牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白亞單位疫苗制備方法
【專利摘要】本發明涉及牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法。其優點如下：(1)建立了高效獲取BVDV E2蛋白的表達方法；(2)用BVDV的E2蛋白表達上清免疫兔子，證明有良好的免疫反應，可用于制備BVDV亞單位疫苗。CGMCC No.01
【專利說明】
牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法
技術領域
[0001] 本發明所設及的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV化2蛋白表達及其亞單位疫苗制備方法， 屬獸用生物制品領域。
【背景技術】
[0002] 牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)可引起的牛的腹瀉及 繁殖失敗。懷孕母牛感染BVDV后，可引起死產、流產W及胚胎崎形，或是分娩出持續感染轄 牛。運種持續感染的轄牛雖不表現任何臨床癥狀，但可終身帶毒，持續排毒，成為重要傳染 源，在我國廣泛存在，給我國養牛業造成重大的經濟損失。
[0003] BVDV屬于黃病毒科攝病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全長約12.5肺，僅含有一 個能編碼約4000個氨基酸多聚蛋白大的0RF，多聚蛋白經翻譯和加工后，可形成11種成熟的 蛋白，其中C、化ns、El、E2是病毒的結構蛋白。E2是BVDV的囊膜蛋白，免疫原性最強，能同時 誘導機體產生體液免疫和細胞免疫，并產生中和抗體，是制備檢測抗原和疫苗的首選基因， 對BVDV E2表達和免疫原性的研究已經進行了很多。Marzocca MP等將E2基因在黑腹果蛹里 進行表達，重組的E2蛋白表現出良好的抗原性（Truncated E2of bovine viral diarrhea virus(BVDV)expressed in Drosophila melanogaster cells:a candidate antigen for a BVDV ELISA. J Virol Methods，2007,144(1-2) :49-56) ;Ferrer F等用Rachiplusia nuperos桿狀病毒蛋白表達體系獲得E2重組蛋白，經實驗證明，該蛋白可誘導中和抗體的產 生，可用于審Ij備疫苗抗原（Induction of virus neutralizing antibodies by immunization with Rachiplusia nuperos infected with a recombinant baculovirus expressing the E2glycoprotein of bovine viral diarrhea virus.J Virol Methods， 2007，146( 1-2): 424-427)。國內已采用了多種方式對其進行表達(如:徐興然等，牛病毒性 腹瀉病病毒化angchunl84株E2基因的克隆及在大腸桿中的高效表達），但原核表達產物為 包涵體，無正確結構，活性差。因此，需進一步研究E2蛋白的表達方法，W獲取可溶的高活性 蛋白。
[0004] 研究發現，不同物種對氨基酸密碼子的使用頻率有很大差異，因此，本發明中將 BVDV E2基因密碼子優化為昆蟲桿狀病毒偏好密碼子，W提高BVDV E2的表達量。
[0005] 本發明的目的是建立BVDV E2蛋白及其亞單位疫苗制備方法。

【發明內容】

[0006] 本發明的技術方案
[0007] 1.牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于該疫苗是由構建的 已被命名為首猜銀蚊夜蛾核型多角體病毒(簡稱桿狀病毒)BacVDMoptiE2株作為生產毒株 制備而成，該毒株已于2016年06月Ol日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微 生物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中屯、，保藏號分別為:CGMCC No. 12545。 [000引2.權利要求1所述牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于其 構建的桿狀病毒BacVDMoptiE2株中攜帶MoptiE2-l(序列I)和MoptiE2-2(序列2)。
[0009] 3.如權利要求1所述牛病毒性腹瀉病毒(BVDV化2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特 征在于用其構建的桿狀病毒BacVDMoptiE2株進行表達獲得可溶性E2蛋白，經滅活，加入適 宜佐劑乳化后制備成亞單位疫苗。
[0010] 本發明的主要技術原理
[0011]參考BVDV E2基因序列，采用全基因合成的手段，合成優化的BVDV E2基因序列 (optiE2);再通過重疊延伸PCR技術分別將優化的BVDV E2基因序列(optiE2)與分泌信號膚 Mels基因融合，獲得轉移載體；
[0012] 將轉移載體通過轉座技術克隆至桿狀病毒基因組中，構建重組桿狀病毒，獲得 BVDV E2蛋白；
[0013] 將獲得的BVDV E2蛋白加上適宜佐劑，乳化后免疫動物，分析其做為亞單位疫苗的 可行性；
[0014] 本發明【具體實施方式】
[0015] 1.BVDV E2基因序列的獲得
[0016] 采用全基因合成的手段，合成優化的BVDV E2基因序列(optiE2)，克隆至pMD 18載 體，命名為:質粒p〇ptiE2。
[0017] 2.E2基因與信號膚序列融合
[0018] 提取popt iE2，設計引物并加上合適酶切位點，通過重疊延伸PCR技術（重疊延伸 PCR技術及其在基因工程上的應用[J].分子植物育種，2006，05 : 747-750)獲得與信號膚 16 13基因融合，克隆至口10 18載體。構建的融合基因質粒分別命名為口1〇口*162-1、 pMoptiE2-2〇
[0019] 融合基因質粒pMoptiE2-l中攜帶的序列，即:MoptiE2-l(序列1):
[0020] 上游添加 BamHI酶切位點，下游添加終止密碼子及化ndn I位點
[0021]
[0022] 融合基因質粒pMoptiE2-2中攜帶的序列，即:MoptiE2-2(序列2):
[0023] 上游添加 SmaI酶切位點，下游添加終止密碼子及KpnI位點
[0024]
[0025] 3.亞克隆至桿狀病毒轉移載體
[0026] 將pMoptiE2-l和載體pFastBacDual分別進行雙酶切，純化回收，酶切片斷 MoptiE2-l與pFastBacDual線性質粒連接，轉化，鑒定，獲得的新質粒命名為pFB-MoptiE2; 再將pMoptiE2-2和載體pFB-MoptiE2分別進行雙酶切，純化回收，酶切片斷MoptiE2-2與 pFB-MoptiE2線性質粒連接，轉化，鑒定，獲得的新質粒命名為pFB-DMoptiE2(D表示雙表 達)。
[0027] 4.轉座獲得重組桿粒DNA
[0028] 分別將pFB-MoptiE2、pFB-DMoptiE2轉化DHlOBac構建出的桿粒DNA分別命名為： bMoptiE2、bDMoptiE2。
[0029] 5.重組病毒的獲得
[0030] 分別將重組桿粒61〇91:162、601〇91:162用轉染試劑〔61"6(31:;[]1轉染3'9細胞，擴大 培養，收集培養上清進行PCR鑒定。分別獲得重組桿狀病毒命名為桿狀病毒BacVMoptiE2株 和桿狀病毒BacVDMoptiE2,該兩毒株建議的分類命名均為首猜銀蚊夜蛾核型多角體病毒， 其中桿狀病毒BacVDMoptiE2已于2016年06月Ol日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中 國科學院微生物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中屯、，保藏號分別為:CGMCC No.12545。
[0031] 6.表達分析
[0032] 將鑒定好的病毒傳代擴大培養，第二代記為P2Stock，第S代記為P3Stock。前S代 均做為種毒，取第3代培養上清接種48孔板中的sf9細胞，同時設不接毒對照。60小時后棄上 請，用預冷的固定液(丙酬：甲醇=I: I)固定。棄固定液，力郵VDV McAb (來自AHVLA)，37 °C解 育50min，用PBS洗3遍，加門TC標記的羊抗鼠抗體，37 °C解育50min，用PBS洗3遍，巧光顯微鏡 下觀察。結果表明，接毒sf9細胞孔出現明顯的亮綠色巧光（圖1中圖A，圖B)，而未接毒sf9細 胞孔未顯巧光(圖1中的圖E)。說明重組桿狀病毒能表達BVDV E2蛋白。
[0033] 7.乳化配苗
[0034] WBacVDMoptiE2表達蛋白配苗為例。
[0035] 將鑒定正確的種毒用sf9細胞擴增至P6代，測定病毒滴度。用E邱ressFive培養基 (Invitrogen公司）懸浮培養Hi曲Five昆蟲細胞（Invitrogen公司）（27°C，ISOr/min震蕩培 養），待化曲Five昆蟲細胞長至對數生長期時，更換新的E邱ressFive培養基，調整細胞濃 度為2~5 X l〇-6/ml，將重組桿狀病毒BacVDMoptiE2 WIMOI劑量感染細胞，96小時后收獲。 200化/min離屯、IOmin，取上清，進行SDS-PAGE電泳，計算目標產物含量。將肥I加入抗原中， 終濃度為1mmol/L，置37 °C滅活4她，即可將重組病毒滅活。
[0036] 8. BVDV亞單位疫苗的制備及動物免疫
[0037] WBacVDMoptiE2為例，將BacVDMoptiE2表達上清濃縮10倍后按l:l(v/v)比例加入 ISA206佐劑，乳化后免疫大耳白兔，皮下多點注射，每只Iml，28天后加免一次。加免14天后 采血，分離血清，56°C滅活30min。用分離的血清做中和試驗。方法:稀釋BVDV 0regonC24至 300TCID5〇/ml，將血清用MEM按2X、4X、8X、16X、32X、64X、128X、256X稀釋，37°C作用 60min，然后接種于準備好的48孔MD服細胞板中，37°C吸附90min。然后吸干，每孔加入含2% FBS的MEM培養液0.5ml，37 °CC〇2培養箱培養72h。吸干，用PBS漂洗3遍，吸干，用BVDV巧光抗 體液染色。有典型綠色巧光信號的孔表示未中和。
[0038] 結果表明，血清中和效價可達1:128,說明BVDV亞單位疫苗免疫兔子后能誘導產生 中和抗體，可W做為候選疫苗使用。
[0039] 本發明設及的微生物資源信息
[0040] 本發明構建獲得的重組桿狀病毒BacVDMopt iE2株，父本為來自DHlOBac菌 (Invi化Ogen公司）中的桿狀病毒基因組，通過將外源基因 BVDV E2基因與分泌信號膚Mels 的融合基因全序列克隆入炸astBacDual質粒2個讀碼框后，與DHlOBac菌中的桿狀病毒基因 組重組后獲得的新桿狀病毒BacVDMoptiE2株，該毒株建議的分類命名均為首猜銀蚊夜蛾核 型多角體病毒，并于2016年06月Ol日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生 物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中屯、，保藏號分別為:CGMCC No. 12545。
【附圖說明】
[0041 ] 圖1其中圖A-D顯示接毒sf9細胞孔出現明顯的亮綠色巧光，圖A.為BacVME2，圖B. 為BacVDME2，圖C.為BacVMoptiE2，圖D.為BacVDMoptiE2;E.為未接毒Sf9細胞的對照未顯巧 光
[0042] 圖2本發明的技術路線
[0043] 本發明的優點
[0044] 本發明設及牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法。其優點如下：1.建立 了高效獲取BVDV E2蛋白的表達方法;2.用BVDV的E2蛋白表達上清免疫兔子，證明有良好的 免疫反應，可用于制備BVDV亞單位疫苗。 實施例
[0045] 實施例1
[0046] --重組桿狀病毒的構建
[0047] 按照本發明同樣的原理，已同時構建出含天然BVDV E2基因的重組桿狀病毒。
[004引 1.BVDV E2基因序列的獲得
[0049] BVDV BA株(CVCC AV69)感染材料中提取病毒RNA，通過常規RT-PCR技術，獲得BVDV E2基因，克隆至pMD 18載體，命名為:質粒祀2。
[0050] 2.E2基因與信號膚序列融合
[0051] 提取pE2,設計引物并加上合適酶切位點，通過重疊延伸PCR技術獲得與信號膚 Mels基因融合，克隆至pMD 18載體。構建的融合基因質粒分別命名為pME2-l、pME2-2。
[0052] 融合基因質粒PME2-1中攜帶的序列，即:ME2-U序列3):
[0053] 上游添加 BamHI酶切位點，下游添加終止密碼子及化ndn I位點 [00541
[0055] 融合基因質粒PME2-2中攜帶的序列，即:ME2-2(序列4):
[0056] 上游添加 SmaI酶切位點，下游添加終止密碼子及KpnI位點
[0化7]
[005引3.亞克隆至桿狀病毒轉移載體
[00別將PME2-1和載體pFastBacDual分別進行雙酶切，純化回收，酶切片斷ME2-1與 pFas巧acDual線性質粒連接，轉化，鑒定，獲得的新質粒命名為PFB-ME2;再將PME2-2和載體 PFB-ME2分別進行雙酶切，純化回收，酶切片斷ME2-2與PFB-ME2線性質粒連接，轉化，鑒定， 獲得的新質粒命名為pFB-DME2(D表示雙表達）；
[0060] 4.轉座獲得重組桿粒DNA
[0061 ] 分別將pFB-ME2、pFB-DME2轉化DHlOBac構建出的桿粒DNA分別命名為：bME2、 bDME2〇
[0062] 5.重組病毒的獲得
[0063] 分別將重組桿粒bME2、bDME2用轉染試劑Cellfectin轉染sf9細胞，擴大培養，收集 培養上清進行PCR鑒定。分別獲得重組桿狀病毒命名為桿狀病毒BacVME2株和BacVDME2株， 該兩毒株建議的分類命名均為首猜銀蚊夜蛾核型多角體病毒。
[0064] 實施例2
[00化]--重組病毒表達分析
[0066]將鑒定好的病毒傳代擴大培養，第二代記為P2Stock，第S代記為P3Stock。前S代 均做為種毒，取第3代培養上清接種48孔板中的sf9細胞，同時設不接毒對照。60小時后棄上 請，用預冷的固定液(丙酬：甲醇=1:1)固定。棄固定液，力郵VDV McAb(來自AHVLA)，37°C解 育50min，用PBS洗3遍，加門TC標記的羊抗鼠抗體，37 °C解育50min，用PBS洗3遍，巧光顯微鏡 下觀察。結果表明，接毒sf9細胞孔出現明顯的亮綠色巧光（圖1中圖C和圖D)，而未接毒sf9 細胞孔未顯巧光（圖I中的圖E)。說明重組桿狀病毒能表達BVDV E2蛋白。
[0067]結果表明，血清中和效價可達1:128,說明BVDV亞單位疫苗免疫兔子后能誘導產生 中和抗體，可W做為候選疫苗使用。
【主權項】
1. 牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于該疫苗是由構建的已被 命名為苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒（簡稱桿狀病毒)BacVDMoptiE2株作為生產毒株制備 而成，該毒株已于2016年06月Ol日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物 研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心，保藏號分別為:CGMCC No. 12545。2. 權利要求1所述牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于其構建 的桿狀病毒BacVDMoptiE2株中攜帶MoptiE2-l(序列1)和MoptiE2-2(序列2)。3. 如權利要求1所述牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白亞單位疫苗制備方法，其特征在于用其 構建的桿狀病毒BacVDMoptiE2株進行表達獲得可溶性E2蛋白，經滅活，加入適宜佐劑乳化 后制備成亞單位疫苗。
【文檔編號】C12N15/40GK105924506SQ201610517156
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】范學政, 趙啟祖, 姚文生, 丁家波, 寧宜寶, 徐璐, 王芳, 王琴, 鄒興啟, 朱元源, 朱良全, 蔣卉
【申請人】中國獸醫藥品監察所