一種c-Met特異性嵌合抗原受體及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種c?Met特異性嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體由人抗c?Met單鏈抗體，CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞內信號結構串聯構成。本發明還公開了上述c?Met特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。該嵌合抗原受體用于修飾T淋巴細胞，修飾后的淋巴細胞可用于c?Met基因表達相關腫瘤的治療。
【專利說明】
一種c-Met特異性嵌合抗原受體及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及細胞免疫技術領域，尤其涉及一種C-Met特異性嵌合抗原受體及其應 用。
【背景技術】
[0002] 肝癌是威脅人類健康的的惡性腫瘤之一，其中大多數為肝細胞癌（hepatocelly Lar carcinoma，HCC)。由于缺乏有效的治療手段，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢。在中 國，由于存在嚴重的乙型肝炎病毒(HBV)感染，肝癌的發病率和死亡率態勢尤為嚴峻。如今 隨著分子生物學技術及基因工程技術的發展，肝癌的開辟了新的領域。細胞治療成為繼手 術治療、放療、化療后的又一新型模式，并展示出良好的前景。其中靶向治療是針對明確的 靶點，設計出相應的藥物，藥物進入體內，與靶點結合而發揮特異性作用，因而具有毒副作 用低，效率高的優點。
[0003] 肝癌一個有前途的候選革巴點是c-met(mesenchymal epithelial transition factorhc-met為肝細胞生長因子受體，具有絡氨酸激酶活性，通常表達于多種組織的上皮 細胞。c-met在細胞的代謝、分化以及死亡細胞的信號傳導過程中起著重要的作用，當c-met 和其高親和力的配體肝細胞生長因子結合，可活化其信號通路，參與胚胎發育、組織損傷修 復以及腫瘤的發生和發展。因而，以酪氨酸激酶受體c-met為靶點的抗腫瘤藥物已經成為腫 瘤研究中非常火熱的領域，為人類對抗腫瘤提供了新的路徑。
[0004] 嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR)主要由三部分構成：胞外抗原 結合區、跨膜區和胞內信號轉導區。其中胞外抗原結合區通常是由針對腫瘤相關抗原 (tumor associated antigen，TAA)的單克隆抗體的單鏈可變區序列（single chain fragment variable，scFv)構成（輕和重鏈可變區通過鉸鏈區連接形成）。這部分功能是識 另IJ腫瘤相關抗原，把CAR-T細胞結合到腫瘤上去。跨膜區通常由CD3、CD28、⑶8等二聚體蛋白 構成。胞內信號轉導區主要為免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常為0)3ζ或FceRI γ )。其主要功能是把信號轉導給T細胞，提 高抗腫瘤及細胞因子分泌能力。CAR通過不斷地改進，目前已經發展到了第四代。第一代CAR 主要由識別腫瘤相關抗原的scFv和ITAM(通常為CD3G)構成，但是由于僅有CD3G活化信號，T 細胞不能充分增值，且活化的T細胞在體內存活時間短。第二代CAR在一代CAR的基礎上加入 一個共刺激分子，如CD28、CD 134、CD137等等，增強了T細胞激活、增殖，體內維持時間，從而 提高抗腫瘤的效應。第三代CAR在二代CAR的基礎上再引入一個以上的共刺激分子。第四代 CAR(TRUCKS，T cells redirected for universal cytokine killing)主要通過引入IL-12，IL-23，IL-27等細胞因子，召集固有免疫細胞-巨嗜細胞等殺傷TAA陰性的腫瘤細胞。
[0005] CAR-T治療是利用嵌合抗原受體可以特異性地識別腫瘤相關抗原（TAA，tumor associated antigen)祀點，結合后將信號傳到胞內，引起T細胞的激活和增增，清除腫瘤細 胞。修飾后的T細胞不受腫瘤微環境的抑制，以非MHC (major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體)限制方式抵御腫瘤細胞。

【發明內容】

[0006] 基于【背景技術】存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種c-Met特異性嵌合抗 原受體。
[0007] 本發明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。
[0008] 本發明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的應用。
[0009] 為了實現上述目的，本發明提出的一種c-Met特異性嵌合抗原受體，由人抗C-Met 單鏈抗體，⑶8TM，⑶137，及⑶3ζ的胞內信號結構串聯構成。
[0010]優選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 優選地，所述嵌合抗原受體的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012] 優選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013] 優選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014] 優選地，所述人抗c-Met單鏈抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述輕鏈可變區 的核酸序列如SEQ ID N0.10所示。
[0015] 優選地，所述重鏈可變區的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016] 優選地，所述嵌合抗原受體的氨基末端含有一個信號肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0017] 優選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的重鏈分子和輕鏈分子之間有一個連接肽，其氨 基酸序列為 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。
[0018] 優選地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019] 優選地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0020] 優選地，CD8TM，CD 137，及⑶3ζ的胞內信號結構串聯構成的結構域為T細胞共刺激 信號傳導結構，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0.9所示。
[0021]本發明還提出的上述C-Met特異性嵌合抗原受體在制備治療C-Met相關腫瘤藥物 中的應用。
[0022] c-Met相關的腫瘤包括肝癌、腸癌、神經膠質瘤等。
[0023]本發明根據實驗室從全人源抗體庫篩選出C-Met抗體Fab(可參見中國發明專利 《抗Met人源Fab及其阿霉素偶聯物和其制法及應用》，申請號為201110065209.2，【公開日】為 2011年9月7日，公開號為102174106A)，經過密碼子優化，基因合成抗c-Met的ScFv序列，并 將合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3G中，即構建成c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G嵌 合抗原受體，即獲得本發明的嵌合抗原受體c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G。
[0024]利用嵌合抗原受體與逆轉錄病毒包裝質粒RD114在GP2-293T細胞包裝成逆轉錄病 毒，利用該病毒感染T淋巴細胞。利用El isa檢測CAR-T細胞在抗原刺激下IFN- γ的分泌及 CCK8法對c-Met陽性的肝癌細胞的殺傷作用。
[0025]本發明公布了c-Met特異性的嵌合抗原受體的結構，體外感染T淋巴細胞。修飾后 的T淋巴細胞釋放IFN-γ等殺傷腫瘤細胞。c-Met特異性的嵌合抗原受體可以用于c-Met相 關腫瘤的靶向治療。
【附圖說明】
[0026]圖1為本發明實施例1所得c-Met-scFv的重鏈可變區和輕鏈可變區的電泳圖；其中 Μ為標準標記物，1為c-Met-scFv的重鏈可變區，2為c-Met-scFv的輕鏈可變區。
[0027]圖2為本發明實施例1所得質粒重組的電泳圖；其中Μ為標準標記物，1為c-Met CAR 載體，2為經乂&&11，831111逆轉錄病毒載體〇)8了]\1-〇)137-〇)3(，3為(3-]^丨80卩￥。
[0028]圖3為本發明實施例2中采用Western Blotting檢測本發明所得c-Met特異性嵌合 抗原受體轉染293T細胞后的表達，其中1為作為對照的未轉染293T細胞，2為轉染逆轉錄病 毒CD19CAR質粒的293T細胞，3為轉染逆轉錄病毒c-Met CAR質粒的293T細胞。
[0029] 圖4為Western Blot檢測不同的對數生長期腫瘤細胞中c-Met的表達。
[0030]圖5為本發明所得c-Met特異性嵌合抗原受體修飾的T細胞對腫瘤細胞的殺傷檢 測。
[0031]圖6為本發明所得c-Met特異性嵌合抗原受體修飾的T細胞在受到c-Met抗原刺激 后IFN-γ的表達。
【具體實施方式】
[0032] 下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0033] 實施例1: c-Met特異性嵌合抗原受體慢病毒載體的構建
[0034] 1.本實驗室利用基因工程抗體技術，從全人源抗體庫篩選出多株具有生物學活性 的c-met抗體Fab，并證實具有較高的親和力和明顯的中和作用，可作為CAR-T細胞治療的候 選革巴分子和候選ScFv。
[0035]利用本實驗室篩選的抗c-Met的Fab序列，選出其中VH和VL的序列，用于設計CAR載 體中的scFv序列，采用金斯瑞生物技術公司OptimumGeneTM基因設計軟件對密碼子進行進 一步優化，在優化的序列兩端分別加上NcoI，SphI酶切位點，優化后的序列由南京金斯瑞生 物技術公司完成基因合成，合成后的序列克隆在PUC57載體，質粒命名為c-Met-scFv-pUC57〇
[0036] 2.c-Met-scFv-pUC57質粒用限制性內切酶Xball和Ban^酶切，酶切體系如下。2yg c-Met-scFv-pUC57、lyLXbal、lyLBamHI、2yL 10 X 酶切緩沖液，用水補到20yL，37°C水浴中 過夜，酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下切取目的條帶，采用DNA凝膠回收試劑盒 (AXYGEN公司）回收目的片段;其結果如圖1所示，pUC57-c-Met-ScFv載體經Xbal和BamHI酶 切釋放目的條帶。
[0037]用同樣的方法Xbal和BamM酶切pSFG-CD8TM-CD137-CD3G載體，用瓊脂糖凝膠電 泳，回收目的片段。其結果如圖2所示，pSFG-⑶8TM-⑶137-⑶3ζ載體經Xbal和BamHI酶切釋 放目的條帶。
[0038] 將回收后的c-Met-ScFv與酶切載體通過T4DNA連接酶連接，反應體系如下：2yL c- Met-ScFv、2yL載體酶切產物、lyL 10 X連接緩沖液、lyL連接酶，用水補到10yL，16 °C水浴中 過夜。取連接產物加入到DH5a感受態中[參考《分子克隆》第三版中大腸桿菌感受態制備 (CaCl2法）]，放置37°C細菌培養箱中過夜培養。挑取單個菌落，擴大培養，提取陽性克隆的 質粒，經酶切和測序，將正確的載體命名為c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G。
[0039] 實施例2: c-Met特異性嵌合抗原受體表達鑒定
[0040] 參照無內毒素質粒大提試劑盒內（天根生物）的操作說明書提取逆轉錄病毒載體 c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G，提取的質粒，用PI轉染試劑轉染到人胚腎細胞293T中，48h 后，用PBS洗一遍，用細胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細胞，提取轉染后的293T細胞的蛋白經 10 %的SDS-PAGE進行分離后，恒流(300mA，lh)轉印至PVDF膜上，用抗0)3ζ (1:1000)抗體孵 育，4°C孵育過夜。用TOST洗滌3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗（1:5000)室溫孵育lh。加入ECL 顯色后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS System進行成像，其結果如圖3所示。
[0041]由圖3可知：本發明所構建的重組質粒能夠檢測到目的條帶的表達，大小與陽參 ⑶19 一致，而未轉染的293T細胞沒有條帶。
[0042]實施例3: c-Met特異性嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞的制備 [0043] 1.含抗c-Met嵌合抗原受體逆轉錄病毒的包裝
[0044]用無內毒素質粒大提試劑盒內（天根生物）的操作說明書提取逆轉錄病毒包裝載 體RD114和c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3G逆轉錄病毒載體共轉染到GP2-293T細胞中，轉染 后48h收集細胞上清，4000rpm離心10min，去除上清中的細胞及細胞碎片。用0.45μπι的濾膜 過濾，分裝凍存，備用。
[0045] 2. Τ淋巴細胞的制備
[0046]采取20mL健康志愿者的新鮮抗凝血，用淋巴分離液(GE公司）分立外周血單核細胞 (PBMC)。分離后的細胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴細胞培養基GT-T551(TAKARA公 司）加3%自身血漿進行誘導，得到T淋巴細胞。
[0047] 3.CAR-T細胞的制備
[0048] 用50yg/mL的RetroNectin(TAKARA公司）包被非組織培養板24孔板，每孔加入500μ L，4°C過夜。每孔再加入500yL病毒上清，37°C孵育30min。去除病毒上清，再加入500yL病毒 上清，37°C孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀釋后的T淋巴 細胞。從而獲得c-Met-scFv-CD8TM-CD137-CD3GT細胞即c-Met特異性CAR-Τ細胞。
[0049]實施例4: c-Met特異性CAR-Τ細胞對c-Met相關腫瘤的殺傷作用 [0050] 1 .Western Blotting檢測腫瘤細胞中c-Met的表達
[00511 選取對數生長期的人黑色素瘤細胞A375、肝癌細胞Hep-G2、人乳腺癌細胞MDA-MB- 231，用細胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細胞，提取細胞蛋白，進行Western Blotting檢測，其 結果如圖4所示:人黑色素瘤細胞A375，肝癌細胞Hep-G2檢測到c-Met的表達，MDA-MB-231而 檢測不到c_Me t的表達。
[0052] 2.CAR-T細胞對腫瘤的殺傷力檢測
[0053] 將腫瘤細胞用培養基調整到5X106/mL，每孔50yL，按E:T(效應細胞和靶細胞比） 為16:1、8:1、4:1、2:1，分別加入腫瘤細胞2.5\10 6個、1.25\106個、6.25\105個、3.125\ 1〇5個;待細胞完全貼壁后，收集T細胞和CAR-Τ細胞，調整細胞濃度為1 X 106/mL，每孔50yL， 培養12h。棄上清加入100yL稀釋的CCK8,孵育4~6小時，酶標儀檢測0D450的吸光值。
[0054] 上述腫瘤細胞為人黑色素瘤細胞A375、肝癌細胞Hep-G2、人乳腺癌細胞MDA-MB- 231〇
[0055] 檢測結果如圖5所示:CAR-Τ細胞對c-Met表達的黑色素瘤細胞、肝癌細胞的殺傷率 高于c-Met不表達的乳腺癌細胞MDA-MB-231; c-Met特異性CAR-Τ細胞對表達c-Met的腫瘤細 胞殺傷作用高于T細胞，高于⑶19CAR-T細胞。
[0056] 3.ELISP0T檢測CAR-Τ細胞在受到c-Met抗原刺激后IFN- γ的表達
[0057] 用無菌包被液稀釋IFN- γ 抗體后加入ELISP0T(Mi 11 ipore，Cat · No · MAIPS4510)平 板中，每孔100yL，4°C放置過夜。第二天用無菌的包被液將平板洗滌2遍。每孔加入200yL完 全培養基，室溫封閉lh。洗去含血清的細胞培養液RPMI-1640,用roS洗三遍。準備c-Met胞外 區多肽，稀釋在含血清的細胞培養液RPMI-1640,調至終濃度lyg/mL。每孔100yL。調整待檢 測CAR-T細胞濃度為1 X 106/mL，每孔加入100yL，37°C，5 %C02放置24h，棄去細胞及培養基， 用ELI SPOT洗滌液洗滌3遍。每孔加入生物素標記的檢測抗體，100μL7孔，4 °C放置過夜。再用 ELISP0T洗滌液洗滌4遍。每孔加入HRP標記的親和素，100μL7孔，室溫放置45min。用ELISP0T 洗滌液洗滌3遍后，用roS洗滌2遍。每孔加入100yL ACE顯色底物，室溫顯色20-60min。待出 現明顯集落點后，用無菌水洗滌3遍終止反應。空氣中晾干平板，用ELISP0T讀板機計算形成 的斑點數，其結果如圖6所示。由圖6可知:CAR-T細胞在特異性c-Met抗原刺激下能夠分泌 IFN- γ 〇
[0058] 以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種C-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體由人抗C-Met單鏈 抗體，⑶8TM，⑶137，及⑶3ζ的胞內信號結構串聯構成。2. 根據權利要求1所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 根據權利要求1或2所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體 的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。4. 根據權利要求1-3任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗c-Met單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示;優選地，所述人抗c-Met單鏈抗體的核酸序 列如SEQ ID NO.5所示。5. 根據權利要求1-4任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗c-Met單鏈抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述輕鏈可變區的核酸序列如SEQ ID NO. 10 所示;優選地，所述重鏈可變區的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。6. 根據權利要求1-5任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗 原受體的氨基末端含有一個信號肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。7. 根據權利要求1-6任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗c-Met單鏈抗體的重鏈分子和輕鏈分子之間有一個連接肽，其氨基酸序列為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser_Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 〇8. 根據權利要求1-7任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，CD137的氨基 酸序列如SEQIDN0.7所示 ;優選地，CD137的核酸序列如SEQIDN0.8所示。9. 根據權利要求1-8任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體，其特征在于，CD8TM， CD137,及CD3G的胞內信號結構串聯構成的結構域為T細胞共刺激信號傳導結構，其氨基酸 序列如SEQ ID NO.9所示。10. 如權利要求1-9任一項所述c-Met特異性嵌合抗原受體在制備治療c-Met相關腫瘤 藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/62GK106008721SQ201610483181
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月9日
【發明人】馮振卿, 朱進, 許國貞, 劉振云, 唐奇, 唐小軍, 周熒
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司