一種檢測δRec-ψ(J)α型T細胞受體重排刪除環含量的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體設及適用于檢測祁ec-iKj)a型Τ細胞受體重排 刪除環含量的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] T細胞受體重排刪除環(TREC)是一種在T細胞抗原受體(TCR)基因重排時產生的穩 定的環狀DNA片段，而70%W上的TREC為祁ec-iKj)a型TRECdTREC是游離基因，穩定的存在 于細胞中，并不隨T細胞的進一步增殖而擴增。隨著T細胞分裂，TREC水平在細胞群體中逐漸 被稀釋，但它的數量代表胸腺輸出初始T細胞的數量，反應胸腺的功能。而T淋己細胞的減 少，導致免疫功能低下或缺失，產生一系列免疫低下性疾病如:重癥聯合免疫缺陷（SCID)、 X-連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)、普通變異型免疫缺陷病(CVIDKX-連鎖高免疫球蛋白Μ血 癥(X-HIGM)等。其中，SCID為早期致死性免疫缺陷綜合癥，患兒出生后無癥狀期很短。
[0003] SICD是一種體液免疫、細胞免疫同時有嚴重缺陷的疾病，多為基因突變所致。最新 研究成果顯示，新生兒SCID總體發病率是1/58000。所有SCID患兒都有Τ細胞生成缺陷。因 此，患有SCID的嬰兒更易得威脅生命的重癥感染。而80% W上的患兒缺乏陽性家族史，基于 人口的篩查是在獲得感染前盡早檢測出SCID的唯一方式。診斷后接受免疫重構的SCID患兒 存活率為87%，接受移植、酶替代治療和/或基因治療的患兒存活率為92%。因此通過TREC 對新生兒SCID篩查對提高SCID患兒的生存率及生活質量具有重大意義。
[0004] 目前，TREC的定量檢測方法有:實時定量PCR、競爭性RCR及PCR-ELISA。其中實時定 量PCR靈敏度及準確性最高。然而，TREC在外周血中豐度低，故目前大多數基礎研究采用從 靜脈血中抽提DNA，用參考基因校正的方法進行檢測。但新生兒外周血標本難獲得，研發靈 敏度及準確性更高的可用于檢測干血斑中TREC的試劑盒對新生兒SCID篩查具有重大意義。

【發明內容】

[0005] 本發明目的之一在于提供一種檢測祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環含量的方 法，其能夠簡捷、直觀、準確的對SRec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環的含量進行檢測。
[0006] 為實現上述目的，本發明的技術方案為：
[0007] -種檢測祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環含量的方法，具體包括W下步驟： [000引1)特異性引物和特異性探針的設計
[0009] 根據被證實的祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環序列，設計特異性擴增引物和 特異性探針;其中，所述探針兩端帶有巧光基團；
[0010] 2)標準品構建
[0011] 合成祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環連接點核屯、序列雙鏈DNA，并通過TA克隆 連接到PMD19-T載體上進行克隆，測序驗證序列，并測定質粒溶液濃度，所得到的ΡΜ019-Τ-δ Rec-iKj)a型Τ細胞受體重排刪除環質粒作為祁ec-iKj)a型Τ細胞受體重排刪除環核酸標準 品；將不同摩爾數的PMD19-T-祁ec-iKj)a型Τ細胞受體重排刪除環質粒加入高壓滅菌處理 的Tris-邸ΤΑ緩沖液中保存，得到標準品；
[0012] 3)PCR 擴增
[0013] 將標準品按照梯度稀釋后與待測標本同期進行PCR擴增反應，分析結果W獲得待 測標本的祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環的含量。
[0014] 將標準品按照梯度稀釋后與待測標本同期進行PCR擴增反應是指，將標準品按照 梯度稀釋后與待測標本一起進行PCR擴增反應。
[0015] 進一步，上游擴增引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示，下游擴增引物的核巧酸 序列如沈Q ID NO:2所示。
[0016] 進一步，所述特異性探針的核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0017] 進一步，所述核屯、序列如沈Q ID N0:4所示。
[001引詳見下表：
[0019]
[0020] 上表中F表示上游引物，R表示下游引物。
[0021] 進一步，所述待測標本為新生兒濾紙干血斑。
[0022] 進一步，所述PCR擴增反應的條件為:先于50°C溫度下處理2分鐘，再在95°C溫度下 預變性5分鐘；W95°C變性30秒、58°C退火60秒為一個循環，共循環40次。
[0023] 本發明的目的之二在于提供一種試劑盒，能夠實現快速、簡便、準確、高效、實用、 經濟的檢測SRec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環的含量，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需 要，利用祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環的檢測對新生兒SCID篩查對提高SCID患兒的 生存率及生活質量具有重大意義。
[0024] 為實現W上目的，本發明的技術方案如下：
[0025] 用于檢測祁ec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環含量的試劑盒，所述試劑盒包括δ Rec-iKj)a型Τ細胞受體重排刪除環的特異性擴增引物、特異性探針、SRec-iKj)a型Τ細胞受 體重排刪除環核酸標準品、PCR反應液。
[00%] 進一步，所述特征性擴增引物如SEQ ID NO: 1-2所示。
[0027] 進一步，所述特異性探針的核巧酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0028] 本發明的有益效果在于：
[0029] 本發明所述方法及應用本發明的試劑盒能夠實現快速、簡便、準確、高效、實用、經 濟的檢測SRec-iKj)a型T細胞受體重排刪除環的含量，能夠滿足臨床檢驗實際工作的需要， 利于SRec-iKj)a型Τ細胞受體重排刪除環含量檢測預測疾病的發生、發展風險。
【附圖說明】
[0030] 圖1為標準品倍比稀釋后進行擴增反應的擴增曲線；
[0031] 圖2為微調闊值，使標準曲線斜率(約3.3)、相關性(約0.99)及PCR擴增效率達最佳 時的標準曲線；
[0032] 圖3為待測標本的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0033] 所舉實施例是為了更好地對本發明的內容進行說明，但并不是本發明的內容僅限 于所舉實施例。所W熟悉本領域的技術人員根據上述
【發明內容】
對實施方案進行非本質的改 進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。
[0034] 實施例1 PCR擴增引物和特異性探針的設計及合成
[0035] 利用primer 5.0軟件，根據引物設計一般原則篩選較好引物Ξ對，PCR擴增、電泳 后根據目的條帶確定最優引物。最優引物上游擴增引物3'端后第二位堿基開始根據堿基互 補原則設計30個堿基的探針序列。引物和探針委托成都擎科梓熙生物技術有限公司合成， 最優的PCR擴增引物與探針詳見表1。
[0036] 表1 TREC擴增引物與探針
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