過流式細胞術分析。CD4+和⑶8+T細胞群體示于上組。對 該群體的每一個設門和前向散射(forward scatter)對J0VI-1染色分別示于Y和X軸。這些 數據表明⑶8+和⑶4+區室兩者都含有TRBCl+ve和-ve的細胞。這是來自一個供體的代表性 數據。
[0016]圖7:幾個正常供體中的TRBC1+T細胞。對十個正常供體采血且外周血單核細胞如 上文圖4中所述的染色。CD4和⑶8區室兩者中TRBC 1T細胞的比例的匯總數據連同中位數和 范圍一起示于柱狀圖。所有的供體具有TRBC1+和TRBC1-區室。TRBC1+細胞的中位數％ = 36% 〇
[0017]圖8: T細胞惡性腫瘤衍生的細胞系使用J0VI-1染色。已經從T細胞惡性腫瘤衍生了 幾個細胞系。這些細胞系中的許多仍然表達TCR。我們選擇了 Jurkats(T細胞白血病細胞 系），HPB-ALL(另一種T細胞白血病細胞系）和HD-Mar-2(T細胞淋巴瘤細胞系）用于研究。通 過使用全-TCR/CD3抗體染色這些細胞，我們能夠證明所有的三種表達TCR(左組，染色重疊 在同種型對照染色上）。接著，通過使用J0VI-1染色，我們能夠確認這些T細胞系是TRBC1陰 性或陽性的。僅 Jurkats 細胞(TRBC1 + )而不是 HPB-ALL 或 HD-Mar-2(TRBC2+)被 J0VI-1 染色， 支持TRBC1或2的排他性表達。
[0018] 圖9:使用JOVI-lmAb對TRBC-1T細胞的選擇性殺傷。將野生型JurkatT細胞(CD34-， TRBC1 + )與使用和CD34標志物基因共表達的TRBC2轉導的ΤΟ?αβ敲除Jurkat T細胞（CD34+ TRBC2+)混合。將這些細胞與單獨J0VI-1孵育或與J0VI-1和補體孵育1小時。洗滌細胞并對 CD34，膜聯蛋白V和7-AAD染色。通過流式細胞術分析細胞。以下示出的是活的群體中CD34表 達，如通過膜聯蛋白-V陰性和7-AAD暗群體所確定的。（a)單獨J0VI-l;(b)J0VI_l和補體。觀 察到了對TRBC1T細胞(⑶34-)的選擇性殺傷。
[0019]圖10:多克隆埃巴病毒(EBV)特異性T細胞可以分為兩個大約相等的TRBC1/2群體。 使用良好建立的方法，發明人選擇性擴增了來自正常供體的外周血的EBV特異性T細胞。隨 后的品系具有高度選擇性針對自體EBV感染的B細胞(auto LCLs)，和針對異體EBV感染的T 細胞(alio LCLs)無活性，和無非特異性NK活性(如通過針對K562細胞測試所測量的）。此類 品系是供體的EBV免疫力的代表。（b)當使用J0VI-1染色時，這些T細胞對于TRBC1和TRBC2大 約相等分型。
[0020] 圖11J0VI-1VH和VL的注解序列。高變區加下劃線和加粗。
[0021]圖12:證明外周T細胞淋巴瘤是TRBC限制的，但正常的循環T細胞不是。從具有循環 T細胞淋巴瘤細胞的患者抽取了外周血T細胞。分離了外周血單核細胞并使用包括⑶5、TCR 和J0VI-1的抗體組染色。通過⑶5表達強度，可以在流動上區分正常和惡性T細胞。CD5明亮 (正常T細胞)具有大約相等的TRBC1和2群體。CD5中等和暗淡群體(腫瘤)都是TRBC2陽性的。 如果該患者具有TRBC2導向的療法，那么該淋巴瘤將被根除，而他們的T細胞的大約一半將 被放過。
[0022]圖13:證明來源于JOVI -1的VH和VL是正確的且它們能夠折疊為單鏈可變片段。原 始的雜交瘤上清，重組J0VI-1抗體和從轉導的293T細胞生成的scFv-Fc用于染色一些細胞 系：Jurkat TCR敲除，野生型Jurkats，使用TRBC1TCR轉導的Jurkat TCR敲除，所述TRBC1TCR 在共表達eBFP2的載體中；使用TRBD2TCR轉導的Jurkat TCR敲除，所述TRBD2TCR在共表達 eBFP2的載體中。通過流式細胞術分析染色。重組抗體和scFv兩者都結合表達TRBC2的細胞。 [0023]圖14:不同形式的基于J0VI-1的CARXARs通常包含結合域，間隔區，跨膜域和胞內 信號傳導域。在本研究中生成了 CAR，其包含J0VI-1;來源于⑶8莖部，人IgGl的鉸鏈-CH2-CH3域(具有去除FcR結合的突變)的間隔區；或來源于人IgGl的間隔區。
[0024]圖15:基于J0VI-1的CAR的功能。使用上述不同的CAR轉導正常供體外周血T細胞。 也使用CD19特異性CAR轉導T細胞作為對照。接著，這些T細胞使用以下靶細胞攻擊： Jurkats-TCR敲除和Jurkats野生型以及Raji細胞(CD19+B細胞淋巴瘤系）。示出了針對不同 靶標的效應物的鉻釋放數據。J0VI-1CAR T細胞殺傷Jurkats但不殺傷Raji細胞或具有TCR 敲除的Jurkats。
[0025] 圖16: J0VI-1CAR T細胞培養物的自凈化（Self-Purging)。由于T細胞包含大約相 等數量的TRBC1或TRBC2陽性的Τ細胞，可能的是在引入CAR后，培養物的一定量的"相殘 (fratricide)"或自凈化可以發生。證明了情況就是這樣。在該例子中，CAR T細胞在轉導后 染色并通過流式細胞術分析。比較假轉導的與轉導的，可以觀察到該T細胞群體失去了 TRBC1陽性T細胞。
[0026] 圖17:調查T細胞大顆粒白血病(T-LGL)的克隆性-患者A
[0027] 圖18:調查T細胞大顆粒白血病(T-LGL)的克隆性-患者B
[0028] 圖19:調查T細胞大顆粒白血病(T-LGL)的克隆性-患者C
[0029] 圖20:調查多克隆T細胞淋巴瘤(PCTL)的克隆性-患者D
[0030]圖21 :TRBC肽噬菌體選擇策略。A)在直接或間接固定化到表面上的TRBC肽上的兩 輪固相噬菌體展示選擇。B)在生物素化的TRBC肽上的三輪溶液相噬菌體展示選擇。
[0031]圖22:來自TRBC肽噬菌體展示選擇的多克隆噬菌體輸出的分析。使用多克隆噬菌 體的TRF結合測定，所述多克隆噬菌體來自在直接固定化為BSA/0A綴合物的TRBC肽上進行 的固相選擇(A)，在固定化于鏈霉親合素/中性親合素(neutravidin)的TRBC肽上的固相選 擇(B)和來自溶液相選擇(C)。
[0032]圖23:pSANG10-3F載體的示意圖。將編碼單鏈抗體（scFv)的基因克隆在T7啟動子 和pelB引導序列（用于周質轉位）下游的Ncol/Notl。該載體還含有C末端六組氨酸標簽 (Hi s6)用于純化和三FLAG標簽檢測。
[0033] 圖24:TRBC1和TRBC2特異性結合物的初級篩選。來自TRBCl(A)和TRBC2(B)選擇的 94個scFvs對生物素化的TRBC1和TRBC2(0.5μg/ml)的結合，所述TRBC1和TRBC2固定化于中 性親合素（l〇μg/ml)包被的NuncMaxisorp?96孔板上。使用綴合有銪的抗FLAG抗體檢測scFv 對固定化的肽的結合。
[0034] 圖25:來自使用TRBC1肽免疫的兔#13174的多克隆抗體血清針對TRBC1和TRBC2肽 的結合。(A)第三次免疫后(B)第三次免疫和TRBC1特異性抗體的純化后。
[0035] 圖26:來自使用TRBC2肽免疫的兔#17363的多克隆抗體血清針對TRBC1和TRBC2肽 的結合。(A)第三次免疫后(B)第三次免疫和TRBC2特異性抗體的純化后。
[0036] 圖27:來自使用TRBC2肽免疫的兔#17364的多克隆抗體血清針對TRBC1和TRBC2肽 的結合。(A)第三次免疫后(B)第三次免疫和TRBC2特異性抗體的純化后。
[0037] 發明簡述
[0038]本發明人已經設計了方法，其中在受試者中耗竭惡性T細胞而不影響健康T細胞的 顯著比例是可能的。具體地，他們已經開發了 TRBC1和TRBC2特異性嵌合抗原受體(CAR)，用 于T細胞惡性腫瘤的治療中的用途。
[0039]因此，在第一個方面中，本發明提供嵌合抗原受體(CAR)，其包含選擇性結合TCR beta恒定區1 (TRBC1)或TRBC2的抗原結合域。
[0040]在本發明的第一個方面的第一個實施方案中，提供選擇性結合TRBC1的CAR。在這 一實施方案中，CAR可以包含抗原結合域，其具有包含以下互補決定區（CDR)的可變重鏈 (乂!〇和可變輕鏈(￥〇:
[0041] VH CDR1:SEQ ID Νο·7;
[0042] VH CDR2:SEQ ID Νο·8;
[0043] VH CDR3:SEQ ID Νο·9;
[0044] VL CDR1:SEQ ID No.10；
[0045] VLCDR2:SEQIDNo.lUP
[0046] VL CDR3:SEQ ID No.12
[0047] CAR可以包含抗原結合域，其包含具有如SEQ ID No. 1所示序列的可變重鏈(VH)和 具有如SEQ ID No.2所示序列的可變輕鏈(VL)。
[0048] CAR可以包含抗原結合域，其包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的scFv。 [0049] CAR可以包含選自SEQ ID No.33、34和35的氨基酸序列。
[0050] CAR可以包含來自表1中列出的那些的VH CDR3和/或VL CDR3。
[0051] CAR可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0052] (1)重鏈 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR3;
[0053 ] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0054] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);來自如SEQ ID如.13至22所示的8〇卩￥8 的一個。
[0055]在本發明的第一個方面的第二個實施方案中，提供選擇性結合TRBC2的CAR。
[0056] 與此實施方案相關，CAR可以包含來自表2中列出的那些的VH⑶R3和/或VL⑶R3。
[0057] CAR可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0058]("重鏈⑶尺和/或所述輕鏈⑶!^;
[0059 ] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0060] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);來自如SEQ ID No.23至32所示的scFvs 的一個。
[0061] 在第二個方面，本發明提供編碼根據本發明的第一個方面的CAR的核酸序列。
[0062] 在第三個方面，提供載體，其包含根據本發明的第二個方面的核酸序列。
[0063] 在第四個方面，提供細胞，其包含根據本發明的第一個方面的CAR。細胞可以是細 胞溶解性免疫細胞，例如T細胞或天然殺傷(NK)細胞。
[0064] 在第五個方面，提供用于制備根據本發明的第四個方面的細胞的方法，其包括使 用根據本發明的第二個方面的核酸序列或根據本發明的第三個方面的載體轉導或轉染細 胞的步驟。
[0065] 在第六個方面，提供根據本發明的第四個方面的細胞，用于在用于治療受試者中T 細胞淋巴瘤或白血病的方法中的用途，所述方法包括以下步驟
[0066] 將包含TCRB1或TCRB2選擇性CAR的細胞施用至受試者，以引起惡性T細胞連同與惡 性T細胞表達相同TRBC的正常T細胞的選擇性耗竭，而不引起表達惡性T細胞不表達的TRBC 的正常T細胞的耗竭。
[0067] 方法還可以包括調查來自受試者的惡性T細胞的TCR beta恒定區（TCRB)的步驟， 以確定其是否表達TRBC1或TRBC2。
[0068]還提供用于治療受試者中T細胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括向所述受試者施 用TCRB1或TCRB2選擇性試劑的步驟，其中所述試劑導致惡性T細胞連同與惡性T細胞表達相 同TRBC的正常T細胞的選擇性耗竭，而不引起表達惡性T細胞不表達的TRBC的正常T細胞的 耗竭。
[0069] 在本發明的這一方面的第一個實施方案中，試劑是TCRB1選擇性試劑。在本發明的 這一方面的第二個實施方案中，試劑是TRBC2選擇性試劑。
[0070] 方法還可以包括在施用步驟前調查惡性T細胞的TCR beta恒定區（TRBC)，以確定 其是否表達TRBC1或TRBC2的步驟。
[0071]試劑可以是耗竭性(depleting)單克隆抗體或其片段。試劑可以是綴合的抗體，其 可以包含化療實體。
[0072]試劑可以是雙特異性T細胞結合劑（engager)。試劑可以是表達嵌合抗原受體 (CAR)的T細胞。CAR可以包含選擇下組的氨基酸序列：SEQ ID No.33,34和35。
[0073]試劑可以包含J0VI-1抗體或其功能片段。
[0074] 試劑可以包含具有包含以下互補決定區（CDR)的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的 抗體或其功能片段：
[0075] VH CDR1:SEQ ID Νο·7;
[0076] VH CDR2:SEQ ID Νο·8;
[0077] VH CDR3:SEQ ID Νο·9;
[0078] VL CDR1:SEQ ID No.10；
[0079] VLCDR2:SEQIDNo.lUP
[0080] VL CDR3:SEQ ID No.12
[0081] 試劑可以包含抗體或其功能片段，其包含具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列 的可變重鏈(VH)和具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的可變輕鏈(VL)。
[0082]試劑可以包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的scFv。試劑可以作為藥物 組合物提供。
[0083] T細胞淋巴瘤或白血病可以選自外周T細胞淋巴瘤，非特指型(PTCL-N0S);血管免 疫母細胞T細胞淋巴瘤（AITL)，間變性大細胞淋巴瘤（ALCL)，腸病相關的T細胞淋巴瘤 (EATL)，肝脾T細胞淋巴瘤(HSTL)，結外NK/T細胞淋巴瘤鼻型，皮膚T細胞淋巴瘤，原發性皮 膚ALCL，T細胞幼淋巴細胞白血病和T細胞急性淋巴母細胞白血病。
[0084] 本發明還提供試劑，用于根據此類方法治療T細胞淋巴瘤或白血病中的用途。
[0085] 本發明還提供試劑盒，包含用于如上文所定義的用途的試劑。
[0086] 本發明還提供了試劑在制備用于根據上述方法治療T細胞淋巴瘤或白血病的藥物 中的用途。
[0087] 本發明還提供用于診斷受試者中T細胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括確定樣品 中呈TRBC1或TRBC2陽性的總T細胞的百分比的步驟。
[0088] TRBC1或TRBC2陽性T細胞的百分比大于約80%指示T細胞淋巴瘤或白血病的存在。 [0089]樣品可以是外周血樣品或活組織檢查(biopsy)。
[0090] 結合總T細胞的試劑可以結合⑶3。
[0091] 發明詳述
[0092]本發明提供選擇性結合TRBC1或TRBC2的試劑，如嵌合抗原受體(CARs)。此類試劑 在用于治療受試者中的T細胞淋巴瘤或白血病的方法中是有用的。T細胞惡性腫瘤是克隆性 的，因此它們表達TRBC1或TRBC2。通過施用TCRB1或TCRB2選擇性試劑至受試者，試劑引起惡 性T細胞連同與惡性T細胞表達相同TRBC的正常T細胞的選擇性耗竭，而不引起表達惡性T細 胞不表達的TRBC的正常T細胞的耗竭。
[0093] TCRP 恒定區（TRBC)
[0094] T細胞受體(TCR)在T淋巴細胞的表面上表達，并負責識別結合至主要組織相容性 復合物(MHC)分子的抗原。當TCR結合抗原肽和MHC (肽/MHC)時，T淋巴細胞通過一系列生物 化學事件活化，所述生物化學事件由相關的酶，共受體，特化的銜接頭(adaptor)分子，和活 化或釋放的轉錄因子介導。
[0095] TCR是二硫鍵連接的膜錨定異二聚體，通常由高度可變的alpha(a)和beta(i3)鏈組 成，作為與不變的CD3鏈分子的復合物的一部分表達。表達該受體的T細胞稱為α:β(或αβ)Τ 細胞(~95 %總Τ細胞）。少數Τ細胞表達替換受體，由可變gamma( 丫）和deta(δ)鏈形成，并稱 作γδΤ細胞(~5%總Τ細胞）。
[0096]每條α和β鏈由兩個胞外域組成:可變(V)和恒定(C)區，兩者都是形成反向平行的 片層的免疫球蛋白超家族（IgSF)域的。恒定區與細胞膜靠近，接著是跨膜區和短胞質尾 部，而可變區結合肽/MHC復合物(見圖1KTCR的恒定區由短的連接序列組成，其中半胱氨酸 形成二硫鍵，其形成兩條鏈之間的連接。
[0097] TCRa-鏈和β-鏈兩者的可變域具有三個超變或互補決定區（CDRs)。0_鏈的可變區 還可以具有另外的超變區域(HV4)，然而，這通常不接觸抗原并因此認為不是CDR。
[0098] TCR還可以包含多達五個不變鏈γ、δ、ε (統稱為⑶3)和ζ。在抗原被αβ或γδ識別 后，CD3和ζ亞基通過特定的胞質域介導TCR信號傳導，所述胞質域與第二信使和銜接頭分子 相互作用。TCR復合物的細胞表面表達之前是亞基的成對(pair-wise)組裝，其中TCRa和β以 及CD3 γ和δ的跨膜和胞外域兩者都發揮作用。
[0099] 因此，TCR通常由⑶3復合物和TCRa和β鏈組成，其繼而由可變和恒定區組成（圖1)。 [0100] 提供TCRi3_恒定區（TRBC)的基因座(Chr7:q34)在進化史中已經復制以產生兩個幾 乎相同且功能等同的基因：TRBC1和TRBC2(圖2)，其差異僅在于各自產生的成熟蛋白中的4 個氨基酸（圖3)。每個TCR將以互相排斥的方式包含TRBC1或TRBC2，而因此，每個αβΤ細胞將 以互相排斥的方式表達TRBC1或TRBC2。
[0101]本發明人已經確定了，盡管TRBC 1和TRBC2的序列之間的相似性，區分它們是可能 的。本發明人也已經確定了可以在細胞(例如Τ細胞)表面上原位區分TRBC1和TRBC2的氨基 酸序列。
[0102] 惡性細胞
[0103] 術語"惡性"用于本文根據其標準含義指代細胞，其生長不是自我限制的，可以能 夠侵入臨近組織并可以能夠擴散到遠端組織。因而，術語"惡性Τ細胞"用于本文指代在淋巴 瘤或白血病的情況下克隆擴增的Τ細胞。
[0104] 本發明的方法涉及確定惡性Τ細胞的TRBC。這可以使用本領域已知的方法進行。例 如，可以通過PCR，western印跡，流式細胞術，或焚光顯微術方法確定。
[0105] 一旦已經確定了惡性T細胞表達的TRBC，將適合的TRBC1或TRBC2選擇性試劑施用 至受試者。"適合的TRBC選擇性試劑"表示在惡性T細胞確定為表達TRBC1的情況下，施用 TRBC1選擇性試劑，而在惡性T細胞確定為表達TRBC2的情況下，施用TRBC2選擇性試劑。 [0106] 選擇性試劑
[0107]選擇性試劑以互相排斥的方式結合TRBC1或TRBC2。
[0108] 如上文所述，每個αβτ細胞表達TCR，其包含TRBC1或TRBC2。在克隆T細胞病癥如T細 胞淋巴瘤或白血病中，來源于相同克隆的惡性Τ細胞將全部表達TRBC1或TRBC2。
[0109] 因此，本方法包括施用TRBC1或TRBC2選擇性試劑至受試者的步驟，其中試劑導致 惡性Τ細胞連同與惡性Τ細胞表達相同TRBC的正常Τ細胞的選擇性耗竭，而不引起與惡性Τ細 胞相比表達另一種TRBC的正常Τ細胞的顯著耗竭。
[0110] 因為TRBC選擇性試劑不引起與惡性Τ細胞相比表達另一種TRBC的正常Τ細胞的顯 著耗竭，其不引起整個T細胞區室的耗竭。一定比例的患者T細胞區室的保留（即不表達與惡 性T細胞相同TRBC的T細胞)導致降低的毒性和減低的細胞和體液免疫缺陷，從而降低感染 的風險。
[0111] 根據本發明的方法，TRBC1選擇性試劑的施用可以導致5，10，20，50，75，90，95或 99 %耗竭，即表達TRBC1的T細胞數量的減少。
[0112] 根據本發明的方法，TRBC2選擇性試劑的施用可以導致5，10，20，50，75，90，95或 99 %耗竭，即表達TRBC2的T細胞數量的減少。
[0113] TRBC1選擇性試劑可以以TRBC2的大至少2倍，4倍，5倍，7倍或10倍的親和力結合 TRBC1。相似地，TRBC2選擇性試劑可以以TRBC1的大至少2倍，4倍，5倍，7倍或10倍的親和力 結合TRBC2。
[0114] TRBC1選擇性試劑引起細胞群體中比表達TRBC2的細胞更大比例的表達TRBC1的T 細胞的耗竭。例如，表達TRBC1的T細胞比表達TRBC2的細胞的耗竭的比率可以為至少60%: 40 %，70 % : 30 %，80 % : 20 %，90 % : 10 %或95 % : 5 %。相似地，TRBC2選擇性試劑引起細胞群 體中比表達TRBC2的細胞更大比例的表達TRBC1的T細胞的耗竭。例如，表達TRBC2的T細胞比 表達TRBC1的細胞的耗竭的比率可以為至少60% :40%，70% :30%，80% :20%，90% : 10% 或95% :5%。
[0115] 使用本發明的方法，受試者中的惡性T細胞被耗竭，而不影響相當大比例的健康T 細胞。通過"相當大比例"表示的是為了維持受試者中T細胞的功能，足夠比例的與惡性T細 胞表達不同TRBC的T細胞存活。試劑可以導致表達另一種TCRB的T細胞群體的少于20%， 15%，10%或5%的耗竭。
[0116] 選擇性試劑可以是對于TRBC1或TRBC2是選擇性的，因為其區分如下列出的殘基：
[0117] (丨奵1^(：位置3處~與1(;
[0118] (ii)TRBC位置 3 處K 與 N;
[0119] (iii)TRBC位置 4 處K 與 N;
[0120] ("奵1^(：位置4處~與1(;
[0121] (v)TRBC位置 36 處F 與 Y;
[0122] (￥1奵1^(：位置36處￥與卩；
[0123] (vii)TRBC 位置 135 處 V與 E;和/或
[0124] (viii)TRBC 位置 135處E與 V。
[0125] 選擇性試劑可以區分上述差異的任意差異組合。
[0126] 抗體
[0127] 本發明的方法中使用的試劑可以是耗竭性單克隆抗體(mAb)或其功能片段，或抗 體模擬物(antibody mimetic)。
[0128] 術語"耗竭性抗體"以其常規意義使用，涉及結合靶T細胞上存在的抗原并介導靶T 細胞的死亡的抗體。因此，施用耗竭性抗體至受試者導致受試者中表達靶抗原的細胞的數 量降低/減少。
[0129] 如本文所用的，"抗體"表示具有抗原結合位點的多肽，所述抗原結合位點包括至 少一個互補決定區CDR。抗體可以包含3個CDR并具有與域抗體(dAb)等同的抗原結合位點。 抗體可以包含6個CDR，并具有與經典抗體分子等同的抗原結合位點。多肽的剩余部分可以 是任意序列，其提供用于抗原結合位點的適合支架，并以對于其結合抗原適合的方式展示 它。抗體可以是整個免疫球蛋白分子或其部分，例如?&13^( &13)'2^￥，單鏈?￥(5(^￥)片段或 納米抗體。抗體可以是雙功能抗體。抗體可以是非人的，嵌合的，人源化的或全人的。
[0130]因此，抗體可以是任意功能片段，其保留了全長抗體的抗原特異性。
[0131] TRBC1選擇性抗體
[0132] 用于本發明的方法中的試劑可以包含抗體或其功能片段，所述抗體或功能片段具 有可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，其包含一個或多個以下互補決定區（CDR):
[0133] VH CDR1:GYTFTGY(SEQ ID No.7)；
[0134] VH CDR2:NPYNDD(SEQ ID No.8)；
[0135] VH CDR3:GAGYNFDGAYRFFDF(SEQ ID No.9);
[0136] VL CDR1:RSSQRLVHSNGNTYLH(SEQ ID No.10);
[0137] VLCDR2:RVSNRFP(SEQIDNo.ll)jP
[0138] VL CDR3:SQSTHVPYT(SEQ ID No.12)
[0139] 相比于如SEQ ID No.7至12給出的序列，一個或多個⑶R每個獨立地可以包含或不 包含一個或多個氨基酸突變(例如，取代），只要所得的抗體保留了選擇性結合TRBC1的能 力。
[0140] 研究已經表明⑶R L3和H3普遍地負責與抗原的高能量相互作用，因此抗體或其功 能性片段可以包含如上文所述的VH⑶R3和/或VL⑶R3。
[0141] 使用噬菌體展示，已經鑒定了幾個另外的抗體結合域，其對于結合TRBC1相對于結 合TRBC2是高度選擇性的，如實施例12中所描述的。
[0142] 試劑可以包含抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有可變重鏈(VH) 和/或可變輕鏈(VL)，其包含表1中示出的一個或多個互補決定區(CDR3)。
[0143] 表1
[0144]
[0145] 在試劑是域抗體的情況下，其可以包含3個⑶R，即VH⑶R1-⑶3R或VL⑶R1-⑶R3。
[0146] 試劑可以包含抗體或其功能部分，其包含具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列 的可變重鏈(VH)和具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的可變輕鏈(VL)。
[0147] SEQ_ID_lJovi-lVH
[0148] EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKAT LTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSS
[0149] SEQ_ID_2Jovi-lVL
[0150] DWMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
[0151] 試劑可以包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的scFv。
[0152] SEQ_ID_3Jovi-lscFv
[0153] EVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDIQSNERFRGKAT LTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQS PLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVE AEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKR
[0154]或者，試劑可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0155] (i)重鏈 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR3;
[0156] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0157] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);
[0158] 來自如SEQ ID吣.13至22所示的8〇卩￥8的一個。
[0159] 在如SEQ ID No. 13-22所示的序列中，序列的VH和VL部分加粗示出，且重鏈和輕鏈 的⑶R1和⑶R2序列下劃線標出。VH和VL的⑶R3序列在表1中給出。
[0160] SEQ ID N〇.13_(CP_01_E09)
[0161]
[0163] SEQ ID No.14(CP_01_D12)
[0164]
[0165] SEQ ID No.15(CP_01_D10)
[0174]
[0182] TRBC2-特異性
[0183] 使用噬菌體展示，已經鑒定了幾個抗體結合域，其對于結合TRBC2相對于結合 TRBC1是高度選擇性的，如實施例12中所描述的。
[0184] 試劑可以包含抗體或其功能性片段，所述抗體或其功能性片段具有可變重鏈(VH) 和/或可變輕鏈(VL)，其包含表2中示出的一個或多個互補決定區(CDR3s)。
[0185] 表2
[0186]
[0187]試劑可以包含抗體或其功能片段，其包含：
[0188] (i)重鏈 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR3;
[0189 ] (i i)重鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3 和 / 或輕鏈 CDR1、CDR2 和 CDR3;或
[0190] (iii)可變重鏈(VH)和/或可變輕鏈(VL);
[0191] 來自如SEQ ID吣.23-32所示的8〇?￥8的一個。
[0192] 在如SEQ ID No.23-32所示的序列中，序列的VH和VL部分加粗示出，且重鏈和輕鏈 的⑶R1和⑶R2序列下劃線標出。VH和VL的⑶R3序列在表2中給出。
[0193] SEQ ID No.23(CP_03_E05)
[0194]
[0212]
[0216] 以上氨基酸序列的變體也可以用于本發明，只要所得的抗體結合TRBC1或TRBC2且 不顯著交叉反應。典型地，此類變體與上文指定序列的一個具有高度序列同一性。
[0217] 用于比較的序列的比對方法是本領域中公知的。
[0218] NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)從幾個來源可用，包括 National Center for Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，Md.)和互聯網，用于 與序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx相關使用。如何使用該程序確 定序列同一性的說明可以在互聯網上的NCBI網站上獲得。
[0219] VL或VH域或scFv的變體通常具有與如SEQ ID No. 1-3,13-32所給出的序列至少約 75%，例如至少約80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。
[0220] 典型地，相比于原始氨基酸或核酸序列，變體可以含有一個或多個保守氨基酸取 代。保守取代是不實質上影響或降低抗體結合TRBC1或TRBC2的親和力的那些取代。例如，特 異性結合TRBC1或TRBC2的人抗體相比于如SEQ ID No. 1-3或13-32所給出的任何序列，可以 在VH或VL之任一或兩者中包括多達1個，多達2個，多達5個，多達10個，或多達15個的保守取 代并保留對TRBC1或TRBC2的特異性結合。
[0221] 可以通過保守取代的方式交換的功能上相似的氨基酸對于本領域的普通技術人 員是公知的。以下六組是認為對于彼此是保守取代的氨基酸的例子：1)丙氨酸(A)，絲氨酸 (S)，蘇氨酸(T) ;2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ;3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)， 賴氨酸(K) ;5)異亮氨酸（I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸 (Y)，色氨酸(W)。
[0222] 抗體的制備
[0223] 可以使用標準的實驗室技術進行抗體的制備。可以從動物血清獲得抗體，或者，在 單克隆抗體或其片段的情況下，在細胞培養物中產生。可以使用重組DNA技術根據建立的程 序在細菌或哺乳動物細胞培養物中產生抗體。
[0224] 用于單克隆抗體的產生的方法是本領域中公知的。簡單的說，通常通過將骨髓瘤 細胞與來自已經使用期望的抗原免疫的小鼠或兔的脾細胞融合來制備單克隆抗體。本文 中，期望的抗原是TRBC1或TRBC2肽，或包含TRBC1或TRBC2的TCR0鏈。
[0225] 或者，可以通過以重組的方式組合VH和VL鏈的文庫，在免疫系統之外制備抗體和 相關的分子，特別是scFv。可以使用如實施例12所述的噬菌體展示技術構建和篩選此類文 庫。
[0226] 鑒定TRBC1/TRBC2選擇性抗體
[0227] 可以使用本領域中標準的方法鑒定對于TRBC1或TRBC2選擇性的抗體。用于確定抗 體的結合特異性的方法包括但不限于，ELISA，western印跡，免疫組織化學，流式細胞術， l^rster共振能量轉移(FRET)，噬菌體展示文庫，酵母雙雜交篩選，共免疫沉淀，雙分子熒光 互補和串聯親和純化。
[0228] 為了鑒定對于TRBC1或TRBC2選擇性的抗體，評估了抗體對TRBC1和TRBC2每一個的 結合。典型地，這是通過確定抗體分別對每一個TRBC的結合來評估。抗體選擇性結合TRBC1 或TRBC2而不顯著結合另一種TRBC。
[0229] 抗體模擬物
[0230] 或者，試劑可以是不來源于或基于免疫球蛋白的分子。已經發展了一些"抗體模擬 物"設計的重復蛋白（DRPs)以開發非抗體多肽的結合能力。
[0231 ]重復蛋白如錨蛋白（ankyrin)或富含亮氨酸的重復蛋白是獨特的結合分子，不像 抗體，其發生于細胞內和細胞外。它們獨特的模塊架構特征重復結構單元(重復），其堆疊在 一起以形成延長的重復域，展現出可變的和模塊靶標結合表面。基于這一模塊性，可以產生 具有高度多樣化的結合特異性的多肽的組合文庫。DARPins(設計的錨蛋白重復蛋白）是基 于該技術的抗體模擬物的一個例子。
[0232] 對于Anticalins，結合特異性來源于脂質運載蛋白（lipocalins)，即實施與化學 敏感性或不溶性化合物的生理運輸和儲存相關的一批體內功能的蛋白家族。脂質運載蛋白 具有強的(robust)內在結構，包括高度保守的β-桶，其支持所述蛋白一個末端處的四個環。 用于進入結合口袋的這些環和該分子的這部分中的構象差異負責不同脂質運載蛋白之間 的結合特異性的變化。
[0233] Avimers從人細胞外受體域的大家族進化，通過體外外顯子改組(exonshuffling) 和噬菌體展示，產生具有結合和抑制特性的多結構域蛋白。
[0234] Versabodies是具有>15%的半胱氨酸的3_5kDa的小蛋白，其形成高二硫鍵密度支 架，替代大多數蛋白中存在的疏水核心。大量疏水性氨基酸，包括疏水核心被少量二硫化物 的替換導致較小的，更親水的，對蛋白酶和熱更抗性的，并具有較低密度T細胞表位的蛋白。 這些特性的所有四種導致具有大大降低的免疫原性的蛋白。它們也可以在大腸桿菌中制 備，并是高度可溶和穩定的。
[0235] 綴合物
[0236] 抗體或模擬物可以是抗體或模擬物和另一種試劑或抗體的綴合物，例如綴合物可 以是可檢測實體或化療實體。
[0237] 可檢測實體可以是熒光部分，例如熒光肽。"熒光肽"指代多肽，其在激發后，發射 可檢測波長的光。熒光蛋白的例子包括但不限于，異硫氰酸熒光素(FITC)，藻紅蛋白（PE)， 別藻藍蛋白（APC)，綠色熒光蛋白（GFP)，增強的綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白（RFP)，藍色熒 光蛋白（BFP)和mCherry。
[0238] 與可檢測實體綴合的選擇性TRBC1或TRBC2試劑可以用于確定惡性T細胞的TRBC。
[0239] 化療實體如用于本文指代對細胞破壞性的實體，也就是降低細胞的生存力的實 體。該化療試劑可以是細胞毒性藥物。考慮的化療試劑包括但不限于，烷化劑，亞硝基脲，乙 烯亞胺/甲基三聚氰胺，烷基磺酸鹽，抗代謝物，嘧啶類似物，表鬼白毒素 (epipodophylotoxins)，酶例如L-天冬酰胺酶;生物反應調節劑，如干擾素 a，IL-2，G_CSF和 GM-CSF;鉬配位絡合物，如順鉬和卡鉬，蒽二酮(anthracenediones)，取代脲例如羥基脲，甲 基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和甲基芐肼，腎上腺皮質抑制劑，如米托坦(〇，p ' -DDD)和氨 魯米特;激素和詰抗劑，包括腎上腺皮質類固醇詰抗劑例如強的松(prednisone)和等同物， 地塞米松和氨魯米特;孕激素例如己酸羥孕酮，醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮;雌激素例如 己稀雌?Kdiethylstilbestrol)和炔雌醇等同物;抗雌激素如他莫昔芬(tamoxifen);雄激 素包括丙酸睪酮和氟甲睪酮/等同物;抗雄激素如氟他胺，促性腺激素釋放激素類似物和亮 丙瑞林(leuprolide);和非類固醇抗雄激素，如氟他胺(flutamide)。
[0240]綴合有化療實體的TRBC選擇性試劑使得能夠將化療實體靶向遞送至表達TRBC1或 TRBC2的細胞。
[0241 ]雙特異性T細胞結合劑
[0242] 已經開發了極其多種基于具有兩個抗體樣結合域的基本概念的分子。
[0243] 雙特異性T細胞結合分子是一類已經開發的雙特異性抗體類分子，主要用于抗癌 癥藥物的用途。它們將宿主的免疫系統，更具體地T細胞的細胞毒性活性，引導針對靶細胞 如癌細胞。在這些分子中，一個結合域通過CD3受體結合T細胞，而另一個結合靶細胞如腫瘤 細胞(通過腫瘤特異性分子）。由于雙特異性分子結合靶細胞和T細胞兩者，其將靶細胞帶到 與T細胞臨近，使得T細胞能夠發揮其效果，例如，對癌細胞的細胞毒性效果。T細胞:雙特異 性Ab:癌細胞復合物的形成誘導T細胞中的信號傳導，引起例如細胞毒性介導物的釋放。理 想地，試劑在靶細胞的存在下僅誘導期望的信號傳導，引起選擇性殺傷。
[0244] 已經以一些不同的形式開發了雙特異性T細胞結合分子，但是最普遍的一個是由 不同抗體的兩個單鏈可變片段(scFv)組成的融合物。這些有時稱為BiTEs(雙特異性T細胞 結合劑）。
[0245] 本發明的方法中使用的試劑可以是雙特異性分子，其選擇性識別TRBC1或TRBC2， 并能夠活化T細胞。例如，試劑可以是BiTE。方法中使用的試劑可以包含：
[0246] (i)結合TRBC1或TRBC2的第一結構域;和
[0247] (ii)能夠活化T細胞的第二結構域。
[0248] 雙特異性分子可以包含信號肽以幫助其產生。信號肽可以引起雙特異性分子被宿 主細胞分泌，使得可以從宿主細胞的上清收獲雙特異性分子。
[0249]信號肽可以在分子的氨基末端。雙特異性分子可以具有以下通式:信號肽-第一結 構域-第二結構域。
[0250]雙特異性分子可以包含間隔序列以連接第一結構域與第二結構域并在空間上分 開兩個結構域。
[0251]間隔序列可以例如包含IgGl鉸鏈或CD8莖部。接頭可以可選包括備選接頭序列，其 具有與IgGl鉸鏈或CD8莖部相似的長度和/或結構域間隔特性。
[0252]雙特異性分子可以包含J0VI-1，或其功能性片段，如上文所定義的。
[0253]嵌合抗原受體(CAR)
[0254] 嵌合抗原受體(CAR)，也稱為嵌合T細胞受體，人工T細胞受體和嵌合免疫受體，是 工程化的受體，其將任意特異性嫁接到免疫效應細胞上。在經典的CAR中，將單克隆抗體的 特異性嫁接到T細胞上。可以使用例如逆轉錄病毒載體將編碼CAR的核酸轉移到T細胞中。以 這種方式，可以產生大量癌癥特異性的T細胞用于過繼細胞轉移。該方法的I期臨床研究表 現出效力。
[0255] CAR的靶抗原結合域通常經由間隔區和跨膜域融合至胞內域，其包含細胞內T細胞 信號傳導域，或與細胞內T細胞信號傳導域相關聯。當CAR結合靶抗原時，這導致活化信號傳 輸至它在上面表達的T細胞。
[0256] 本發明的方法中使用的試劑可以是CAR，其選擇性識別TRBC1或TRBC2。試劑可以是 表達選擇性識別TRBC1或TRBC2的CAR的T細胞。
[0257] CAR還可以包含跨越膜的跨膜域。其可以包含疏水alpha螺旋。跨膜域可以來源于 CD28，其給予良好的受體穩定性。
[0258] 胞內域是CAR參與信號傳輸的部分。胞內域包含細胞內T細胞信號傳導域，或與細 胞內T細胞信號傳導域相關聯。在抗原識別后，受體簇集且信號傳輸至細胞。最普遍使用的T 細胞信號傳導組分是CD3-zeta的，其含有3個ITAM。在抗原結合后，這將活化信號傳輸至T細 胞。CD3-zeta可以不提供完全有能力的活化信號，可以需要另外的共刺激信號。例如，嵌合 ⑶28和0X40可以與⑶3-Zeta-起使用以傳輸增殖/存活信號，或所有三種可以一起使用。
[0259] CAR的胞內域可以包含CD28胞內域和0X40和CD3_Zeta胞內域。
[0260] CAR可以包含信號肽，使得當CAR表達在細胞如T細胞內時，初生蛋白被引導至內質 網和隨后到細胞表面，在那里其被表達。
[0261] CAR可以包含間隔序列以連接TRBC結合域與跨膜域并在空間上將TRBC結合域從胞 內域分開。柔性間隔區允許TRBC結合域在不同的方向定向，以實現TRBC結合。
[0262] 間隔序列可以例如包含IgGIFc區，IgGl鉸鏈或⑶8莖部，或其組合。接頭可以可選 包含備選接頭序列，其具有與IgGIFc區，IgGl鉸鏈或CD8莖部相似的長度和/或結構域間隔 特性。
[0263] 發現包含基于IgGl鉸鏈或⑶8莖部的間隔區的CAR表現出針對Jurkat細胞最好的 表現（圖15)。因此，間隔區可以包含IgGl鉸鏈或CD8莖部，或具有與IgGl鉸鏈或CD8莖部相似 的長度和/或結構域間隔特性的間隔區。
[0264] 可以改變人IgGl間隔區以去除Fc結合基序。
[0265] CAR可以包含J0VI-1抗體，或其功能片段，如上文定義的。
[0266] CAR可以包含選自下組的氨基酸序列：SEQ ID No.33、34和35。
[0267] >SEQ_ID_33 具有 CD8 莖部間隔區的 J0VI-1CAR
[0268] METDTLLLffVLLVffIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHffVKQRPGQGLEffIG FINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRR EEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR
[0269] >SEQ_ID_34 具有 H-CH2-CH3pvaa間隔區的 J0VI-1CAR
[0270] METDTLLLffVLLVffIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHffVKQRPGQGLEffIG FINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSV FLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTV AFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADA HSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[0271] >SEQ_ID_35 具有 IgGl 鉸鏈間隔區的 J0VI-1CAR
[0272] METDTLLLffVLLVffIPGSTGEVRLQQSGPDLIKPGASVKMSCKASGYTFTGYVMHffVKQRPGQGLEffIG FINPYNDDIQSNERFRGKATLTSDKSSTTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGAGYNFDGAYRFFDFWGQGTTLTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQRLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFPGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLV VVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPG GGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[0273] 在上文給出的CAR序列中，6個⑶R的一個或多個各種獨立地可以包含或不包含與 SEQ ID No.7至12給出的序列相比一個或多個氨基酸突變(例如，取代），只要所得的CAR保 留了結合TRBC1的能力。
[0274]以上氨基酸序列的變體也可以用于本發明中，只要所得的CAR結合TRBC1或TRBC2 且不顯著地交叉反應。典型地，此類變體與SEQ ID No.33,34或35給出的序列的一個具有高 度的序列同一"性。
[0275] CAR的變體通常具有與如SEQ ID No.33,34或35給出的序列的一個至少約75%，例 如至少約80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性。
[0276] 核酸
[0277] 本發明進一步提供編碼本發明的第一個方面的試劑，如BiTE或CAR的核酸。
[0278] 核酸序列可以編碼包含如SEQ ID No.33,34或35所述的氨基酸序列的一個的CAR。
[0279] 如本文所使用的，術語"多核苷酸"，"核苷酸"和"核酸"旨在是彼此同義的。
[0280] 本領域的技術人員將理解由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的多核苷酸和核酸可 以編碼相同的多肽。另外，本領域的技術人員應當理解使用常規技術，可以制備核苷酸取 代，其不影響由此處所述的多核苷酸編碼的多肽序列，以反映多肽將在其中表達的任意特 定宿主生物中的密碼子選擇。
[0281] 根據本發明的核酸可以包括DNA或RNA。它們可以是單鏈的或雙鏈的。它們也可以 是在它們之中包括合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。對寡核苷酸的一些不同類型的修飾 是本領域已知的。這些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'末端的吖啶 (acridine)或聚賴氨酸鏈的添加。為了如本文所述的用途的目的，應當理解可以通過本領 域可用的任意方法修飾多核苷酸。為了提高感興趣的多核苷酸的體內活性或壽命可以進行 此類修飾。
[0282] 術語"變體"、"同源物"或"衍生物"關于核苷酸序列包括來自序列或對序列的一個 (或多個)核酸的任意取代，變異，修飾，置換，缺失或添加。
[0283] 載體
[0284] 本發明還提供載體，或載體的試劑盒，其包括本發明的一個或多個核酸序列。此類 載體可以用于將核酸序列引入宿主細胞中，使得其表達根據本發明的第一個方面的CAR。
[0285] 載體可以是例如質粒或病毒載體，如逆轉錄病毒載體或慢病毒載體，或基于轉座 子的載體或合成的mRNA。
[0286] 載體可以能夠轉染或轉導T細胞或NK細胞。
[0287] 細胞
[0288] 本發明還涉及包含根據本發明的第一個方面的CAR的細胞，如免疫細胞。
[0289]細胞可以包含本發明的核酸或載體。
[0290]細胞可以是T細胞或天然殺傷(NK)細胞。
[0291] T細胞可以是T細胞或T淋巴細胞，其是細胞介導的免疫中發揮中心作用的淋巴細 胞類型。通過細胞表面上的T細胞受體(TCR)的存在，可以將它們與其它淋巴細胞，如B細胞 和天然殺傷細胞(NK細胞)區分。存在多種類型的T細胞，如下文總結的。
[0292] 輔助T輔助細胞(TH細胞)在免疫過程中協助其它白細胞，包括B細胞成熟成為漿細 胞和記憶B細胞，和細胞毒性T細胞和巨噬細胞的活化。TH細胞在它們的表面上表達CD4。當 抗原提呈細胞(APCs)表面上的MHC II類分子將肽抗原呈遞至TH細胞時，它們變得活化。這 些細胞可以分化成幾個亞型的一種，包括!'!11，1'!12，1'!13，1'!117，1119，或了?!1，其分泌不同的細 胞因子以促進不同類型的免疫應答。
[0293] 細胞毒性T細胞(TC細胞，或CTL)破壞病毒感染的細胞和腫瘤細胞，并也牽連在移 植排斥中。CTL在它們表面上表達CD8。這些細胞通過結合與MHC I類聯合的抗原識別它們的 靶標，所述MHC I類存在于所有有核細胞的表面上。通過由調節T細胞分泌的IL-10,腺苷和 其它分子，CD8+細胞可以失活為無變應性狀態，其防止自身免疫性疾病，如實驗性自身免疫 性腦脊髓炎。
[0294]記憶T細胞是抗原特異性T細胞的亞組，所述抗原特異性T細胞在感染已經消退后 長期保持。一旦再暴露于它們的關聯(cognate)抗原，其快速擴增為大量的效應T細胞，從而 給免疫系統提供針對過去感染的"記憶"。記憶T細胞包括三個亞型：中央記憶T細胞(TCM細 胞)和兩類效應記憶T細胞(TEM細胞和TEMRA細胞）。記憶細胞可以是⑶4+或⑶8+。記憶T細胞 通常表達細胞表面蛋白⑶45R0。
[0295]調節T細胞(Treg細胞），以前稱為抑制T細胞，對于免疫耐受的維持是重要的。它們 主要的作用是關閉T細胞介導的免疫朝向免疫反應的結束和抑制逃脫胸腺中的陰性選擇過 程的自身反應Τ細胞。
[0296] 已經描述了兩類主要的⑶4+Treg細胞:天然發生的Treg細胞和適應Treg細胞。
[0297] 天然發生的Treg細胞（也稱為CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞)在胸腺中產生，并已經 與形成中的T細胞和已經使用TSLP活化的髓樣(CDllc+)以及漿細胞樣(CD123+)樹突細胞兩 者之間的相互作用相連。可以通過稱為FoxP3的細胞內分子的存在，將天然發生的Treg細胞 與其它T細胞區分。F0XP3基因的突變可以阻止調節性T細胞的發育，導致致命的自身免疫病 IPEXo
[0298] 適應Treg細胞(也稱為Trl細胞或Th3細胞)可以在正常免疫應答期間起源。
[0299]細胞可以是天然殺傷細胞(或NK細胞）。疆細胞形成固有免疫系統的一部分。NK細 胞以不依賴MHC的方式提供對來自病毒感染細胞的固有信號的快速應答。
[0300] NK細胞（屬于固有淋巴樣細胞組）定義為大顆粒淋巴細胞（LGL)并構成第三種細 胞，其與產生B和T淋巴細胞的共同淋巴樣前體細胞區分。已知NK細胞在骨髓、淋巴結、脾、扁 桃體和胸腺中分化并成熟，然后它們在那里進入循環。
[0301 ]本發明的CAR細胞可以是上述任意細胞類型。
[0302]可以離體從患者自身的外周血(第一方），或在來自供體外周血的造血干細胞移植 物的背景(第二方）中，或來自無關聯供體的外周血(第三方)創建表達根據本發明的第一個 方面的CAR的T或NK細胞。
[0303] 或者，表達根據本發明的第一個方面的CAR的T或NK細胞可以來源于可誘導祖細胞 或胚胎祖細胞離體分化為T或NK細胞。或者，可以使用保留了其溶解功能并可以起治療劑作 用的永生化的T細胞系。
[0304] 在所有這些實施方案中，通過許多方法的一種引入編碼CAR的DNA或RNA生成CAR細 胞，所述方法包括使用病毒載體轉導，使用DNA或RNA轉染。
[0305]本發明的CAR細胞可以是來自受試者的離體T或NK細胞。T或NK細胞可以來自外周 血單核細胞(PBMC)樣品。在使用編碼根據本發明的第一個方面的CAR的核酸轉導之前，可以 活化和/或擴增T或NK細胞，例如通過使用抗CD3單克隆抗體處理。
[0306] 本發明的T或NK細胞可以通過以下制成：
[0307] (i)從受試者或以上列出的其它來源分離含有T或NK細胞的樣品；和
[0308] (ii)使用編碼本發明的CAR的核酸序列轉導或轉染T或NK細胞。
[0309] 接著，可以純化T或NK細胞，例如基于抗原結合多肽的抗原結合域的表達選擇。
[0310] 本發明還提供試劑盒，其包括包含根據本發明的第一個方面的CAR的T或NK細胞。 [0311] 藥物組合物
[0312]本發明還涉及含有多個表達本發明第一個方面的CAR的細胞的藥物組合物。藥物 組合物可以另外包含藥學上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可以任選地包含 一種或多種另外的藥學上活性的多肽和/或化合物。此類配制劑可以是例如為適用于靜脈 內輸注的形式。
[0313] T細胞淋巴瘤和/或白血病
[0314] 本發明涉及用于治療T細胞淋巴瘤和/或白血病的試劑，細胞和方法。
[0315] 用于治療T細胞淋巴瘤和/或白血病的方法涉及試劑的治療用途。本文中可以將試 劑施用至患有存在的T細胞淋巴瘤和/或白血病疾病的受試者，以減輕，降低或改善與疾病 相關的至少一種癥狀和/或減慢，降低或阻斷疾病的進展。
[0316] 本發明的方法可以用于與表達T細胞受體(TCR)的細胞的克隆性擴增相關的任意 淋巴瘤和/或白血病，所述T細胞受體包含β恒定區。因而，本發明涉及用于治療涉及惡性T細 胞的疾病的方法，所述惡性Τ細胞表達包含TRBC的TCR。
[0317] 本發明的方法可以用于治療Τ細胞淋巴瘤，其中惡性Τ細胞表達包含TRBC的TCR。 "淋巴瘤"用于本文根據其標準含義指代通常在淋巴結中發展，但也可以影響脾，骨髓，血液 和其它器官的癌癥。淋巴瘤通常表現為淋巴樣細胞的實體瘤。與淋巴瘤相關的原發性癥狀 是淋巴結病，但繼發性(Β)癥狀可以包括發熱，盜汗，消瘦，食欲不振，乏力，呼吸窘迫和瘙 癢。
[0318] 本發明的方法可以用于治療Τ細胞白血病，其中惡性Τ細胞表達包含TRBC的TCR。 "白血病"用于本文根據其標準含義指代血液或骨髓的癌癥。
[0319]以下是可以通過本發明的方法治療的疾病的說明性的，非窮舉列表。
[0320] 外周T細胞淋巴瘤
[0321]外周T細胞淋巴瘤是相對不常見的淋巴瘤，并占所有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的少于 10%。然而，它們與侵襲性的臨床過程相關，且大多數T細胞淋巴瘤的原因和精確的細胞起 源仍然沒有很好的定義。
[0322] 淋巴瘤通常首先表現為頸部，腋下或腹股溝的腫大。另外的腫大可以發生在其它 淋巴結定位的地方例如在脾中。一般來說，擴大的淋巴結可以侵犯血管，神經或胃部的空 間，分別導致腫脹的手臂和腿，導致刺痛和麻木，以及導致飽的感覺。淋巴瘤癥狀還包括非 特異性癥狀例如發熱，寒戰，不明原因的體重減輕，盜汗，嗜睡和瘙癢。
[0323] WHO分類利用形態學和免疫表型特征連同臨床方面以及在一些情況下遺傳學來劃 定外周T細胞淋巴瘤的預后和治療上有意義的分類(Swerdlow等;WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues.4th ed.;Lyon:IARC Press;2008)〇 贅生性T細胞的解剖定位部分平行于它們所提議的正常細胞的對應物和功能，因此T細胞淋 巴瘤與淋巴結和外周血相關。該方法允許更好的理解一些T細胞淋巴瘤的臨床表現，包括它 們的細胞分布，形態學的一些方面和甚至相關的臨床發現。
[0324] 最普遍的T細胞淋巴瘤是外周T細胞淋巴瘤，非特指型（PTCL-N0S)，包括總體的 25%，接著是血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(AITL) (18.5% )。
[0325] 外周T細胞淋巴瘤，非特指型(PTCL-N0S)
[0326] ?了(^403構成所有外周1'細胞淋巴瘤和疆/1'細胞淋巴瘤的超過25%且是最常見的 亞型。其通過排除診斷確定，不對應在目前WHO 2008中列出的任意特定成熟T細胞淋巴瘤實 體。因此其類似于彌散性大B細胞淋巴瘤，非特指型(DLBCL-N0S)。
[0327] 大多數患者是成年人，其中中位數年齡為60且男性比女性比率2:1。大部分的病例 是結(nodal)起源的，然而，結外表現發生于約13%的患者中，最常見涉及皮膚和胃腸道。 [0328]該細胞學范圍非常廣，范圍從多形的到單形的。已經描述了三種形態學上定義的 變體，包括淋巴上皮樣(Lennert)變體，T-區變體和濾泡變體。PTCL的淋巴上皮樣變體含有 豐富的背景上皮樣組織細胞且通常是⑶8陽性的。其已經與較好的預后相關。PTCL-N0S的濾 泡變體正在成為潛在的獨特臨床病理學實體。
[0329] 大部分PTCL-N0S具有成熟的T細胞表型且大多數病例是⑶4陽性的。75 %的病例表 現出至少一種全Τ細胞標志物(CD3，CD2，CD5或⑶7)的可變缺失，其中⑶7和⑶5是經常下調 的。可以表達⑶30和罕見地⑶15,其中⑶15是不利的預后特征。盡管不常見，CD56的表達也 具有負面的預后影響。另外的不利病理預后診斷因素包括基于ΚΙ-67表達的大于25%的增 殖速率，和大于70%的轉化細胞的存在。這些淋巴瘤的免疫表型分析提供很少的對它們生 物學的了解。
[0330] 血管免疫母細胞Τ細胞淋巴瘤(AITL)
[0331] AITL是系統性疾病，特征在于涉及淋巴結的多形性浸潤，突出的高內皮靜脈(HEV) 和濾泡狀樹突細胞(FDC)網狀組織的血管周圍擴張。認為AITL是來源于濾泡輔助型(??Η)αβ Τ細胞的從頭(de-n 〇V〇)T細胞淋巴瘤，通常發現于生發中心。
[0332]在外周T細胞淋巴瘤和NK/T細胞淋巴瘤中，AITL是第二常見的實體，構成病例的約 18.5%。其在中年至老年成人中發生，其中中位數年齡為65歲齡，并在男性和女性中約相等 的發病率。臨床上，患者通常具有晚期階段疾病，具有全身性淋巴結病，肝脾腫大和突出的 全身癥狀。通常存在皮疹及關聯的瘙癢。通常存在與自身免疫現象有關的多克隆高球蛋白 血癥。
[0333] AITL中描述了三種不同的形態學模式。AITL的早期病變(模式I)通常表現出保守 的架構，具有特征性增生性濾泡。贅生性增殖定位于濾泡的外圍。在模式II中，結節構架部 分被消除，保留少數的退化濾泡。被膜下淋巴竇得到保留甚至擴張。副皮質區含有樹枝狀的 HEV且存在B細胞濾泡外的FDC增殖。贅生性細胞為小至中等大小，具有最小的細胞學異型性 (cytologicatypia)。它們通常具有清澈到暗淡的細胞質，并可以表現出不同的T細胞膜。多 形性炎癥背景通常是明顯的。
[0334]盡管AITL是T細胞惡性腫瘤，但存在B細胞和漿細胞的特征性擴增，其可能反映了 贅生性細胞作為TFH細胞的功能。EBC陰性和EBV陽性B細胞兩者都存在。偶爾，非典型的B細 胞可以在形態學上和免疫表型上類似霍奇金/里德-斯特恩伯格樣細胞，有時導致與該實體 的診斷混淆。AITL中的B細胞增殖可以是廣泛的，且一些患者形成了次級EBV陽性的彌散性 大B細胞淋巴瘤(DLBCL)或更罕見地EBV陰性的B細胞腫瘤，通常伴隨漿細胞分化。
[0335] AITL的贅生性⑶4陽性T細胞表現出⑶10和⑶279(ro-l)的強表達和CXCL13陽性。 通過對HEV的粘附，B細胞活化，漿細胞分化和roc網狀組織的擴張，CXCL13引起增加的B細胞 向淋巴結募集，這些都有助于aitl的形態學和臨床特征。濾泡周圍的腫瘤細胞中強烈的ro-1表達在區分AITL模式I與反應性濾泡及副皮質增生中是特別有用的。
[0336] PTCL-N0S的濾泡變體是具有??Η表型的另一種實體。與AITL對比，其不具有突出的 HEV或roc網狀組織的濾泡外擴張。贅生性細胞可以形成濾泡內聚集，模擬B細胞濾泡淋巴 瘤，而且還可以具有濾泡間生長模式或涉及擴增的外套層(mantle zone)。臨床上，PTCL-N0S的濾泡變體與AITL不同，因為患者更經常表現為部分淋巴結受累的早期疾病且可以缺 乏與AITL相關的全身癥狀。
[0337] 漸變性大細胞淋巴瘤(ANAPLASTIC LARGE CELL LYMPH0MA，ALCL)
[0338] ALCL可以細分為ALCL-"漸變性淋巴瘤激酶"（ALK)+或ALCL-ALK-。
[0339] ALCL-ALK+是外周T細胞淋巴瘤中被最好地定義的實體之一，特征性的"標志細胞" 攜帶馬蹄鐵形核并表達ALK和CD30。其占所有外周T細胞和NK細胞淋巴瘤的約7%并在生命 的第一個三十年中最常見。患者通常表現為淋巴結病，但結外部位(皮膚，骨，軟組織，肺， 肝)的累及和B癥狀是普遍的。
[0340] ALCL，ALK+表現出廣泛的形態學范圍，其中描述了 5種不同的模式，但是所有的變 體含有一些標志細胞。標志細胞具有怪異的馬蹄鐵或腎形核，和突出的核周嗜曙紅高爾基 區。腫瘤細胞以黏著的模式生長，具有竇受累的偏好。在小細胞變體中，較小的腫瘤細胞占 主導地位，而在淋巴組織細胞變體中豐富的組織細胞掩蔽了腫瘤細胞的存在，所述腫瘤細 胞中許多是小的。
[0341] 通過定義，所有的病例表現出ALK和⑶30陽性，其中在較小的腫瘤細胞中表達通常 較弱。通常存在全T細胞標志物的缺失，其中75%的病例缺乏⑶3的表面表達。
[0342] ALK表達是由染色體2p23上的ALK基因向許多配對基因之一重排組成的特征性復 發性遺傳改變的結果，導致嵌合蛋白的表達。最常見的配對基因，在75%的病例中發生，是 染色體5q35上的核仁磷酸蛋白（NPM1)，導致t (2; 5) (p23; q35)。在不同的轉位變體中，ALK的 細胞分布可以根據配對基因而變化。
[0343] ALCL-ALK-在2008WH0分類中被納入臨時類別。其定義為⑶30陽性T細胞淋巴瘤，其 形態學上不能與具有黏著生長模式的ALCL-ALK+區分，并存在標志細胞，但缺少ALK蛋白表 達。
[0344] 與ALCL-ALK+(其在兒童和年輕人中更常見）不同，患者通常是年齡在40和65之間 的成年人。ALCL-ALK-可以涉及淋巴結和結外組織兩者，但后者比ALCL-ALK+中較不常見。通 過具有典型"標志"特征的粘著性贅生性細胞的層，ALCL-ALK-的大多數病例表現出淋巴結 架構的消失。與ALCL-ALK+不同，沒有識別小細胞形態學變體。
[0345] 不像其ALK+對應物，ALCL-ALK-表現出更大的對表面T細胞標志物表達的保留，而 細胞毒性標志物和上皮膜抗原(EMA)的表達較不可能。ALCL-ALK-和ALCL-ALK+中的基因表 達標簽（signature)和復發性染色體不平衡不同，確認了它們是分子水平和遺傳水平的不 同實體。
[0346] ALCL-ALK-在臨床上與ALCL-ALK+和PTCL-N0S兩者不同，其中在這三種不同的實體 中預后存在顯著差異。ALCL-ALK-的5年總體存活報道為49 %，其不像ALCL-ALK+(為70 % ) - 樣好，但同時比PTCL-N0S(32 % )明顯更好。
[0347] 腸病相關的T細胞淋巴瘤(EATL)
[0348] EATL是侵襲性的贅生物，認為其來源于腸的上皮內T細胞。2008WH0分類中認證了 兩種形態學上，免疫組織化學和遺傳學上不同類型的EATL:I型(代表了大多數的EATL)和II 型(構成10-20 %的病例）。
[0349] I型EATL通常與明顯的或臨床上無癥狀的麩質敏感性腸病相關，且在北歐出身的 患者中由于該群體中腹腔疾病的高發病率而更常見。
[0350] 最常見地，EATL的病變存在于空腸或回腸(90%的病例），其中罕見表現在十二指 腸，結腸，胃，或胃腸道外的區域中。腸病變通常是多病灶的，伴有黏膜性潰瘍。EATL的臨床 過程是侵襲性的，其中大多數患者在1年內死于疾病或疾病的并發癥。
[0351] EATL I型的細胞學譜是廣泛的，且一些病例可以含有漸變性(anaplastic)細胞。 存在多形性炎癥背景，其可以在某些病例中掩蓋贅生性組分。腫瘤臨近區域中的腸黏膜通 常表現出腹腔疾病的特征，具有絨毛的鈍化和上皮內淋巴細胞數量(IEL)的增加，其可以代 表損傷前體細胞。
[0352] 通過免疫組織化學，贅生性細胞通常是CD3+CD4-CD8-CD7+CD5-CD56-0F1+，并含有 細胞毒性顆粒相關蛋白（TIA-1，粒酶B，穿孔蛋白）XD30部分表達在幾乎所有的病例中。 ⑶103,其是黏膜歸巢受體，可以在EATL中表達。
[0353] II型EATL，也稱為單型⑶56+腸 T細胞淋巴瘤，定義為由小和中等大小單型T細胞組 成的腸腫瘤，所述T細胞表達CD8和CD56兩者。通常存在腫瘤在黏膜內的橫向擴散，而沒有炎 性背景。大多數病例表達Y STCR，然而存在與αβτα?相關的病例。
[0354] Π 型EATL具有更比I型EATL更多的世界廣泛分布，并通常在亞裔或西班牙裔人群 中看到，其中腹腔病是罕見的。在歐洲血統EATL的個體中，II代表了腸 Τ細胞淋巴瘤的約 20 %，在病例的至少一個亞群中具有腹腔病的歷史。臨床過程是侵襲性的。
[0355] 肝脾Τ細胞淋巴瘤(HSTL)
[0356] HSTL是一種侵襲性系統贅生物，通常來源于內在免疫系統的γ δ細胞毒性Τ細胞， 然而，在罕見的病例中其也可以來源于αβΤ細胞。它是最罕見的Τ細胞淋巴瘤的一種，并通常 以較強的男性主導性影響青少年和青年（中位數年齡，35歲）。
[0357] 結外ΝΚ/Τ細胞淋巴瘤鼻型
[0358]結外ΝΚ/Τ細胞淋巴瘤鼻型是侵襲性的疾病，通常具有破壞性的中線病變和壞死。 大多數病例是ΝΚ細胞衍生的，但一些病例來源于細胞毒性Τ細胞。其普遍地與埃巴病毒 (EBV)相關。
[0359]皮膚Τ細胞淋巴瘤
[0360]本發明的方法也可以用于治療皮膚Τ細胞淋巴瘤。
[0361]皮膚Τ細胞淋巴瘤(CTCL)特征在于惡性Τ細胞向皮膚的迀移，其導致出現各種損 傷。這些損傷隨著疾病的進展改變形狀，通常開始于表現為疹，并且最終形成斑和腫瘤，之 后轉移至身體的其它部位。
[0362] 皮膚Τ細胞淋巴瘤包括以下說明性的，非窮舉列表中提到的那些：蕈樣肉芽腫病 (mycosis fungoides)，佩吉特樣網狀細胞增多癥(pagetoid reticulosis)，塞扎里綜合癥 (S6zary syndrome)，肉芽腫性皮膚松弛(granulomatous slack skin)，淋巴瘤樣丘疹病 (lymphomatoid papulosis)，慢性苔癬樣糖疼（pityriasislichenoideschronica)，CD30+ 皮膚T細胞淋巴瘤，繼發性皮膚CD30+大細胞淋巴瘤，非蕈樣肉芽腫CD30-皮膚大T細胞淋巴 瘤，多形性Τ細胞淋巴瘤（pleomorphic T-cel 1 lymphoma)，倫納特淋巴瘤（Lennert lymphoma)，皮下T細胞淋巴瘤和血管中心性淋巴瘤(angiocentric lymphoma)。
[0363] CTCL的征兆和癥狀根據特定的疾病不同，其中兩種最常見的類型是蕈樣肉芽腫病 和塞扎里綜合癥。典型的蕈樣肉芽腫病分為三個階段：
[0364]斑點(Patch)(萎縮性或非萎縮性）：非特異性皮炎，下軀干和臀部上的斑點；最小/ 沒有瘙癢；
[0365]斑塊(Plaque):強烈的瘙癢斑塊，淋巴結病;和
[0366]腫瘤:容易發生潰瘍。
[0367]塞扎里綜合癥由紅皮病和白血病定義。征兆和癥狀包括皮膚水腫，淋巴結病，手掌 和/或足底角化過度，脫發，指甲營養不良，瞼外翻(ectropion)和肝脾腫大。
[0368]在所有的原發性皮膚淋巴瘤中，65%是T細胞類型的。最常見的免疫表型是⑶4陽 性。對于這些疾病沒有共同的病理生理學，因為術語皮膚T細胞淋巴瘤包含了極其多種的病 癥。
[0369] 皮膚Τ細胞淋巴瘤（即蕈樣肉芽腫病）的形成的主要病因機制尚未闡明。蕈樣肉芽 腫病之前可以有Τ細胞介導的慢性炎性皮膚疾病，其可以偶爾發展為致命的淋巴瘤。
[0370] 原發性皮膚 ALCL(C-ALCL)
[0371] C-ALCL通常不能通過形態學與ALC-ALK-區分。其定義為具有漸變性，多形性，或免 疫母細胞形態的大細胞的皮膚腫瘤，其中多于75%的細胞表達CD30。與淋巴瘤樣丘疹病 (LyP)-起，C-ALCL屬于原發性皮膚⑶30陽性T細胞淋巴增生性病癥的范圍，其以組包括蕈 樣肉芽腫病之后第二普遍的皮膚T細胞淋巴增生的組。
[0372] 免疫組織化學染色概況與ALCL-ALK-相當相似，其中較大比例的病例對于細胞毒 性標志物染色呈陽性。至少75%的腫瘤細胞應當是⑶30陽性的。也可以表達⑶15,且當淋巴 結受累發生時，與典型霍奇金淋巴瘤的區分可以是困難的。ALCL-ALK+的罕見病例可以表現 為局部的皮膚病變，并可以類似C-ALCL。
[0373] T細胞急性淋巴母細胞白血病
[0374] T細胞急性淋巴母細胞白血病(Τ-ALL)分別占所有兒童和成人群體的ALL的約15% 和25%。患者通常具有高白細胞計數并且可以表現為臟器腫大，特別是縱隔擴大和CNS受 累。
[0375] 本發明的方法可以用于治療T-ALL，其與表達包含TRBC的TCR的惡性T細胞相關。
[0376] T細胞幼淋巴細胞白血病
[0377] T細胞幼淋巴細胞白血病（T-cell-prolymphocytic leukemia,Τ-PLL)是具有侵襲 行為的成熟T細胞白血病，并對于血液，骨髓，淋巴結，肝，脾和皮膚受累具有偏好。T-PLL主 要影響超過30歲的成人。其它名字包括T細胞慢性淋巴細胞白血病，"多瘤(knobby)"型T細 胞白血病，和T-幼淋巴細胞白血病/T細胞淋巴細胞白血病。
[0378] 在外周血中，T-PLL由中等大小的淋巴細胞組成，具有單個核和嗜堿性胞質，偶爾 具有泡或突出。核通常是圓形到橢圓形形狀，其中偶爾患者具有更不規則核輪廓的細胞，所 述核輪廓與塞扎里綜合癥中看到的腦狀核形相似。小細胞變體構成所有T-PLL病例的20%， 而塞扎里細胞樣(腦狀)變體在5%的病例中見到。
[0379] T-PLL具有成熟（胸腺后）T淋巴細胞的免疫表現，且贅生性細胞通常對于全T抗原 ⑶2,⑶3和⑶7陽性并對于TdT和⑶la陰性。免疫表型⑶4+/⑶8-存在于60%的病例中，⑶4+/ ⑶8+免疫表型存在于25%，而⑶4-/⑶8+免疫表型存在于15%的病例中。
[0380] 藥物組合物
[0381] 本發明的方法可以包括施用藥物組合物形式的試劑的步驟。
[0382] 試劑可以與藥學上可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑一起施用。藥學載體，賦 形劑或稀釋劑的選擇可以關于預定的施用途徑和標準的醫藥實踐選擇。作為載體，賦形劑 或稀釋劑(在載體，賦形劑或稀釋劑外），藥物組合物可以包括任意適合的結合劑，潤滑劑， 懸浮劑，包被劑，增溶劑，和其它載體試劑。
[0383] 施用
[0384] 試劑的施用可以使用多種途徑的任一種完成，所述途徑使得活性成分生物可利 用。例如，可以通過□服和腸胃外途徑，腹膜內，靜脈內，皮下，經皮，肌肉內，經由局部遞送 例如通過導管或支架實現試劑的施用。
[0385] 典型地，內科醫生將確定對于個體受試者最適合的實際劑量，并它將隨著具體患 者的年齡，體重和反應而變化。試劑是使得其足以降低或耗竭表達TRBC1或TRBC2的克隆性T 細胞的數量。
[0386] 用途
[0387] 本發明還提供試劑，用于根據第一個方面的方法治療T細胞淋巴瘤中的用途。試劑 可以是上文定義的任意試劑。
[0388] 本發明還涉及如上文定義的試劑在制備用于根據第一個方面的方法治療T細胞淋 巴瘤的藥物中的用途。
[0389] 試劑盒
[0390] 本發明進一步提供包含如上文所定義的試劑的試劑盒，用于根據第一個方面的方 法治療T細胞淋巴瘤中的用途。
[0391] 試劑盒還可以包含適合用于確定惡性T細胞的TRBC的試劑。例如，試劑盒可以包含 對于TRBC1或TRBC2特異性的PCR引物或抗體。
[0392] 用于確定T細胞淋巴瘤和/或白血病的方法
[0393] 本發明進一步涉及用于確定受試者中T細胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括確定 來自受試者的樣品中TRBC1或TRBC2陽性的T細胞比例的步驟。
[0394] T細胞淋巴瘤涉及個體惡性T細胞的克隆性擴增。因此，可以通過確定來源于患者 的樣品中TRBC1或TRBC2T細胞的比例鑒定受試者中T細胞淋巴瘤的存在。
[0395] 樣品可以是外周血樣品，淋巴樣品或直接取自腫瘤的樣品，例如活組織檢查樣品。
[0396] TRBC1或TRBC2陽性的總T細胞的比例（其指示T細胞淋巴瘤或白血病的存在）可以 是例如細胞總群體的80，85，90，95，98或99%。
[0397] 方法可以涉及通過活組織檢查或樣品中T細胞的不同群體確定浸潤。本文中，樣品 中T細胞總群體的80，85，90，95，98或99 %是TRBC1或TRBC2的情況下，指示T細胞淋巴瘤或白 血病的存在。
[0398] 可以通過確定樣品中表達⑶3，⑶4，⑶8和/或⑶45的細胞的數量，確定樣品中的總 T細胞。也可以使用這些標志物的組合。
[0399] 可以使用本領域已知的方法確定樣品中表達TRBC 1或TRBC2的總T細胞的比例，例 如流式細胞術，免疫組織化學或熒光顯微術。
[0400] 本發明將通過實施例的方式進一步描述，其是為了起到幫助本領域的普通技術人 員實施本發明，而不意圖以任何方式限制本發明的范圍。 實施例
[0401 ] 實施例1-區分表達TRBC1和TRBC2的細胞
[0402] J0VI抗體先前已經由Viney等人公開(Hybridoma; 1992; 11(6) ;701_713)且是商品 化的(Abcam，ab5465)。本發明人確定了 J0VI-1能夠基于TRBC1或TRBC2的特異性表達區分細 胞。
[0403]本發明人生成了提供TCR的完全可變和恒定區的兩種質粒載體，其差異僅在于 TRBC1或TRBC2的表達。這些質粒用于通過293T-細胞的瞬時轉染生成逆轉錄病毒上清。該上 清用于穩定轉導Jurkats TCR敲除T細胞(在TCRbeta鏈基因座處具有突變的T-ALL細胞系， 所述突變阻止該鏈的表達，從而整個表面TCR/CD3復合物的表達）。這導致除了 TRBC1或 TRBC2的表達外相同的細胞系的生成。這些細胞系的染色揭示表面TCR/CD3復合物的充分表 達，且僅表達TRBC1的細胞使用J0VI-1抗體染色（圖4)。
[0404] 實施例2-正常供體⑶4+和⑶8+T細胞含有不同的TRBC1陽性和TRBC-1陰性群體
[0405]發明人在正常供體的原代人T細胞上測試了 J0VI-1抗體。這些分析揭示了所有的 供體具有一定比例的表達TRBC1的⑶4+和⑶8+T細胞兩者和一定比例的不表達TRBC1的每 種。約20-50 %的正常CD4+和CD8+T細胞是TRBCl+ve (圖6和7)。
[0406] 實施例3-表達TCR的克隆性T細胞系是TRBC1陽性或陰性的
[0407] 細胞系來源于患者中原始克隆性腫瘤群體。表達TCR的T細胞系的染色揭示T細胞 表達TRBC1或TRBC2,確定了這作為克隆性的標志物。在測試的三種T細胞系中，Jurkats細胞 (已知為TRBC1+)而不是HPB-ALL或HD-Mar-2 (已知為TRBC2+)細胞被J0VI-1染色，支持TRBC1 或2的排他性表達(圖8)。
[0408]實施例4-患有T幼淋巴細胞白血病的患者中的原代克隆性T細胞是TRBC1陽性或陰 性的
[0409 ] -致地，從患有T幼淋巴細胞白血病（T-PLL)的患者的外周血提取的克隆性T細胞 是TRBC1陽性或TRBC1陰性。
[0410]實施例5-對于TCBC1獨特的殘基的突變效果
[0411]生成了編碼除了TCRi3鏈恒定區中的雜交TRBC1/2突變外相同的TCR的質粒載體。分 析表明，J0VI-1識別TCRi3恒定鏈位置3和4處的殘基的差異，表明這些殘基對于抗體識別是 可接近的，且可能是生成區分TRBC1與TRBC2或TRBC2與TRBC1的試劑的最好靶點（圖5)。
[0412] 實施例6-對表達TRBC1而不是TRBC2TCR的T細胞的特異性溶解
[0413] 將野生型Jurkat T細胞(CD34-，TRBC1+)與使用和CD34標志物基因共表達的TRBC2 轉導的ΤΟ?αβ敲除Jurkat T細胞(CD34+TRBC2+)混合。將這些細胞與J0VI-1單獨孵育，或與 J0VI1和補體孵育1小時。洗滌細胞并對于CD34，膜聯蛋白V和7-AAD染色。通過流式細胞術分 析細胞。
[0414] 如通過膜聯蛋白-V陰性和71AAD暗淡群體限定的活群體中⑶34表達示于圖9中。觀 察到了對TRBC1T細胞(⑶34-)的選擇性殺傷（圖9)。
[0415] 野生型Jurkat T細胞是天然TRBC1+且不表達截短的⑶34標志物基因。如上文所 述，本發明人通過使用逆轉錄病毒載體轉導τα?αβ敲除的Jurkat T細胞衍生TRBC2+Jurkat 系，所述逆轉錄病毒載體編碼TRBC2TCR以及截短的CD34標志物基因。然后將這些T細胞混合 在一起。接著，本發明人將該T細胞與J0VI-1單獨或與J0VI1和補體孵育1小時。便利地，本發 明人可以通過⑶34標志物基因的染色區分TRBC1和2群體，并從而避免無法檢測TRBC1TCR (由于長時間暴露于抗TCR mAb的TCR內化）。洗滌細胞并對于CD34，膜聯蛋白V和7-AAD染色。 通過流式細胞術分析細胞。通過在活細胞（即，膜聯蛋白V陰性和7-AAD暗淡的細胞)上設門， 本發明人可以確定在補體的存在下，TRBC1T細胞被J0VI-1選擇性殺傷(圖9)。
[0416] 實施例7-多克隆埃巴病毒(EBV)特異性T細胞可以分為兩個大約相等的TRBC1/2群 體
[0417] 從正常血液供體取出外周血T細胞。分離了單核細胞且大多數的細胞冷藏保存。使 用EBV的實驗室株(B95-8)感染少量細胞。幾周里，永生化的EBV感染的細胞系，稱為成淋巴 細胞樣細胞系(LCL)出現。此類細胞系已知呈遞大量不同的EBV抗原。將先前冷藏保存的單 核細胞解凍并在IL2的存在下重復地使用該LCL系每周刺激持續4周。該過程從外周血單核 群體選擇性擴增EBV特異性T細胞。還已知此類過程導致多克隆系，其中>90 %的T細胞為EBV 特異性并代表了供體的EBV免疫系統。通過表現出高程度殺傷自體LCL而非異體LCL或K562 細胞，檢查了該系的特異性（圖l〇a)。接著使用JOVI-1染色該細胞系并表明含有TRBC1和 TRBC2T細胞的大致相等混合物（圖10b)。
[0418]因此，如果施用耗竭TRBC1或TRBC2區室的治療劑，那么將保留足夠的EBV免疫力。 由于EBV免疫力認為是免疫應答的模式系統，假設合理假定對其它病原體的免疫力將得到 同等保留。
[0419]實施例8-循環外周τ細胞淋巴瘤的J0VI-1染色
[0420]假說是T細胞淋巴瘤(為克隆性的）將表達TRBC1或TRBC2T細胞受體，而多克隆的正 常T細胞將包含T細胞的群體，所述T細胞為具有TRBC1或TRBC2的那些的混合物。為了證明這 個，獲得了來自患者的T細胞淋巴瘤的血液樣品，所述患者的淋巴瘤為外周血中循環的。分 離了外周血單核細胞并使用一組抗體染色，其包括CD5和J0VI1。首先鑒定了總T細胞群體 (其含有淋巴瘤和正常T細胞兩者）。該群體由具有正常（明亮)CD5表達的T細胞和具有中等/ 暗淡CD5表達的T細胞組成。前者代表了正常T細胞，而后者代表了淋巴瘤。接著，調查了 J0VI-1結合且結果示于圖12中。
[0421] CD5中等和暗淡群體(腫瘤)都為TRBC2陽性。
[0422] 實施例9-闡明J0VI-1的VH/VL序列
[0423] 使用5'RACE用與小鼠 IgG CH1的恒定區和小鼠 kappa的恒定區退火的引物，我們從 雜交瘤J0VI-1分離了單個功能性VH序列和單個功能性VL序列。VH和VL的序列分別為SEQ ID 1和2(見上文hVH和VL注釋的序列示于圖11中。
[0424] 將這些VH和VL序列分別與小鼠 IgG重鏈和kappa輕鏈以符合讀碼框的方式克隆回 去。另外，將VH和VL融合以形成單鏈可變片段（scFv)，將這融合到小鼠 IgG2a的鉸鏈-CH2-CH3區以創建scFV-FV。scFV的氨基酸序列在發明詳述中作為SEQIDNo.3給出。通過轉染到 293T細胞中，生成了重組抗體和重組scFv-Fc。與來自雜交瘤的J0VI-1-起，對以下細胞進 行了染色：具有TCR敲除的Jurkats ;野生型Jurkats ;使用與eBFP2共表達的TRBC1轉導的 Jurkat TCR敲除和使用與eBFP2共表達的TRBC2轉導的Jurkat TCR敲除。來源于J0VI的重組 抗體和scFv-Fc兩者都結合TRBC2，確認了我們鑒定了正確的VH/VL，且J0VI-1VH/VL可以折 疊為scFv。該結合數據示于圖13中。
[0425] 實施例10-基于J0VI-1的CAR的功能
[0426] 將JOVI-lscFv克隆到CAR形式中。為了闡明哪種間隔區長度將產生最優的基于 J0VI-1的CAR，使用人Fc間隔區，人⑶8莖部間隔區或來源于IgGl鉸鏈的間隔區生成了第三 代CAR(圖4)。使用這些CAR轉導來自正常供體的原代人T細胞并比較對Jurkats和TRC敲除的 Jurkats的殺傷。具有JOVI-lscFv的CAR(其具有IgGl鉸鏈間隔區或CD8莖部間隔區）殺傷 Jurkats而不殺傷TCR敲除的Jurkats (圖5 )，證明了預期的特異性。由于使用CAR轉導的正常 供體T細胞應當具有TRB1/2T細胞的混合物，預期該培養物將"自凈化(self-purge)"。事實 上，觀察到了這點。圖6中示出了 CAR T細胞培養物的J0VI-1染色，其成為100 % TRBC2陰性 的。
[0427] 材料和方法
[0428] 證明J0VI-1的特異性
[0429]生成了三順反子逆轉錄病毒盒（cassette)，其編碼良好表征的人TCR以及便利的 標志物基因。使用從頭基因合成從重疊的寡核苷酸生成了TCRa和β鏈的編碼序列。將這些鏈 以符合讀碼框的方式與口蹄疫2Α肽連接以允許共表達。通過PCR從cDNA克隆截短的CD34標 志物基因并使用內部核糖體進入序列（IRES)與TCR共表達。將該盒引入逆轉錄病毒載體中。 通過重疊 PCR，使用引入所需突變的引物，通過剪接生成了該構建體的變體。通過Sanger測 序確認了構建體的準確性(>6抑〇;^)。]\^1^76系是良好表征的]\^士11:1'細胞系衍生物， 其具有TCRa和β鏈兩者敲除。使用標準技術用以上逆轉錄病毒載體轉導該Jurkat系。
[0430] Jurkats，外周血T細胞和細胞系的染色和分析
[0431] 從ECACC獲得了 Jurkats并如上文詳細描述的那樣工程化改造。其它T細胞系也從 ECACC獲得。外周血通過靜脈穿刺從正常供體抽取。血液經蔗聚糖處理(ficolled)以分離單 核細胞。細胞使用J0VI-1以及識別所有TCR和CD3的商品化單克隆抗體染色。在工程化T細胞 的情況下，細胞使用識別CD34的抗體染色。在外周血單核細胞的情況下，細胞使用識別CD4 和CD8的抗體染色。購買的抗體與適合的熒光團綴合，使得使用流式細胞儀分析細胞同時可 以獲得獨立的熒光信號。
[0432] 證明對TRBC1T細胞的特異性溶解
[0433] 將野生型Jurkat T細胞（TRBC1-TCR)和具有引入的TRBC2TCR的JurkatT細胞TCR K0以1:1的比率混合在一起。接著，在補體的存在或不存在下將Jurkat的該混合物與lug/ml 的J0VI-1單克隆抗體孵育。四小時后，細胞使用膜聯蛋白-V和7AAD和CD34染色。便利地，標 志物基因 CD34可以區分野生型（TRBC1)和轉基因（TRBC2)Jurkats。通過流式細胞術分析細 胞群體。通過在流式細胞事件上設門選擇性研究活細胞，所述事件為對于膜聯蛋白-V呈陰 性和對于7AAD呈暗淡。以這種方式，研究了轉基因（TRBC2)對野生型(TRBC1) T細胞的存活。
[0434] 實施例11-調查T細胞淋巴增殖性病癥的克隆性
[0435] 測試了四位患者:三位患有T細胞大顆粒淋巴細胞淋巴增殖性病癥(T-LGL);和一 位患有外周T細胞淋巴瘤(PCTL)以確認惡性細胞一致為TRBC1陽性或陰性。
[0436] 從患有T淋巴細胞增生性病癥的患者收集了全血或骨髓。通過蔗聚糖(Ficoll)梯 度離心分離獲得外周血單核細胞。新鮮獲得的PBMC形成團塊(pelleted)并使用適合的預綴 合抗體染色20分鐘。接著，洗滌細胞并在磷酸鹽緩沖鹽水中重懸用于在BD LSR Fortessa II上立即流式細胞分析。通過FSc/SSc特性和未能攝取死細胞區分染料鑒定活淋巴細胞。通 過使用抗TCRalpha/beta抗體染色鑒定T細胞。基于通過臨床實驗室分析先前鑒定的免疫表 型，對每個樣品使用適合的細胞表面染劑鑒定腫瘤和正常T細胞群體。
[0437] 結果示于圖18至21。
[0438] 在患者A(T-LGL，圖18)中，正常T細胞為⑶7明亮且含有混合的⑶4/CD8細胞，和 TRBC1或TRBC1-細胞的混合群體。相比之下，惡性細胞為⑶7-或⑶7暗淡，一致為⑶8+⑶4-， 且一致為TRBC1-。
[0439] 在患者B(T-LGL，圖19)中，通過CD4-，CD8+，CD7+CD57+鑒定惡性細胞，且為克隆性 的TRBC1-(高亮的小圖）。正常CD4+CD8-和CD4-CD8+T細胞含有TRBC1+和TRBC1-群體。
[0440] 在患者C(T-LGL，圖20)中，正常CD4+和CD8+T-細胞群體為30-40%TRBCl +。通過 ⑶4_，⑶8+，⑶7+⑶57+鑒定惡性細胞并為克隆性的TRBC1 +(高亮的小圖，注意84%的細胞為 TRBC1-，剩下的16 %似乎是污染性"正常" T細胞）。正常CD4+CD8-和CD4-CD8+T細胞含有 TRBC1+和 TRBC1-群體。
[0441] 在患者D(PTCL-N0S，圖21)中，骨髓中的惡性細胞，基于FSC高⑶5暗淡⑶4暗淡鑒 定，一致為TRBC1+，而CD4+CD8-和CD4-CD8+T細胞含有TRBC1+和TRBC1-群體兩者。
[0442] 實施例12-使用噬菌體展示生成區分T細胞受體β鏈恒定域的兩種同種型的單克隆 人抗體
[0443] 為了生成區分TRBC2和TRBC1的抗體，合成了覆蓋兩種TRBC同種型之間差異區域的 肽片段。在TRBC2和TRBC1之間的四個氨基酸差異中，發現兩個在恒定域的起點。合成了代表 這些區域的肽(見以下)并用于抗體生成。
[0444] TRBC2VLEDLKNVFPPEVAV(SEQ ID No.36)
[0445] TRBC1VLEDLNKVFPPEVAV(SEQ ID No.37)
[0446] 以生物素化的，非生物素化的，和半胱氨酸修飾的形式(通過添加 C末端半胱氨酸） 制備了這些肽。接著，根據制備商推薦的條件，將TRBC1和TRBC2的半胱氨酸修飾形式綴合到 經修飾的牛血清白蛋白（Imm-Link BSA, Innova 462-001)或卵白蛋白（Imm-Link Ovalbumin, Innova 461-001)。
[0447] 結果
[0448] 抗體·菌體展示選擇
[0449] 如（Schofield等人，2007Genome Biol 8,R254)所描述的，構建了人·菌體展示文 庫并進行了噬菌體選擇。為了從抗體文庫鑒定TRBC1和TRBC2特異性抗體，進行了多輪噬菌 體展示選擇。平行使用了兩種噬菌體選擇策略，以最大化生成一大組特異性結合物的機會。 這些策略稱為固相和溶液相選擇（圖21)。在固相選擇中，允許噬菌體抗體結合至固定化在 固體表面上的靶抗原(Schofield等人，2007，如上文）。在溶液相選擇中，噬菌體抗體結合溶 液中的生物素化的抗原，然后通過鏈霉親合素或中性親合素包被的順磁珠捕獲噬菌體抗 體-抗原復合物。在固相選擇策略中，采用了兩種不同的固定化或抗原呈現方法。使用第一 種方法，通過直接吸附將綴合有牛血清白蛋白（BSA)或卵白蛋白（0A)的TRBC肽固定化到 Maxisorp?免疫管上。使用第二種方法，將生物素化的TRBC肽間接固定化到用鏈霉親合素或 中性親合素預包被的Maxisorp?免疫管上。
[0450] 為了選擇對于期望的肽特異性的抗體，所有的選擇在過量的相反肽的存在下進 行。例如，所有的TRBC1選擇在10倍摩爾過量的非生物素化的TRBC2的存在下進行。該方法稱 為"去選擇(deselection)"且預期其耗竭識別兩種TRBC肽上共享的表位的抗體，因為這些 優先結合溶液中過量的TRBC2。為了避免富集結合載體蛋白（BSA或0A)或固定化配對物(來 自Thermo fisher scientific的鏈霉親合素或中性親合素），組合采用兩種策略。
[0451] 第一種策略是在選擇的輪數之間切換綴合或固定化的配對物。對于直接固定化的 肽，第一輪選擇在BSA-肽上進行而對于第2輪使用0A-肽綴合物。相似地，對于第1輪將生物 素化的TRBC肽固定化在鏈霉親合素上，而中性親合素用于第二輪的固定化。
[0452] 第二種策略是通過在第1輪中進行"去選擇"以耗竭對綴合/固定化配對物的任意 結合物的噬菌體庫。對于直接固定化的肽，通過在溶液中10倍摩爾過量的游離BSA存在下進 行噬菌體-肽結合步驟進行"去選擇"。在固定化于鏈霉親合素上的生物素化的肽的情況下， 將噬菌體文庫與鏈霉親合素包被的順磁珠預孵育。在向抗原管添加噬菌體之前去除珠，從 而限制鏈霉親合素結合物進入選擇中。使用的不同選擇條件總結于圖21中。對于選擇條件 的詳細信息見表3。
[0453]使用肽或支持蛋白的各自呈現在ELISA中測試了從第2輪選擇輸出制備的多克隆 噬菌體。這包括直接固定化為BSA或0A綴合物的TRBC肽，或間接固定化在鏈霉親合素或中性 親合素上的生物素化的肽。包括的對照蛋白為鏈霉親合素，中性親合素，BSA和不相關的抗 原。使用小鼠抗Ml3抗體（GE healthcare)，接著是用銪標記的抗小鼠 Fc抗體（Perkin Elmers)，使用時間分辨熒光檢測噬菌體結合(圖22)。該結果證明了多克隆噬菌體群體對相 應TRBC肽的優先結合(如與相反TRBC肽比較）。例如，從TRBC 1選擇制備的多克隆噬菌體表現 出對TRBC1比TRBC2明顯更高的結合信號，且反之亦然。對固定化或綴合配對物以及不相關 的抗原存在限制的結合或無結合。
[0454] 單鏈抗體(scFv)亞克隆和單克隆篩選
[0455] 將來自第2輪和第3輪選擇輸出的scFv群體亞克隆到pSANG10-3F表達載體中并轉 化到大腸桿菌BL21(DE3)細胞中。將1128個個體轉化子(564個克隆/TRBC肽)挑取到12x 96 孔培養板中（94個克隆/板)并使用自誘導培養基誘導抗體表達。對過夜誘導后分泌到培養 基上清中的重組單克隆抗體測試對固定化于中性親合素包被的NuncMaxisorp? 96孔板上 的生物素化TRBC1和TRBC2的結合。在從TRBC1選擇篩選的564個克隆中，255個克隆發現對于 TRBC1特異性（對于TRBC1為>10000TRF單位而對于TRBC2為〈1000TRF單位）。從TRBC2選擇篩 選的564個克隆鑒定了 138個TRBC2特異性結合物(對于TRBC2為>10000TRF單位而對于TRBC1 為〈2000TRF單位）。圖24示出了從對TRBC1 (圖24A)或TRBC2(圖24B)選擇產生的來自單個96 孔板的代表性結合概況。使用不同選擇條件生成的特異性結合物的細節總結于表5中。
[0456] 從TRBC1和TRBC2選擇分別挑取了 142個和138個特異性結合物用于序列分析和進 一步表征。通過Sanger測序使用BigDye? terminator ν3 · 1循環測序試劑盒（Life technologies)生成了 cherry挑取(cherry-pi eked)克隆的序列。分析了 DNA序列以確定蛋 白序列并鑒定了VH和VL域的CDR。對VH和VL CDR3區的分析鑒定了74個獨特的TRBC1和42個 獨特的TRBC2克隆（其中獨特定義為VH CDR3和VL CDR3序列的任意組合）JRBC1-特異性克 隆和它們的VH CDR3和VL CDR3序列總結于以上表1中。TRBC2-特異性克隆和它們的VH CDR3 和VL⑶R3序列總結于以上表2中。
[0457] 表3A.固相TRBC選擇的細節
[0458]
[0459] 表3B.溶液相TRBC選擇的細節
[0460]
[0461 ] 表4:選擇輸出數量 [0462]
[0463]
[0464] 表5:單克隆篩選的細節
[0465]
[0466] 實施例13-通過兔的肽免疫的TRBC多克隆抗體產生
[0467] 為了生成區分TRBC2和TRBC1的抗體，合成了覆蓋兩種TRBC同種型之間差異的主要 區域的2種肽并用于兔的免疫。使用了以下肽序列：
[0468] TRBC1:VLEDLNKVFPPEVAVC(SEQ ID No.38)
[0469] TRBC2:VLEDLKNVFPPEVAVC(SEQ ID No.39)
[0470] 合成了 15mg的TRBC1和TRBC2肽。通過肽上存在的C末端半胱氨酸將鑰孔蟲戚血蘭 素 （Keyhole Lympet Hemocyanin)綴合至TRBC1和TRBC2肽。對于每種肽，使用KLH綴合的 TRBC1或TRBC2肽免疫2只New England兔共三次。在第三次免疫后，處死兔并取血，并收集血 清用于純化。將從兔獲得的粗制血清通過偶聯了用于免疫的肽的交聯珠瓊脂樹脂柱，以收 集對于肽的共有片段和TRBC同種型特異性表位特異性的抗體。然后進一步純化初步純化的 上清，通過具有固定化的備選肽的柱，以去除對于肽的共有片段特異性的抗體。
[0471 ] ELISA 設置
[0472] 包被試劑:A:肽TRBC1
[0473] B:肽TRBC2
[0474] 包被濃度:4ug/ml，100μΙ/孔
[0475] 包被緩沖液:磷酸鹽緩沖水，ρΗ7.4
[0476] 二抗:過氧化物酶綴合的抗兔I gG (H&L)(山羊)抗體
[0477] 結果示于圖25和26中。通過該方法制備包含TRBC1或TRBC2特異性抗體的多克隆血 清是可能的。
【主權項】
1. 嵌合抗原受體(CAR)，其包含選擇性結合TCR beta恒定區1 (TRBC1)或TRBC2的抗原結 合域。2. 根據權利要求1的CAR，其選擇性結合TRBC1。3. 根據權利要求2的CAR，其中所述抗原結合域具有可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，其 包含以下互補決定區（⑶R): VH CDR1:SEQ ID No.7; VH CDR2:SEQ ID No.8; VH CDR3:SEQ ID No.9; VL CDR1:SEQ ID No.10; VL CDR2:SEQ ID No.ll;和 VL CDR3:SEQ ID Νο·12〇4. 根據權利要求2的CAR，其中所述抗原結合域包含具有如SEQ ID No. 1所示的序列的 可變重鏈(VH)和具有如SEQ ID No.2所示的序列的可變輕鏈(VL)。5. 根據權利要求2的CAR，其中所述抗原結合域包含具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸 序列的scFv。6. 根據權利要求2的CAR，其包含選自SEQ ID No.4、5和6的氨基酸序列。7. 根據權利要求1的CAR，其選擇性結合TRBC2。8. 編碼根據前述權利要求任一項的CAR的核酸序列。9. 包含根據權利要求8的核酸序列的載體。10. 包含根據權利要求1至7任一項的CAR的細胞。11. 根據權利要求10的T細胞。12. 用于制備根據權利要求10或11的細胞的方法，其包括使用根據權利要求8的核酸序 列或根據權利要求9的載體轉導或轉染細胞的步驟。13. 根據權利要求10或11的細胞，用于在治療受試者中T細胞淋巴瘤或白血病的方法中 的用途，所述方法包括以下步驟： 將包含TCRB1或TCRB2選擇性CAR的細胞施用至所述受試者，以引起惡性T細胞以及與所 述惡性T細胞表達相同TRBC的正常T細胞的選擇性耗竭，但不引起表達所述惡性T細胞不表 達的TRBC的正常T細胞的耗竭。14. 根據權利要求13的用途的細胞，其中所述方法還包括調查來自所述受試者的惡性T 細胞的TCR beta恒定區（TCRB)以確定其是否表達TRBC1或TRBC2的步驟。15. 根據權利要求13或14的用途的細胞，其中所述T細胞淋巴瘤或白血病選自外周T細 胞淋巴瘤，非特指型(PTCL-N0S);血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(AITL)，間變性大細胞淋巴 瘤(ALCL)，腸病相關的T細胞淋巴瘤(EATL)，肝脾T細胞淋巴瘤(HSTL)，結外NK/T細胞淋巴瘤 鼻型，皮膚T細胞淋巴瘤，原發性皮膚ALCL，T細胞幼淋巴細胞白血病和T細胞急性淋巴母細 胞白血病。16. 用于診斷受試者中T細胞淋巴瘤或白血病的方法，其包括確定分離自所述受試者的 樣品中呈TRBC1或TRBC2陽性的總T細胞的百分比的步驟。17. 根據權利要求16的方法，其中TRBC 1或TRBC2陽性T細胞的百分比大于約80 %指示T 細胞淋巴瘤或白血病的存在。18. 根據權利要求16或17的方法，其中所述樣品是外周血樣品或活組織檢查。19. 根據權利要求16至18任一項的方法，其中使用結合CD3的試劑在所述樣品中鑒定或 從所述樣品分離總T細胞。
【文檔編號】C07K16/28GK106068276SQ201580011306
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2015年3月5日 公開號201580011306.X, CN 106068276 A, CN 106068276A, CN 201580011306, CN-A-106068276, CN106068276 A, CN106068276A, CN201580011306, CN201580011306.X, PCT/2015/50643, PCT/GB/15/050643, PCT/GB/15/50643, PCT/GB/2015/050643, PCT/GB/2015/50643, PCT/GB15/050643, PCT/GB15/50643, PCT/GB15050643, PCT/GB1550643, PCT/GB2015/050643, PCT/GB2015/50643, PCT/GB2015050643, PCT/GB201550643
【發明人】M.普勒, P.馬喬西亞
【申請人】Ucl商務股份有限公司