一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白、基因工程亞單位疫苗及制備方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫學技術領域，具體提供一種水痘?帶狀皰疹病毒gB?gE?gH?gL融合蛋白、基因工程亞單位疫苗及制備方法。該融合蛋白包括VZV gB胞外區、gE胞外區、gH截短片段和gL截短片段，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發明利用原核表達載體構建了能夠表達VZV gB?gE?gH?gL融合蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌，將該融合蛋白純化與可藥用佐劑混合制成基因工程亞單位疫苗，與目前使用的VZV減毒活疫苗相比，該疫苗不僅能夠誘導免疫小鼠產生更強的特異性體液免疫和細胞免疫，在豚鼠中也可以預防VZV經血流播散至背根神經節和腸道神經節的潛伏感染，有效地提高了VZV疫苗的安全性，因而是具有潛在臨床應用價值的備選疫苗。
【專利說明】
_種水痘一帶狀皰疼病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白、基因工程亞 單位疫苗及制備方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物醫學領域，特別是涉及到研究水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融 合蛋白、基因工程亞單位疫苗及制備方法。
【背景技術】
[0002] 水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)屬皰疹病毒α亞科，為雙鏈 DNA病毒。VZV引起的水痘傳染性極強，我國青少年血清中抗體的陽性率達到85 %以上。成人 若發生水痘則常常出現嚴重的內臟感染甚至全身感染。原發感染中病毒通過血液或皮膚-神經逆行途徑進入神經元中建立潛伏感染，日后潛伏病毒的再激活可導致帶狀皰疹，據估 計有1/3的成年人會至少發生一次帶狀皰疹，他們有可能出現非常痛苦的長期慢性疼痛。
[0003] 由日本研發的VZV減毒活疫苗(vOka株)是目前預防水痘和帶狀皰疹有效而安全的 方法，該疫苗目前已在歐洲、北美、以及包括我國在內的亞洲國家普遍應用。但是近來的研 究發現該疫苗存在一些不足之處：1 .VZV活疫苗的保護率不到80 %，而且有少數疫苗接種者 在密切接觸水痘患者或VZV野毒株后，仍可能發生感染，稱為"突破感染"。2.活疫苗病毒與 野毒株一樣可以在接種者體內的神經節中建立潛伏感染，導致病毒再激活感染的可能性增 加。3.已經發現疫苗株與野毒株可以在體內發生基因重組形成新病毒引發感染。4.減毒活 疫苗在免疫缺陷者中可能導致危險的全身感染。因此，研發保護效果更好、副作用更低的新 一代VZV疫苗成為進一步降低水痘-帶狀皰疹病毒感染相關疾病發病率最有效的策略之一。
[0004] 人們早已認識到，給予新近暴露于VZV的個體含高效價VZV抗體的免疫血清，可以 有效地預防發病。這些免疫血清中針對病毒表面多種糖蛋白的抗體能夠干擾VZV入侵細胞， 以及病毒在體內細胞-細胞之間的擴散。因此用一種或幾種這樣的病毒糖蛋白制備的亞單 位疫苗有可能取代減毒活疫苗。VZV基因組為約125kb的線性雙鏈DNA分子，包含一個約 100kb的獨特長片段(UL)和約5.4kb的獨特短片段(US)，它們的兩端連接著6.8kb的末端和 內部重復序列。病毒基因組共含有70多個開放讀碼框，除了編碼與病毒復制、轉錄、包裝、釋 放等生物活性相關的蛋白分子以及與宿主細胞相互作用的蛋白以外，還編碼gB、gC、gE、gH、 gI、gK、gL和gM共8種糖蛋白，這些糖蛋白在病毒的成熟與包裝方面發揮著極為重要的作用。 其中gE是病毒本身以及病毒感染的細胞中含量最高的糖蛋白，以AS01B為佐劑的gE亞單位 疫苗在1/2期臨床試驗中已經顯示了有效的免疫效果。gB與gE-樣是激發機體CD4和CD8T淋 巴細胞的主要抗原，因此也被認為是亞單位疫苗的候選者之一。在處于感染后恢復期的水 痘和帶狀皰疹患者的血清中，除了含有大量的gE抗體以外，還存在針對病毒糖蛋白gB、以及 gH、gL二聚體的中和性抗體。近年的研究表明gB、gH/gL二聚體是VZV入侵細胞所必需。gH和 gL在細胞內分別合成以后，一起發生折疊形成一個密切的二聚體結構。在病毒導致的受染 細胞胞膜的融合過程中，gB與gH/gL二聚體的融合，而這個融合可以被gB或gH/gL二聚體的 抗體所抑制。針對gH/gL的中和抗體可以有效地防止病毒在細胞與細胞之間的擴散。gH共有 795個氨基酸，分為H1A/B-H2-H3幾個區域，gL只有160個氨基酸。蛋白結晶結構分析表明， gH/gL二聚體的抗原表位由gH的A環、B環以及gL的第三個螺旋La3構成，其中位于A環內的 D288/W291、F292 為關鍵。
[0005] 在本專利中我們利用基因重組技術，將VZVgB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白 的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位、gL蛋白的氨基酸第23-160位通過柔性 Linker連接，構建了VZVgB-gE-gH-gL融合基因，插入原核表達載體，在大腸桿菌中進行誘導 表達，純化得到了 VZV gE-gB-gH-gL融合蛋白。以此作為抗原制備的VZV亞單位疫苗在小鼠 體內可以產生特異性免疫應答，在我們建立的VZV感染豚鼠模型中顯示可以產生保護作用。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種水痘-帶狀皰疹病毒基因工程亞單位疫苗，其主要是由 一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白作為抗原制備而成。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] 一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，所述融合蛋白為按水痘-帶狀皰 疹病毒gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位和gL蛋白的氨基酸第23-160位的順序重組構建而得。
[0009] 本發明所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，所述融合蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 本發明所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，所述融合蛋白的基 因編碼核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011] 一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)將水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合基因連接入表達載體中，構建成表達 重組質粒；
[0013] (2)將構建的表達重組質粒轉化宿主菌，構建能表達水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE- gH-gL 融 合蛋白 的重組基因工程菌；
[0014] (3)用該重組基因工程菌表達出水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，對其 進行純化。
[0015]本發明所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備方法，步驟 (1) 所述表達載體為pET30a (+)。
[0016]本發明所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備方法，步驟 (2) 所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。
[0017] 一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亞單位疫苗，所述疫苗的抗原為前 述的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白。
[0018] 本發明所述的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亞單位疫苗的制備方法， 將純化后的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白與可藥用佐劑混合制成疫苗。
[0019] 本發明所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亞單位疫苗的制備 方法，所述可藥用佐劑為鋁鹽類佐劑、弗式完全佐劑、蜂膠佐劑、油水乳劑、細胞因子、CpG DNA、基因工程減毒素、免疫刺激復合物、脂質體中的至少一種。
[0020] 本發明所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白基因工程亞單位疫 苗的制備方法，所述鋁鹽類佐劑為氫氧化鋁。
[0021]本發明的有益效果在于：
[0022] 本發明利用pET30a( + )表達性載體構建了能表達水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL 融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌。經SDS-PAGE分析，表達出了64kDa重組目的蛋白，純 化后融合蛋白經HPLC檢測純度達到95%以上。將重組蛋白純化后與氫氧化鋁佐劑混合制備 成基因工程亞單位疫苗，免疫6周齡BALB/c小鼠，免疫小鼠血清中和抗體滴度在免疫后3、5、 7周分別為1:316，1:315和1:299，可見以重組gB-gE-gH-gL融合蛋白為抗原的免疫小鼠可以 產生更高滴度的中和抗體。以重組gB-gE-gH-gL融合蛋白為抗原的免疫小鼠淋巴細胞刺激 指數在免疫后3、5、7周分別為3.9,3.9和4.1，比單純的gE蛋白抗原能誘導更強的細胞免疫 力。免疫后第7周對小鼠淋巴細胞在體外經滅活VZV刺激后，重組gB-gE-gH-gL融合蛋白組為 276pg/mL，高于對照組(41.3pg/mL);而IL-4的濃度免疫組與對照組相比呈現2倍左右的提 高，這些表明接種本亞單位疫苗可能形成較強的Thl型細胞免疫記憶。將該疫苗免疫豚鼠， 30日后再從靜脈輸入體外感染VZV的豚鼠單個核細胞(PBMC)，可以保護豚鼠不受VZV感染。
【附圖說明】
[0023]圖1為水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白模擬空間構象圖；
[0024] 圖2為接種本發明中的疫苗后小鼠血清中和抗體滴度檢測結果；
[0025] 圖3為接種本發明中的疫苗后小鼠淋巴細胞增殖效應檢測結果；
[0026]圖4為接種本發明中的疫苗后小鼠淋巴細胞接受特異性抗原刺激分泌IFN-γ和 IL-4水平檢測結果。
【具體實施方式】
[0027] 為更好理解本發明，下面結合實施例及附圖對本發明作進一步描述，以下實施例 僅是對本發明進行說明而非對其加以限定。
[0028]
【申請人】在從水痘患者皮膚水皰液中分離獲得水痘-帶狀皰疹病毒，通過PCR擴增出 gB、gE、gH、gL基因片段，再通過嵌套PCR將gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第 37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位和gL蛋白的氨基酸第23-160位通過柔性Linker連接 并插入pET30a( + )原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，構建重組基因工程菌，通過對工 程菌的誘導、超聲破碎、蛋白純化、定量、與佐劑配比等制備和生產方法制備出了 VZV基因工 程重組亞單位疫苗。
[0029]實施例1 gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備 [0030]步驟一 gB-gE-gH-gL融合蛋白的原核表達
[0031]將從水痘患者皮膚水皰中采集的水皰液接種至MRC-5細胞上，進行VZV病毒的分離 培養，等到細胞出現病變后，收集細胞，通過酚:氯仿:異戊醇法提取DNA，作為PCR擴增的模 板；
[0032] 根據Genebank中VZV Dumas(X04370.1)株的序列分別設計VZV gB蛋白的氨基酸第 136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨基酸第18-168位、gL蛋白的氨基酸第 23-160位的嵌套式PCR引物，每兩個蛋白之間用GGGGS連接，在最終gB-gE-gH-gL融合基因兩 端保留Ndel和Noc頂每切位點；
[0033] 通過T4DNA連接酶將gB-gE-gH-gL融合基因通過Ndel和Noel酶切位點插入pET30a (+ )載體(或PQE30載體），將質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)(或M15宿主菌），用IPTG誘導表達， SDS-PAGE檢測顯示在64kDa處出現蛋白表達。
[0034] 步驟二gB-gE-gH-gL融合蛋白的純化
[0035]融合蛋白以不可溶的包涵體形式表達，誘導表達后的菌體經超聲破碎后離心得到 包涵體，包涵體使用8M尿素溶解，隨后使用GE公司的Ni-HTA進行親和層析復性純化，純化后 融合蛋白經HPLC檢測純度達到95%以上，其模擬空間構象如圖1所示。
[0036]實施例2亞單位疫苗的免疫效果檢測
[0037] 將純化后的gB-gE-gH-gL融合蛋白用BCA法檢測蛋白濃度，用PBS稀釋至0 · 5mg/mL， 無菌過濾，備用；按現行《中國藥典》進行無菌檢驗，用鱟試劑方法進行內毒素檢測，內毒素 含量不高于l〇〇EU/mL方可使用；
[0038]將gB-gE-gH-gL融合蛋白與等體積的氫氧化鋁佐劑或弗氏完全佐劑1:1混合，充分 乳化，對6周齡BALB/c小鼠進行腹腔免疫接種，25yg/只小鼠；初次免疫2周后，加強免疫一 次，劑量同第一次；同時接種相同劑量的重組VZV gE蛋白和PBS作為對照。
[0039] 在接種后第3、5、7周各處死3只小鼠，通過空斑形成抑制實驗檢測小鼠血清中和抗 體效價，通過脾淋巴細胞增殖實驗和檢測抗原刺激后脾淋巴細胞分泌INF- γ和IL-4的情況 評價特異性細胞免疫力。
[0040] 步驟一、空斑形成抑制實驗檢測小鼠血清中和抗體效價
[0041 ] 收集小鼠血清，于56°C滅活30min，按1:50稀釋后作為原液，再按1:2，1:4…倍比稀 釋至1:128，取20(^1^稀釋后血清與20(^1^滴度為5000??1]/1^的￥2￥病毒混合，37°(：孵育1小 時。然后將混合液接種至長滿單層MRC-5細胞的24孔板中，于37 °C，5 %⑶2的溫箱中培養48 ~72小時。以空白對照(含非免疫小鼠的血清）中空斑的數量來計算病毒的滴度，以能抑制 50%病毒病變的免疫血清稀釋度作為中和抗體效價(NT50)。結果如圖2所示，以重組gE蛋白 為抗原的免疫小鼠血清中和抗體滴度在免疫后3、5、7周分別為1:101，1:119和1:92;而以重 組gB-gE-gH-gL融合蛋白為抗原的免疫小鼠血清中和抗體滴度在免疫后3、5、7周分別為1: 316,1:315和1:299;可見以重組gB-gE-gH-gL融合蛋白為抗原的免疫小鼠可以產生更高滴 度的中和抗體。
[0042]步驟二、細胞免疫力檢測
[0043]免疫后第3、5、7周分別處死3只小鼠，無菌分離脾淋巴細胞，將細胞總濃度調整為5 X 106/mL。每孔100yL細胞懸液，加入96孔板，每只小鼠8孔，其中4孔加入1 X 104PFU滅活VZV 作為試驗組，4孔加入培養基作為陰性對照組，置于37 °C，5 %C02培養箱中培養48h。對第7周 的小鼠每孔分別取l〇〇yL培養上清液進行IFN-γ和IL-4含量測定。同時每孔加入20yL MTT (5mg/mL)以后繼續培養4h。棄去培養上清，每孔加入100yL DMS0,使結晶溶解以后讀取OD57〇 值。試驗組〇D57Q值與對照組0D 57Q值之間的比值即為刺激指數(SI)，刺激指數越大表示淋巴 細胞增殖能力越強。結果如圖3所示，以重組gE蛋白為抗原的免疫小鼠淋巴細胞刺激指數在 免疫后3、5、7周分別為2.4，2.5和2.4;而以重組gB-gE-gH-gL融合蛋白為抗原的免疫小鼠淋 巴細胞刺激指數在免疫后3、5、7周分別為3.9,3.9和4.1，因此以重組gB-gE-gH-gL融合蛋白 為抗原的免疫小鼠比單純的gE蛋白抗原能誘導更強的細胞免疫力。免疫后第7周對小鼠淋 巴細胞在體外經滅活VZV刺激后，如圖4所示，細胞培養上清中重組gE蛋白組IFN- γ平均含 量為123.7pg/mL，重組gB-gE-gH-gL融合蛋白組為276pg/mL，均高于對照組(41.3pg/mL);而 IL-4的濃度免疫組與對照組相比呈現2倍左右的提高，不同抗原免疫組之間沒有顯著性差 異。這些表明接種本亞單位疫苗可能形成較強的Thl型細胞免疫記憶。
[0044] 實施例3攻毒保護試驗
[0045] 在體外培養出可以適應豚鼠細胞的VZV毒株，再用該毒株體外感染豚鼠外周血淋 巴細胞，然后將感染了 VZV的豚鼠淋巴細胞回輸至豚鼠，28天后可在豚鼠的腸道神經節和背 根神經節中建立潛伏感染。利用該模型進行攻毒保護試驗，將8周齡雌性Hartley豚鼠12只 分成兩組，每組6只，第一組為免疫組，用本發明制備的VZV基因工程亞單位疫苗進行二次免 疫(第一次免疫14天后進行第二次免疫，每次每只lOOyg，皮下注射），第二組為生理鹽水對 照組，注射同等體積的無菌生理鹽水。第二次免疫28天后制備感染VZV的豚鼠 PBMC，步驟如 下:在6孔板中加入MRC-5細胞培養至細胞長滿單層，加入5 X 105PFU VZV繼續培養24h，向其 中加入3 X 106個豚鼠 PBMC，室溫200 X g離心45min，將6孔板置于33 °C，5 % C02培養箱中繼續 培養20小時，輕輕吹起PBMC，室溫420 X g離心5min，棄上清，用新鮮的生理鹽水重懸細胞，調 整細胞濃度至3 X 106/50yL，將50yL感染了 VZV的豚鼠 PBMC經眼靜脈竇回輸至豚鼠血液循 環，28天后處死豚鼠，從腸組織和脊柱分別分離腸道神經節和背根神經節，提取DNA，通過巢 式PCR檢測VZV 0RF29和0RF40基因，只要其中一個基因檢測為陽性即認為存在VZV感染，均 為陰性即認為無 VZV感染。結果如表1所示，接種疫苗后豚鼠神經節中檢測不出VZV DNA，而 未接種疫苗的豚鼠均能檢測到VZV DNA，表明疫苗具有較好的保護作用。
[0046] 表1 VZV基因工程亞單位疫苗免疫后攻毒保護試驗結果
[0047]
[0048]以上所述實施方式僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范 圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方 案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白為按水 痘-帶狀皰疹病毒gB蛋白的氨基酸第136-285位、gE蛋白的氨基酸第37-161位、gH蛋白的氨 基酸第18-168位和gL蛋白的氨基酸第23-160位的順序重組構建而得。2. 根據權利要求1所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，其特征在于： 所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 根據權利要求1或2所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，其特征在 于:所述融合蛋白的基因編碼核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。4. 一種權利要求3所述的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備方法，其特 征在于，包括以下步驟： (1) 將水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合基因連接入表達載體中，構建成表達重組 質粒； (2) 將構建的表達重組質粒轉化宿主菌，構建能表達水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL 融合蛋白的重組基因工程菌； (3) 用該重組基因工程菌表達出水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白，對其進行 純化。5. 根據權利要求4所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備方法， 其特征在于:步驟(1)所述表達載體為pET30a( + )。6. 根據權利要求4所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白的制備方法， 其特征在于:步驟(2)所述宿主菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。7. -種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亞單位疫苗，其特征在于:所述疫苗 的抗原為權利要求3所述的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白。8. -種權利要求7所述的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亞單位疫苗的制備 方法，其特征在于:將純化后的水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白與可藥用佐劑混 合制成疫苗。9. 根據權利要求8所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL基因工程亞單位疫苗的 制備方法，其特征在于:所述可藥用佐劑為鋁鹽類佐劑、弗氏完全佐劑、蜂膠佐劑、油水乳 劑、細胞因子、CpG DNA、基因工程減毒素、免疫刺激復合物、脂質體中的至少一種。10. 根據權利要求9所述的一種水痘-帶狀皰疹病毒gB-gE-gH-gL融合蛋白基因工程亞 單位疫苗的制備方法，其特征在于:所述鋁鹽類佐劑為氫氧化鋁。
【文檔編號】A61K39/25GK105906721SQ201610452819
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月21日
【發明人】王明麗, 甘霖, 陳敬賢
【申請人】蕪湖天明生物技術有限公司