，并且在ER應激誘導的蛋白質水解后，它通 過存在于編碼ER蛋白伴侶的基因的啟動子中的順式作用ER應激應答元件化RSE)而起到細 胞核轉錄因子的作用。該蛋白質已經被鑒定為靜止的而非增殖性鱗狀癌細胞的存活因子。 5. ASKl
[0062] 調亡信號調節激酶I (ASKl)也稱為絲裂原活化蛋白激酶5(MAP3K5)，它是MAP激酶 家族的成員，并且同樣是絲裂原活化蛋白激酶通路的一部分。ASKl直接將MKK4(SEK1)/MKK7 和MKK3/MKK6憐酸化，運隨之響應于一系列應激如氧化應激、內質網應激和巧流入，W不依 賴Raf的方式激活C-Jun N末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶。
[0063] 在無應激條件下，ASKl通過其C末端卷曲螺旋域(CCC)進行寡聚（對于其活化是必 需的），但由于減少的硫氧還蛋白（Trx)和巧W及整合素結合蛋白I(CIBl)的抑制作用，其仍 保持為無活性形式。Trx通過直接與其N末端卷曲螺旋域(NCC)結合而抑制ASKl激酶活性。 Trx和CIBl分別W氧化還原或巧敏感性方式調節ASKl活化。兩者似乎都與TNF-a受體相關因 子2(TRAF2)---種ASKl活化劑相競爭。然后，TRAF2和TRAro被募集到ASKl，W形成更大分 子量的復合物(參見圖2A)。隨后，ASKl不僅通過CCC，還通過NCC來形成同寡聚相互作用，運 導致ASKl通過在蘇氨酸845處的自憐酸化而完全活化。 6. JNK
[0064] C-Jun-N末端激酶(JNK1/2/3)是在哺乳動物細胞中發現的絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)級聯的S個主要組之一的下游組分，其中另外兩個由細胞外信號調節激酶化RK1/2) 和p38蛋白激酶(p38.a、e、丫、S)組成。每一組的激酶均為包括MAPK的=模塊級聯的一部分， 該MPK通過由MAPK激酶(MAPKK)引起的憐酸化而得到激活，該MPK激酶隨之通過由MAPKK激 酶(MAPKKK)引起的憐酸化而得到激活。已將JNK和p38的活化與調亡的誘導相聯系。通過采 用多種細胞類型，證明了 JNK的持續活化誘導細胞死亡，并且證明通過顯性陰性化N)抑制劑 對JNK活化的阻滯阻止了由一系列調亡刺激導致的殺傷。通過對祀向破壞化k基因的小鼠的 分析也證明了 JNK在調亡中的作用。JNKl和JNK2均缺乏的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)對由多 種應激刺激導致的調亡具有完全的抗性，該應激刺激包括基因毒物、UV福射和茵香霉素，并 且化k3-/-神經元在對興奮毒素的調亡反應中表現出嚴重的缺陷。而且，已證明JNK2對于在 未成熟胸腺細胞中的抗-CD3誘導的調亡是必需的。 7. P38MAP 激酶
[0065] P38MAP激酶(a、e、丫和S)是MAPK家族的成員，并且W下四種P38MPK均已經在高等 真核生物中進行克隆：p38-a/XMpk2/CSBP、p38-e/p38-的2、p38- 丫 /SAPK3/ERK6和p38-S/ SAPK4。運四種蛋白質在其氨基酸序列上有60-70%相同，并且均被MKK6(MAPK激酶-6)激活。 已證明另一種MPK激酶一MKK3(MAPK激酶-3)將p38-a、p38-丫和P38-S(而非P38-02)憐酸化 并激活。哺乳動物P38MAPK家族通過細胞應激而激活，該細胞應激包括UV福射、熱激和高滲 透應激。
[0066] 由于越來越多的轉錄因子被認為是p38的直接祀標，因此P38MAP激酶的活化還可 直接影響基因轉錄。已經描述了 ATFUATF2和ATF-6、MEF2A/C(肌細胞增強因子-2A/C)、 SAPlA(信號傳導淋己細胞活化分子相關蛋白-1A) W及ElkUETS域轉錄因子-1)的直接憐酸 化和活化。 8. MEK
[0067] "MEK1"和"MEK2"是絲裂原活化的邸K活化激酶的縮寫巧中邸K是細胞外信號調節 蛋白激酶，MAPK的另一個名稱）dMEK巧PMEK2是雙功能的絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶， 并且也被稱為MAP激酶。Ras-GTP激活Raf ,Raf激活MEKl和MEK2，而MEKl和MEK2激活MAP激酶 (MAPK)。一旦被激活，Raf和其他激酶將兩個相鄰的絲氨酸殘基(在MEK-I的情況下為S 2IS和 S222 )上的MEK憐酸化。運些憐酸化對于MEK活化為激酶是必需的。隨之，MEK將在由單個氨基 酸分開的兩個殘基上的MAP激酶憐酸化，該單個氨基酸為:酪氨酸(Y"5)和蘇氨酸(T"3)。在 將MP激酶憐酸化之前，MEK似乎與MAP激酶緊密關聯，表明MEK對MAP激酶的憐酸化可能需要 兩種蛋白質之間預先的強相互作用。 9. PI3K-Akt 通路
[0068] 憐脂酷肌醇3'-激酶(PUK)-Akt信號傳導通路被多種類型的細胞刺激或毒性損傷 激活，并且調芐基本的細胞功能如轉錄、翻譯、增殖、生長和存活。生長因子與其受體酪氨酸 激酶(RTK)或G蛋白偶聯受體(GPCR)的結合分別刺激Ia和Ib類PI3K同種型。PUK催化憐脂酷 肌醇-3,4,5-S憐酸(PIP3)在細胞膜處的產生。PIP3轉而作為幫助激活Akt的第二信使。一 旦成為活性的，Akt可通過使參與調亡、蛋白質合成、代謝和細胞循環的底物憐酸化來控制 關鍵的細胞過程。 10. XBP-I
[0069] 該基因編碼通過與被稱為X盒的啟動子元件結合而調節MHC II類基因的轉錄因 子。該基因產物為bZIP蛋白，其也被鑒定為與T細胞白血病病毒I型啟動子的啟動子中的增 強子結合的細胞轉錄因子。已經發現，未折疊蛋白質在內質網巧R)中積累時，該基因的mRNA 通過經由核酸內切酶肌醇需求酶I(IREl)介導的非常規剪接機制被加工成活性形式。所產 生的來自剪接的mRNA的26nt的損失導致移碼和同種型XBPl(S),該同種型XBPl(S)是功能活 性轉錄因子。由未剪接的mRNA編碼的同種型一XBPl(U)是組成型表達的，并且被認為起到 XBPl(S)的負反饋調節物的作用，其關閉祀基因在邸應激的恢復階段中的轉錄。XBPl的假基 因已被鑒別出且位于5號染色體。 11. eIF2-a
[0070] eIF2-a是翻譯起始因子，其通過與GTP和起始因子tRNA形成S元復合物而在蛋白 質合成的早期步驟中起作用。該復合物與40s核糖體亞基結合，隨后與mRNA結合形成43S起 始前復合物。連接60S核糖體亞基W形成80S起始復合物之前，將與eIF-2結合的GTP水解并 釋放eIF-2-GDP二元復合物。為了 eIF-2再循環并催化另一輪的引發，與eIF-2結合的GDP必 須W經由eIF-2B催化的反應的方式與GTP交換。eIF2-a被陽服、GCN2、皿I和PKR等至少4種激 酶被憐酸化，并且憐酸化使eIF-2/GDP/eIF-2B復合物穩定化并阻止GDP/GTP交換反應，由此 減少eIF-2在連續數輪引發之間的再循環并導致翻譯的全面抑制。 12. GSK3
[0071] 糖原合成酶激酶-3(GSK3)最初被鑒定為參與糖原代謝的控制的酶。近年來已經證 明它在調節各種不同的細胞功能中具有關鍵作用，運些細胞功能包括蛋白質合成的引發、 細胞增殖、細胞分化、調亡，并且其作為Wnt信號傳導級聯的組分是胚胎發育所必需的。GSK3 作為膜島素信號傳導通路中的核屯、負調節物且在膜島素抗性中發揮作用。 13. NRF2
[0072] 核因子(紅系衍生2)樣2也被稱為NFE2L2或NRF2,是在人類中由NFE2L2基因所編碼 的轉錄因子。NRF2抗氧化反應通路是針對氧化應激的細胞毒性效應的主要細胞防御。NRF2 增加了若干種抗氧化酶的表達。
[0073] NRF2是堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子。在正常或未應激的條件下，NRF2通過 Kelch樣-ECH-相關蛋白UKEAP1)和滯蛋白3(化Ilin 3)(其通過泛素化降解NRF2)保持在細 胞質中。在氧化應激下，NRF2不被降解，而是轉移到細胞核中，在那里它引發抗氧化基因及 其蛋白質的轉錄。 14. KEAPl
[0074] 已經證明Kelch樣ECH相關蛋白UKEAPl)與NRF2(抗氧化反應的主要調節物）相互 作用。在靜態下，NRF2通過與KEAPl結合而錯定在細胞質中，KEAPl轉而促進泛素化和隨后的 NRF2蛋白質水解。運種結合和NRF2在細胞質中的進一步降解是KEAP1對NRF2的抑制效應的 機制。 15. ATF4
[007引激活轉錄因子4(化X-響應性增強子元件B67)也稱為ATF4,是人類中由ATF4基因編 碼的蛋白質。該基因編碼最初被鑒定為廣泛表達的哺乳動物DNA結合蛋白的轉錄因子，該 DNA結合蛋白可W結合HTLV-I的LTR中的tax-響應性增強子元件。編碼的蛋白質還被分離并 被稱為cAMP反應元件結合蛋白2 (CREB-2)。由該基因編碼的蛋白質屬于DNA結合蛋白家族， 該家族包括轉錄因子的AP-I家族、cAMP反應元件結合蛋白（CREB)和CR邸樣蛋白。運些轉錄 因子共享蛋白質-蛋白質相互作用中設及的亮氨酸拉鏈區，該亮氨酸拉鏈區位于充當DNA結 合域的一段堿性氨基酸的C末端。已描述了編碼相同蛋白質的兩個替代轉錄物。兩個假基因 位于X染色體上含有較大反向重復的區域中的q28處。 干燥儲存穩定劑 1.天然和合成的氨基酸
[0076] 同樣如本文所述的，某些實施方案中脫水制劑可在用于將功能性細胞在環境溫度 下基本干燥儲存的脫水制劑中包含至少一種氨基酸或合成氨基酸。
[0077] 在某些實施方案中，該天然氨基酸選自甘氨酸、谷氨酷胺、谷氨酸和脯氨酸。
[0078] 在某些其他實施方案中，該脫水制劑和組合物可含有一種或多種具有通式I的合 成氨基酸，
其中Ri、R2、R3獨立地選自芳基、芳烷基、-H、-C出和-C出-C曲，其中當Ri和R2為C出或Ofe-C出時，化為H或不存在，其中X選自-C出-，-C出CH2-，-OfcC出CH2-，-OfcC出OfcC出-，
并且其中Y選自COO和S03。
[0079] 在所述組合物中有用的示例性合成氨基酸包括在W02010132508和美國專利8， 519,125中描述的那些，運些文獻的內容通過引用全文并入本文。可在本發明組合物中采用 的合成氨基酸包括徑脯氨酸和甜菜堿(N，N，N-S甲基甘氨酸）。 2. 膚
[0080] 在某些實施方案中，本文所述的用于將細胞在環境溫度下基本干燥儲存的脫水制 劑可含有膚。有利的是，已確定包含穩定量(例如，約IOmM到200mM)的小二膚或二膚類似物 的某些脫水制劑(包括表1中列出的那些）出乎意料地能夠將細胞在環境溫度下基本干燥儲 存，并且儲存持續超過運些細胞的冷藏的時間段。示例性的二膚具有氨基酸序列丙氨酸-谷 氨酷胺。 3. =糖
[0081] 如本文所述，本文所述的某些實施方案中，所述制劑可在用于將細胞在環境溫度 下基本干燥儲存的脫水制劑或組合物中包含至少一種=糖。=糖是由兩個糖巧鍵連接的= 個單糖組成的寡糖。糖巧鍵可在組分單糖上的任意徑基基團之間形成，且不同的鍵組合（區 域選擇性)和立體化學(a-或e-)產生S糖，該S糖為具有不同的化學和物理性質的非對映 異構體。可基于本公開內容并根據本領域的常規實踐來完成穩定儲存組合物中所包含的一 種或多種特定=糖的選擇，并且該選擇可受到包括其他制劑組分在內的多個因素的影響。 示例性的=糖包括但不限于麥芽=糖、異麥芽=糖、棉子糖、松=糖(melezitriose)、黑曲 霉=糖和酬糖。在用于細胞的基本干燥儲存的某些實施方案(包括表1中列出的制劑）中，該 S糖是松S糖并且優選濃度為約1 %-20 %，更優選約5.0-15 %，其中"約"可理解為表示量 的變化，該量的變化可W是比所述量高或低少于25%，更優選少于20%，且更優選少于 15%、10%、5% 或 1%。 4. 水溶性聚合物
[0082] 如本文所述，某些實施方案可在用于全血樣品中核酸和/或多膚分子的基本穩定 儲存的制劑和組合物中包含至少一種水溶性聚合物。運樣的水溶性聚合物包括聚乙締化咯 燒和聚乙締醇，并且可W理解，技術人員根據本公開內容可選擇用于基本干燥儲存的制劑 和組合物的其他水溶性聚合物，因為其可基于所采用的組合物的其他組分和被儲存的特定 細胞類型而變化。某些實施方案(包括但不限于在表1中所示的那些)預期包含濃度(基于體 積，即vol/vol)為約0.1-10% (vol/vol)，更優選約0. l-5%(vol/vol)，且更優選1.0% (vol/vol)的水溶性聚合物，其中"約"可理解為表示量的變化，該量的變化可W是比所述量 高或低少于50%，更優選少于40%，更優選少于30%，且更優選少于20%、15%、10%或5%。 在某些實施方案中，該水溶性聚合物為分子量范圍為約30-70，000道爾頓且約87-90 %水解 的聚乙締醇，其中"約"可理解為表示量的變化，該量的變化可W是比所述量高或低少于 50%，更優選少于40%，更優選少于30%，且更優選少于20%、15%、10%或5%。 5. 非還原糖
[0083] 同樣如本文所述，某些實施方案可在環境溫度下的預脫水和/或脫水制劑W及組 合物中包含至少一種非還原糖。非還原糖為缺少功能性醒基的糖分子。示例性的非還原糖 包括薦糖和海藻糖。在用于細胞的基本干燥儲存的實施方案中，該非還原糖為W約1.0-200mM，優選約50mM-200mM，且更優選約150mM的濃度存在的海藻糖，其中"約"可理解為表示 量的變化，該量的變化可W是比所述量高或低少于25%，更優選少于20%，且更優選少于 15%、10%、5% 或 1%。 6. 聚酸
[0084] 根據某些實施方案，聚酸可包含在本文所述的用于將功能性細胞在環境溫度下基 本穩定儲存的脫水制劑中。聚酸通常是指在其主鏈中含有多于一個酸官能團的聚合物。聚 酸是通過醇脫水形成的相對穩定的化合物。用于在所述制劑、組合物和方法中使用的示例 性的聚酸包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇和聚苯酸。在某些實施方案中，聚酸的分子量為 約5,000到15,000道爾頓。 7.四氨喀晚
[0085] 在某些實施方案中，所述干燥儲存穩定劑是四氨喀晚。示例性的四氨喀晚為5-徑 基四氨喀晚巧-hydro巧ectoine)。在某些脫水制劑和組合物中，使用約IOmM到約200mM濃度 的5-徑基四氨喀晚。 制劑試劑 1. pH緩沖液
[0086] 根據某些實施方案，本文所述的、用于將功能性細胞在環境溫度下基本干燥儲存 的脫水制劑和組合物可包含一種或多種抑緩沖液，該pH緩沖液可W是由于其抵抗溶液(如 pH緩沖液存在于其中的水溶液)的pH變化的能力而被本領域所知的大量化合物中的任意化 合物。可基于本公開內容并根據本領域中的常規實踐來完成包含在穩定儲存組合物中的一 種或多種特定抑緩沖液的選擇，并且該選擇可受到多種因素的影響，該因素包括期望維持 的pH、生物樣品的性質、將要采用的溶劑條件、將要使用的制劑的其他組分W及其他標準。 例如，通常使用在質子解離常數(pKa)為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或 1.0抑單位內的抑下的抑緩沖液，質子解離常數是緩沖液的特征。
[0087] pH緩沖液的非限制性實例包括巧樣酸、酒石酸、蘋果酸、橫基水楊酸、橫基間苯二 甲酸、草酸、棚酸鹽、CAPS(3-(環己基氨基)-1-丙橫酸）、CAPS0(3-(環己基氨基)-2-徑基-1-丙橫酸）、EPPS(4-(2-^基乙基)-1-贓嗦丙橫酸）、肥PES(4-(2-^基乙基）贓嗦-1-乙橫酸）、 MES(2-(N-嗎嘟基）乙橫酸）、M0PS(3-(N-嗎嘟基）丙橫酸）、M0PS0(3-嗎嘟基-2-徑基丙橫 酸）、PIPES(1，4-贓嗦二乙橫酸）、TAPS(N-[S(^基甲基）甲基]-3-氨基丙橫酸）、TAPS0(2-徑基-3-[^(徑基甲基）甲基氨基]-1-丙橫酸）、TES(N-[S(^基甲基）甲基]-2-氨基乙橫 酸）、bicine(N，N-雙（2-徑基乙基)甘氨酸）、化icine(N-[S(^基甲基）甲基]甘氨酸）、S (^巧圣基甲基）氨基甲燒）和雙-S(2-[雙（2-徑基乙基）氨基]-2-巧圣基甲基）-1,3-丙二 醇）。本文中設及的某些實施方案(包括表X中列出的那些中的多個)可W WpH為約4.0、4.1、 4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、 8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的制劑為特征，其中"約"可理解為表示 量的變化，該量的變化可W是比所述抑值高或低少于1，優選少于0.5,優選少于0.25,且更 優選少于0.1個抑單位。 2. 馨合劑
[008引根據某些實施方案，馨合劑(化elating agent)或馨合劑(化elator)可包含在本 文所述的、用于血液樣品中的完整活細胞的基本穩定儲存的組合物中，并且由于其與金屬 陽離子復合并阻礙金屬陽離子的反應性的能力而被熟悉本領域的技術人員所知。示例性的 馨合劑包括二乙締 S胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸化DTA)、乙二醇四乙酸化GTA)、反式- 1,2-二氨基環己燒-N，N，N'，N'-四乙酸(CDTA)、l，2-雙（2-氨基苯氧基）乙燒-N，N，N'，N'-四 乙酸(BAPTA)、l，4,7，10-四氮雜環十二燒-l，4,7，10-四乙酸(D0TA)、N-(2-?基乙基）乙二 胺-N，N'，N'-S乙酸、葡萄糖酸鋼和次氮基S乙酸(NTA)。一種馨合劑是葡萄糖酸鋼并且W 約1.0-50mM，更優選約10-40mM，且更優選約25mM的濃度存在，其中"約"可理解為表示量的 變化，該量的變化可W是比所述量高或低少于25%，更優選少于20%，且更優選少于15%、 10%、5% 或 1%。 表1 用于將功能性細胞在環境溫度下基本干燥儲存的示例性脫水制劑













脫水過程
[0089] 本發明的MCS脫水制劑能夠在存在或不存在采用預脫水制劑的先前處理的情況 下，在脫水過程中維持細胞膜和細胞器的完整性W及細胞的總體形態，W使得細胞在基本 干燥儲存后再水化時，細胞保持至少一種如脫水之前的細胞的功能性質，例如，細胞活力。
[0090] 例如，可通過簡單的目測來確定脫水細胞的干燥，W確保所有水分均已蒸發或去 除。在一些實施方案中，可優選地包括水分指示物，W確定已經實現的干燥程度。將細胞基 本干燥的時間可根據MCS脫水制劑中存在的試劑而變化。根據制劑組分和細胞所固定的器 皿的幾何形狀，細胞最適宜在約一到S小時的時間段內脫水。細胞在約32°C-39°C的溫度范 圍內，優選在約37°C下脫水，并可在培養箱中或在采用控制溫度、氧氣水平和相對濕度的環 境室的更加受控的條件下脫水。通過調節相對濕度可調節脫水的速率。例如，在包含水溶性 聚合物(例如，PVA)的MCS制劑中脫水的細胞將花費更長的時間來脫水，所W可降低相對濕 度W有利于優化脫水時間。另外，多種干細胞的基本干燥儲存在5 %的氧氣濃度下進行，W 確保細胞維持在基本在免疫學上未分化的狀態。
[0091] 可采用在細胞上方保持活躍的空氣流動同時控制溫度和濕度的其他脫水方法。
[0092] 可采用可氣密密封的罩或袋來儲存基本干燥的細胞，W使得內容物可被密封W在 與用于細胞脫水的條件相似的氣候條件下儲存。基本干燥儲存的細胞最適宜在恒溫如室溫 下儲存。 調亡抑制劑
[0093] 在某些實施方案中，本文所述的預脫水制劑、脫水制劑和/或再水化制劑包含至少 一種調亡抑制劑。在某些實施方案中，該至少一種調亡抑制劑阻斷細胞調亡的誘導。在其他 實施方案中，該調亡抑制劑阻斷ER應激通路中的至少一個步驟，且優選為可逆抑制劑。
[0094] 在某些實施方案中，所述脫水制劑包含至少一種調亡抑制劑。在其他實施方案中， 所述預脫水制劑或再水化制劑包含至少一種調亡抑制劑，并且在其他實施方案中，所述預 脫水制劑和再水化制劑各自包含至少一種調亡抑制劑。在