本發明(ming)屬于獸(shou)用生物制(zhi)品技術領域，具體涉及一種兔支氣管敗血波氏桿菌亞(ya)單位(wei)疫苗(miao)。

背景技術：

兔(tu)支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)敗血(xue)波(bo)氏桿菌(jun)(jun)(jun)病(bing)(bing)(bing)(bing)在秋冬季(ji)節和(he)早春多發。主要通(tong)過空氣(qi)(qi)傳播，經(jing)呼(hu)吸(xi)道而(er)感(gan)染。幼兔(tu)發病(bing)(bing)(bing)(bing)率(lv)高，并(bing)且有(you)(you)死(si)亡病(bing)(bing)(bing)(bing)例(li)。成年(nian)兔(tu)發病(bing)(bing)(bing)(bing)較(jiao)少。此菌(jun)(jun)(jun)在群養兔(tu)污染為(wei)(wei)64.4％，散(san)養兔(tu)為(wei)(wei)20％。在自然條(tiao)件下，多種哺(bu)乳(ru)動物(wu)(wu)上呼(hu)吸(xi)道中(zhong)都有(you)(you)本菌(jun)(jun)(jun)寄生(sheng)，常引起(qi)慢性(xing)呼(hu)吸(xi)道病(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)(de)(de)(de)相互感(gan)染。尤其在天氣(qi)(qi)突(tu)變，兔(tu)的(de)(de)(de)(de)抵抗力下降，兔(tu)舍(she)衛生(sheng)不(bu)好，空氣(qi)(qi)污濁等(deng)(deng)情況(kuang)下，均可(ke)引起(qi)本病(bing)(bing)(bing)(bing)發生(sheng)。本病(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)(de)(de)(de)潛伏期(qi)(qi)7～10d。成年(nian)兔(tu)表現鼻(bi)炎(yan)和(he)支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)炎(yan)。有(you)(you)多量的(de)(de)(de)(de)漿液(ye)性(xing)、黏(nian)液(ye)性(xing)鼻(bi)液(ye)流出。鼻(bi)炎(yan)長期(qi)(qi)不(bu)愈(yu)，鼻(bi)腔流出黏(nian)液(ye)性(xing)或膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)性(xing)分(fen)泌物(wu)(wu)，打噴(pen)嚏，呼(hu)吸(xi)困難(nan)，不(bu)食(shi)，消(xiao)瘦等(deng)(deng)。仔(zi)兔(tu)多呈(cheng)(cheng)急性(xing)經(jing)過，初期(qi)(qi)剛(gang)見(jian)(jian)鼻(bi)炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)狀(zhuang)后(hou)，即表現呼(hu)吸(xi)困難(nan)，迅速(su)死(si)亡，病(bing)(bing)(bing)(bing)程(cheng)2～3d。本病(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)(de)(de)(de)主要病(bing)(bing)(bing)(bing)變為(wei)(wei)鼻(bi)炎(yan)、化(hua)(hua)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)性(xing)鼻(bi)氣(qi)(qi)管(guan)(guan)炎(yan)、化(hua)(hua)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)性(xing)支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)肺(fei)炎(yan)，個別的(de)(de)(de)(de)出現敗血(xue)病(bing)(bing)(bing)(bing)變化(hua)(hua)。鼻(bi)腔、氣(qi)(qi)管(guan)(guan)黏(nian)膜充血(xue)、水腫(zhong)。鼻(bi)腔內有(you)(you)漿液(ye)性(xing)、黏(nian)液(ye)性(xing)或黏(nian)液(ye)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)性(xing)分(fen)泌物(wu)(wu)。在肺(fei)門支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)周圍(wei)到肺(fei)的(de)(de)(de)(de)邊(bian)緣見(jian)(jian)有(you)(you)支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)肺(fei)炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)灶。病(bing)(bing)(bing)(bing)變多見(jian)(jian)于心葉、尖葉，嚴重(zhong)的(de)(de)(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)例(li)，波(bo)及(ji)(ji)全肺(fei)葉。病(bing)(bing)(bing)(bing)變部隆起(qi)、堅硬，呈(cheng)(cheng)暗紅色(se)，褐色(se)，進而(er)為(wei)(wei)灰黃色(se)。有(you)(you)些病(bing)(bing)(bing)(bing)例(li)肺(fei)上有(you)(you)大小不(bu)等(deng)(deng)的(de)(de)(de)(de)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)瘡(chuang)。嚴重(zhong)的(de)(de)(de)(de)占肺(fei)部的(de)(de)(de)(de)90％以上。有(you)(you)的(de)(de)(de)(de)肝(gan)臟表面有(you)(you)黃豆至(zhi)蠶(can)豆大的(de)(de)(de)(de)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)瘡(chuang)。膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)瘡(chuang)破后(hou)可(ke)見(jian)(jian)黏(nian)稠(chou)的(de)(de)(de)(de)奶油狀(zhuang)乳(ru)白色(se)的(de)(de)(de)(de)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)汁。還(huan)見(jian)(jian)有(you)(you)心包炎(yan)、胸膜炎(yan)、胸腔積膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)及(ji)(ji)肌肉(rou)膿(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)(nong)腫(zhong)等(deng)(deng)。

兔(tu)(tu)(tu)支(zhi)氣管(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)病(bing)主要采用(yong)生物安全(quan)措(cuo)施和(he)疫苗(miao)預防接種(zhong)。其中生物安全(quan)措(cuo)施主要包(bao)括：加強飼養管(guan)理，改善飼養環(huan)境，做(zuo)好防疫工作；兔(tu)(tu)(tu)場最好堅(jian)持自繁自養；對新引進(jin)的(de)兔(tu)(tu)(tu)，必須隔(ge)離(li)觀察(cha)1個月以上，經(jing)細菌(jun)(jun)學與血(xue)清學檢查(cha)為陰性者方(fang)可(ke)入群。本病(bing)常(chang)與巴(ba)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)混合感染，兔(tu)(tu)(tu)群一(yi)旦(dan)發病(bing)，必須查(cha)明原因，消除外界刺激因素，隔(ge)離(li)感染兔(tu)(tu)(tu)，以控制病(bing)原傳播。兔(tu)(tu)(tu)支(zhi)氣管(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)病(bing)較難治(zhi)愈，需要加強規模化(hua)兔(tu)(tu)(tu)場的(de)免疫，目前主要用(yong)分離(li)到的(de)支(zhi)氣管(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)制成(cheng)滅(mie)活菌(jun)(jun)苗(miao)，進(jin)行預防接種(zhong)，每只(zhi)兔(tu)(tu)(tu)皮下注射(she)1mL，每年2次；也有用(yong)兔(tu)(tu)(tu)巴(ba)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)—波(bo)(bo)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)二聯(lian)(lian)苗(miao)或巴(ba)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)—波(bo)(bo)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)—兔(tu)(tu)(tu)病(bing)毒性出(chu)血(xue)癥三聯(lian)(lian)苗(miao)預防接種(zhong)(杜雅楠等,2006；黃艷艷等,2006)。但兔(tu)(tu)(tu)支(zhi)氣管(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)滅(mie)活疫苗(miao)容易出(chu)現(xian)細菌(jun)(jun)毒素殘(can)留問題，常(chang)導致免疫兔(tu)(tu)(tu)發病(bing)，因此(ci)，目前迫切需要一(yi)種(zhong)能(neng)夠防控該病(bing)的(de)安全(quan)性、效力好的(de)疫苗(miao)，從而彌補(bu)現(xian)有技術的(de)不足。

技術實現要素：

本發明的(de)目的(de)是提(ti)供(gong)一種兔支氣管(guan)敗血(xue)波氏(shi)桿菌亞單(dan)位(wei)疫苗，從(cong)而彌(mi)補現有技術的(de)不足。

本發明首先(xian)提(ti)供(gong)一種兔支氣管敗血波(bo)氏(shi)桿(gan)菌，為(wei)兔支氣管敗血波(bo)氏(shi)桿(gan)菌QDBb01株(Rabbit Bordetella bronchiseptica QDBb01)，于2016年11月01日保藏在中(zhong)(zhong)國武漢的中(zhong)(zhong)國典型培養物(wu)保藏中(zhong)(zhong)心(xin)，保藏編(bian)號為(wei)CCTCC NO:M 2016607。

本(ben)發明所篩選的兔支氣管敗血波氏桿菌(jun)用(yong)于制備疫苗；

本發明再一個方面提供一種兔支氣(qi)管敗血(xue)波(bo)氏(shi)桿菌亞單位疫苗，其中(zhong)抗原為(wei)從上述的(de)兔支氣(qi)管敗血(xue)波(bo)氏(shi)桿菌中(zhong)提取的(de)，具有免(mian)疫原性的(de)蛋白；

其中(zhong)蛋(dan)白(bai)(bai)的提取(qu)方法如下：將兔(tu)支氣管(guan)敗血波氏桿菌QDBb01株(zhu)的菌體破碎后(hou)(hou)，離(li)心(xin)(xin)去除未破碎掉的細菌菌體和較重(zhong)的細菌細胞(bao)內細胞(bao)器(qi)；將上(shang)清液(ye)高(gao)速離(li)心(xin)(xin)后(hou)(hou)獲得沉淀；用(yong)緩沖液(ye)溶解(jie)沉淀后(hou)(hou)，室溫孵育后(hou)(hou)；再進行高(gao)速離(li)心(xin)(xin)；沉淀溶解(jie)以(yi)后(hou)(hou)，用(yong)能夠(gou)截留蛋(dan)白(bai)(bai)分子量(liang)在40kDa以(yi)上(shang)的半透膜透析掉小分子蛋(dan)白(bai)(bai)，透析液(ye)中(zhong)的蛋(dan)白(bai)(bai)即為(wei)目(mu)的蛋(dan)白(bai)(bai)。

本發明實施例中(zhong)提供的一種兔支氣管敗血(xue)波氏桿菌亞單位疫苗，其中(zhong)氫氧化(hua)鋁膠佐劑；

為了彌補現今兔支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)氏(shi)(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)疫苗的(de)(de)(de)不足，本發(fa)明通(tong)過(guo)通(tong)過(guo)將分(fen)離到的(de)(de)(de)兔支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)氏(shi)(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)進行(xing)培養，提供一種兔支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)氏(shi)(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)抗原(yuan)蛋白(bai)的(de)(de)(de)提取(qu)(qu)方法(fa)，并將提取(qu)(qu)出(chu)的(de)(de)(de)抗原(yuan)蛋白(bai)與氫氧化(hua)鋁膠佐劑乳化(hua)混合，制備出(chu)了一種能夠預防兔支氣(qi)(qi)管(guan)(guan)敗(bai)血(xue)波(bo)氏(shi)(shi)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)病的(de)(de)(de)有效疫苗。

附圖說明

圖1：本(ben)發明的兔支氣管敗血波氏桿菌的分離及培養圖；

圖(tu)2：玻片凝集試驗圖(tu)；其中左(陽性(xing)菌(jun))、中(樣品(pin)菌(jun))和(he)右(you)(生(sheng)理鹽水)

圖3單(dan)菌落16S基因、Pm基因和Bb基因的PCR擴增結果(guo)圖，其中“-”陰性(xing)水對(dui)照；“+”陽性(xing)菌對(dui)照。

具體實施方式

實(shi)施例1：兔支氣管敗血波氏桿(gan)菌的分離及(ji)培養(yang)

從山(shan)東省濰坊某兔(tu)(tu)場購進(jin)一批(pi)1.5～3.0kg兔(tu)(tu)子做豬(zhu)瘟脾淋(lin)苗試驗(yan)(yan)，出(chu)現(xian)(xian)以發(fa)病(bing)急(ji)、死(si)亡(wang)快，口鼻出(chu)血(xue)，肺臟(zang)出(chu)血(xue)、淤血(xue)為特征的(de)(de)疾病(bing)，根據發(fa)病(bing)死(si)亡(wang)兔(tu)(tu)的(de)(de)臨(lin)床表現(xian)(xian)、剖檢病(bing)變，初(chu)步(bu)懷疑兔(tu)(tu)巴氏桿(gan)菌(jun)(jun)或(huo)兔(tu)(tu)支氣(qi)管敗(bai)血(xue)波氏桿(gan)菌(jun)(jun)感(gan)染(ran)，于是取肺臟(zang)組(zu)織進(jin)行(xing)了(le)細菌(jun)(jun)的(de)(de)分離和(he)培養(yang)，進(jin)行(xing)玻(bo)片(pian)凝(ning)集試驗(yan)(yan)進(jin)行(xing)驗(yan)(yan)證(zheng)；對培養(yang)單菌(jun)(jun)落(luo)進(jin)行(xing)16s和(he)巴氏桿(gan)菌(jun)(jun)(Pm)基因(yin)或(huo)波氏桿(gan)菌(jun)(jun)(Bb)基因(yin)的(de)(de)PCR擴增，并克隆(long)、測(ce)序，確(que)診該(gai)批(pi)兔(tu)(tu)是由兔(tu)(tu)支氣(qi)管敗(bai)血(xue)波氏桿(gan)菌(jun)(jun)感(gan)染(ran)引起的(de)(de)死(si)亡(wang)。

1.1發病情況從山東濰坊(fang)購進(jin)一批1.5～3.0kg兔子(zi)做豬瘟脾淋(lin)苗(miao)測溫(wen)試驗，該(gai)批兔子(zi)只免(mian)疫(yi)過兔瘟疫(yi)苗(miao)，其它疫(yi)苗(miao)均未免(mian)疫(yi)，整體狀態(tai)良好。

1.2臨(lin)床(chuang)及剖檢癥狀一(yi)只體重大概2kg左右試(shi)驗兔子(zi)，突(tu)然死(si)亡，口鼻噴血(xue)，死(si)前(qian)一(yi)天精神狀態、采食和飲(yin)水良(liang)好，無任何(he)疾(ji)病(bing)癥狀，無打斗外傷(shang)，發病(bing)兔口鼻出血(xue)，肺(fei)臟(zang)出血(xue)、淤血(xue)，肝(gan)臟(zang)有一(yi)葉成黃白色(se)。

1.3實驗室診斷

1.3.1細菌分離和培養

初步懷疑兔巴氏桿菌(jun)或兔支氣管敗血波氏桿菌(jun)感(gan)染，于是無菌(jun)取發(fa)病兔肺(fei)部組織病料均勻接種于巧克(ke)力(li)瓊脂平板(ban)培養基(ji)上，培養24小時形(xing)成中等菌(jun)落，呈(cheng)灰白色，表面濕潤、光(guang)滑，邊緣整(zheng)齊。詳見圖1。

1.3.2細菌鑒定

1.3.2.1革蘭(lan)(lan)氏、美蘭(lan)(lan)染(ran)色(se)鑒定經革蘭(lan)(lan)氏染(ran)色(se)并在顯微鏡下觀察確定，革蘭(lan)(lan)氏染(ran)色(se)為紅色(se)小(xiao)球(qiu)桿(gan)菌，表(biao)明該菌為革蘭(lan)(lan)氏陰性菌；用(yong)美藍染(ran)色(se)，鏡檢，可見多形態(tai)、兩極染(ran)色(se)的小(xiao)桿(gan)菌。

1.3.2.2玻片凝集試驗鑒定采(cai)用(yong)兔(tu)支(zhi)氣管敗血(xue)波氏桿菌(jun)(jun)陽性(xing)(xing)血(xue)清(qing)鑒定該分(fen)離(li)樣品(pin)菌(jun)(jun)，并用(yong)兔(tu)支(zhi)氣管敗血(xue)波氏桿菌(jun)(jun)陽性(xing)(xing)菌(jun)(jun)和(he)生(sheng)理鹽水分(fen)別做陽性(xing)(xing)和(he)陰性(xing)(xing)對照，具體結果見圖2。

1.3.3.3PCR鑒定利用(yong)檢測(ce)原核(he)生物(wu)用(yong)16S通(tong)用(yong)引(yin)(yin)(yin)物(wu)和巴氏桿菌(Pm)特(te)(te)定引(yin)(yin)(yin)物(wu)及設(she)計的波氏桿菌(Bb)特(te)(te)定引(yin)(yin)(yin)物(wu)(上、下游引(yin)(yin)(yin)物(wu)序列詳見(jian)表1)對(dui)單(dan)個菌落進行(xing)PCR擴增，并于1％瓊脂糖凝膠中電(dian)泳，詳見(jian)圖(tu)3。

表1引物序列表

1.3.3.4目的基因序(xu)(xu)列測(ce)定將16S和Bb目的基因分別送上(shang)海生(sheng)工測(ce)序(xu)(xu)，測(ce)序(xu)(xu)結果分析表明，該菌為兔支氣(qi)管敗血波氏桿菌，命(ming)名為QDBb01株。

1.3.3.5兔支(zhi)氣管敗血(xue)波氏桿菌(QDBb01株)滅(mie)活疫苗的制備(bei)

將菌(jun)(jun)種接(jie)種于(yu)鮑姜(jiang)氏(shi)培養基，37℃搖床內(nei)培養48h。用(yong)(yong)滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)生理鹽水(shui)離心洗(xi)滌2次，再用(yong)(yong)生理鹽水(shui)稀釋至含菌(jun)(jun)數為200億個/ml，按(an)總體積(ji)0.4％加(jia)入甲醛，混(hun)(hun)勻，37℃滅(mie)(mie)活(huo)48小時(shi)，每隔6h混(hun)(hun)勻一(yi)次。經檢驗(yan)滅(mie)(mie)活(huo)合格者作為制苗(miao)用(yong)(yong)抗原。與氫氧化鋁膠佐劑按(an)體積(ji)比＝1：4進行配苗(miao)，制備(bei)成(cheng)兔支(zhi)氣(qi)管敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿菌(jun)(jun)滅(mie)(mie)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)，相當于(yu)成(cheng)品含40億個滅(mie)(mie)活(huo)菌(jun)(jun)/ml。免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)結果(guo)(guo)表明(ming)(ming)，本(ben)發明(ming)(ming)篩選的(de)(de)QDBb01株(zhu)(zhu)制備(bei)的(de)(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)對兔支(zhi)氣(qi)管敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿菌(jun)(jun)具有良好的(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)效(xiao)果(guo)(guo)。并(bing)且(qie)，用(yong)(yong)目(mu)(mu)前市場上(shang)出售(shou)的(de)(de)兔支(zhi)氣(qi)管敗(bai)血(xue)波(bo)(bo)氏(shi)桿菌(jun)(jun)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)進行免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)，再用(yong)(yong)本(ben)發明(ming)(ming)篩選的(de)(de)QDBb01株(zhu)(zhu)進行攻毒(du)實驗(yan)；結果(guo)(guo)表明(ming)(ming)目(mu)(mu)前市場上(shang)出售(shou)的(de)(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)的(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)效(xiao)果(guo)(guo)遠低于(yu)本(ben)發明(ming)(ming)QDBb01株(zhu)(zhu)制成(cheng)的(de)(de)滅(mie)(mie)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)的(de)(de)效(xiao)果(guo)(guo)。推測是由于(yu)QDBb01株(zhu)(zhu)基因發生變(bian)異導致目(mu)(mu)前疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)的(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)效(xiao)果(guo)(guo)不好。

實施例2兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)的(de)蛋白(bai)的(de)提(ti)純

將(jiang)分離(li)鑒定保(bao)存(cun)的(de)兔(tu)支氣管敗(bai)血波(bo)氏(shi)桿菌(jun)(jun)(QDBb01株)進(jin)(jin)行3％TSB培養，并4000r/min收集菌(jun)(jun)體，再(zai)用PH7.2Tris-Hcl重懸(xuan)菌(jun)(jun)體，將(jiang)重懸(xuan)菌(jun)(jun)體超聲波(bo)破碎(sui)，工作1s，間(jian)(jian)隔時間(jian)(jian)3s，全程時間(jian)(jian)12min，總共(gong)180次。4000r/min低(di)速離(li)心(xin)去(qu)除(chu)未破碎(sui)掉的(de)細(xi)菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)體和較重的(de)細(xi)菌(jun)(jun)細(xi)胞(bao)內(nei)(nei)細(xi)胞(bao)器，取上清(qing)液于100000r/min，超速離(li)心(xin)20min，去(qu)上清(qing)。將(jiang)含外膜(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)的(de)沉淀用含2％Triton X-100的(de)Tris-Hcl緩沖液溶解，室(shi)溫下(xia)孵育1h去(qu)除(chu)內(nei)(nei)膜(mo)蛋(dan)(dan)白(bai)，再(zai)進(jin)(jin)行100000r/min超速離(li)心(xin)30min，沉淀用緩沖液再(zai)重懸(xuan)，采(cai)用能夠(gou)截(jie)留蛋(dan)(dan)白(bai)分子量(liang)在40kDa以(yi)上(包含主(zhu)要保(bao)護性抗原(yuan)蛋(dan)(dan)白(bai))的(de)半(ban)透膜(mo)透析掉小分子蛋(dan)(dan)白(bai)，分裝，置-20℃保(bao)存(cun)。

實施例3：兔支氣管敗血波(bo)氏桿菌(jun)(QDBb01株)亞單位疫苗(miao)制備(bei)

將(jiang)純(chun)(chun)化好的(de)(de)兔支氣管敗血波氏桿菌蛋(dan)白(bai)用(yong)(yong)分(fen)光光度法按照以下步(bu)驟進行(xing)絕對(dui)定(ding)(ding)量(liang)：(1)加(jia)測(ce)(ce)(ce)蛋(dan)白(bai)用(yong)(yong)的(de)(de)PBS 0.15ml和蛋(dan)白(bai)定(ding)(ding)量(liang)用(yong)(yong)考(kao)馬斯亮藍染液(ye)2.85ml于(yu)比(bi)色皿中作為對(dui)照，進行(xing)調零；(2)加(jia)測(ce)(ce)(ce)蛋(dan)白(bai)用(yong)(yong)PBS 0.14ml、加(jia)待測(ce)(ce)(ce)蛋(dan)白(bai)溶(rong)液(ye)0.01ml和蛋(dan)白(bai)定(ding)(ding)量(liang)用(yong)(yong)考(kao)馬斯亮藍染液(ye)2.85ml于(yu)比(bi)色皿中測(ce)(ce)(ce)出吸光度值y為0.204，通過公式y＝0.152x+0.068得出蛋(dan)白(bai)濃度x＝0.83mg/ml，即為895μg/ml，以上所用(yong)(yong)測(ce)(ce)(ce)蛋(dan)白(bai)用(yong)(yong)試(shi)劑(ji)購自TIANGEN公司(si)。將(jiang)此純(chun)(chun)化的(de)(de)蛋(dan)白(bai)溶(rong)液(ye)稀釋(shi)成(cheng)(cheng)(cheng)150ug/ml，與氫氧化鋁膠佐(zuo)劑(ji)按體積比(bi)＝1：4進行(xing)配(pei)苗(miao)，制備(bei)成(cheng)(cheng)(cheng)兔支氣管敗血波氏桿菌亞單位疫苗(miao)，成(cheng)(cheng)(cheng)品(pin)相(xiang)當于(yu)每毫升氫氧化鋁膠苗(miao)中含有蛋(dan)白(bai)30μg/ml。

實施(shi)例4：兔支氣管敗血(xue)波氏桿菌滅活苗(miao)和亞單(dan)位疫苗(miao)效力檢(jian)驗方法

4.1攻毒用菌液的制備將分離鑒定保存的兔支氣管敗血波氏桿菌(QDBb01株)復蘇挑取單菌落接種150ml 3％小牛血清鮑姜氏培養基，37℃過夜搖床培養兔支氣管敗血波氏桿菌，次日早上取出，進行菌落計數：將菌液進行10^-7倍稀釋，取0.1ml進行涂板，然后計算菌落數為48個。結果，菌數為4.8×10⁹cfu/ml。

4.2攻毒菌液最小致死劑量(LD₅₀)的確定選擇25只兔子，隨機分成5組，每組5只，將上述菌液按照10^-1依次稀釋成4.8×10⁷cfu/ml、4.8×10⁶cfu/ml、4.8×10⁵cfu/ml、4.8×10⁴cfu/ml四個梯度，以1ml/只的劑量進行攻菌，留1組作為空白對照。連續觀察、記錄兔子發病死亡情況，解剖觀察病變情況，最終確定4.8×10⁵CFU為最小致死劑(ji)量。

4.3兔支氣管敗血波氏桿菌滅活疫苗、亞單位疫苗的攻毒保護試驗將制備出的此滅活疫苗和亞單位疫苗成品分別按照1ml/只劑量皮下注射免疫體重1.5kg左右的家兔各10只，留10只作為未免疫對照組。免后14日，用兔支氣管敗血波氏桿菌QDBb01株(LD₅₀為4.8×10⁵CFU)按照100LD₅₀進行攻(gong)毒，攻(gong)毒后(hou)觀(guan)察7日，統計家兔(tu)的(de)(de)(de)攻(gong)毒保(bao)護率，以此(ci)來判定(ding)該(gai)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗的(de)(de)(de)保(bao)護效果。結果，對(dui)照(zhao)組10只全(quan)部發(fa)(fa)病(bing)，解剖上(shang)呼吸道病(bing)變均(jun)為支氣(qi)管(guan)敗(bai)血波(bo)氏桿(gan)菌典(dian)型(xing)癥(zheng)狀；而(er)(er)亞(ya)(ya)單(dan)(dan)位(wei)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗和滅(mie)活(huo)(huo)苗免疫(yi)(yi)(yi)(yi)組攻(gong)毒后(hou)均(jun)健活(huo)(huo)，均(jun)未見發(fa)(fa)病(bing)，保(bao)護率均(jun)為10/10。但解剖兩(liang)種疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗的(de)(de)(de)注(zhu)射的(de)(de)(de)部位(wei)發(fa)(fa)現(xian)，滅(mie)活(huo)(huo)苗吸收(shou)不完全(quan)，而(er)(er)制(zhi)(zhi)備的(de)(de)(de)亞(ya)(ya)單(dan)(dan)位(wei)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗吸收(shou)完全(quan)，因(yin)此(ci)，制(zhi)(zhi)備的(de)(de)(de)兔(tu)支氣(qi)管(guan)敗(bai)血波(bo)氏桿(gan)菌(QDBb01株)亞(ya)(ya)單(dan)(dan)位(wei)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗較滅(mie)活(huo)(huo)苗具有(you)更好(hao)的(de)(de)(de)安(an)全(quan)性。而(er)(er)且(qie)，與(yu)QDBb01株制(zhi)(zhi)備的(de)(de)(de)滅(mie)活(huo)(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗類似(si)，本發(fa)(fa)明制(zhi)(zhi)備的(de)(de)(de)亞(ya)(ya)單(dan)(dan)位(wei)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗對(dui)QDBb01株的(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)(yi)(yi)效果也在統計學意義上(shang)好(hao)于(yu)市(shi)場上(shang)的(de)(de)(de)類似(si)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗。