獲得高產穩定表達重組抗體的骨髓瘤細胞株的方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得適用于灌流發酵生產工藝的高產穩定表達細胞株的方法。本發明的方法由五個階段組成：高產穩定表達細胞株的獲得、工業規模細胞株生產力的評價、純化的單克隆抗體的特性分析、不同工業規模的產品特性評價、不同發酵時期的產品特性評價。這種方法的細胞株是從重組NS0骨髓瘤細胞系中獲得的，該重組NS0骨髓瘤細胞系用于生產治療癌癥的抗EGFR單克隆抗體。這種方法獲得的細胞株在不同的發酵規模、不同發酵運行時間的條件下保持了本身的生長特性、高表達特性和表達產物特征的一致性，適用于不同的工業規模下商業化生產治療性抗體。本發明的方法克服了哺乳動物細胞系在灌流發酵工藝中產量降低的問題。
【專利說明】獲得高產穩定表達重組抗體的骨髓瘤細胞株的方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種獲得高產穩定表達細胞株的方法，該方 法獲得的細胞株在灌流發酵工藝中具有優越生產性能，可在不同的工業規模中生產治療性 抗體。

【背景技術】
[0002] 目前治療性抗體藥物是生物制藥的一個重要類別，一些治療性抗體已經被批準 注冊用于治療癌癥、自身免疫性疾病和其他慢性疾病，幾十種重組抗體正處于臨床開發的 不同階段（Reichert JM, MAbs 2012，May-June, 4(3) :413_5; Reichert JM, Dhimolea E, Drug Discovery Today 2012, Sept, 17(17-18): 954-63; Biologic Medicines in Development, Phrma Report 2013, www.phrma.com)。通常患者每次劑量需要數百毫克的 治療性抗體，因此目前的產能需求巨大。
[0003] 重組治療性抗體是一種復雜的糖蛋白，不得不通過哺乳動物細胞培養生 產（Wurm FM. Nat Biotechnology 2004， 22:1393-1398; Barnes L， Dickson A， CurrOpinBiotechnol 2006，17:381-386)。對生物制藥行業來說哺乳動物細胞的大 規模培養遭遇了諸多挑戰，雖然重組抗體在理化特性方面已經取得了巨大的進步， 但是治療性抗體分子的特性由工藝過程決定的觀念仍然被普遍接受。生產工藝的 任何變化，例如發酵規模、細胞培養基、細胞傳代次數等，都可能會影響產品的性能 (Demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), Center for Drug Evaluation and Research (CDER) April 1996. www. fda.gov ; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003) www. emea. europa. eu ; ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adopted by CMPM, December 1, 2004, CPMP/ICH/5721/03, date for coming into operation: June 2005; MHLff: Adopted 26 April 2005, PFSB/ELD Notification No. 0426001; FDA: Published in the Federal Register, Vol. 70, No. 125，June 30，2005; 37861-2. www.ich.org)。
[0004] 哺乳動物細胞大規模培養生產治療性抗體必須在無血清培養基中進行。無蛋白培 養基已經用于生物制品的生產，例如生產重組抗體的NS0細胞株已成功地在無蛋白培養基 PFHMII中生長（W0 2004/038010 A1)。然而，適應無血清培養基和在無血清培養基中長時 間發酵通常伴隨著細胞系生產力的損失（Barnes L, et al·，Biotechnol Bioeng 2004， 81: 631-639)。灌流發酵生產工藝具有高密度培養及獲得高濃度抗體收獲液的潛能，然而 這種長時間的高密度細胞培養需要穩定的高表達細胞株來真正地優化抗體的生產。
[0005] 專利ZL95118826. 7描述了一種獲得針對表皮生長因子受體（EGFR)的嵌合抗體和 人源化抗體的方法，及其在診斷和治療由這些受體表達的腫瘤疾病中的應用。在本發明中， 我們在專利ZL95118826. 7中小鼠骨髓瘤NSO細胞的轉染克隆基礎上，建立了一種獲得適用 于灌流發酵生產工藝的穩定高表達細胞株的方法。這種方法得到的細胞株是從重組NSO骨 髓瘤細胞系中獲得的，該重組NSO骨髓瘤細胞系用于生產治療癌癥的抗EGFR單克隆抗體。 這種穩定的高表達細胞株在不同的工業規模、不同發酵時間的條件下保持了本身的生長性 能、高表達特性和表達產物特征的一致性，適用于不同工業規模下化生產治療性抗體。


【發明內容】

[0006] 本發明的生產過程彌補了灌流發酵工藝中哺乳動物細胞系產量降低的缺陷。本發 明的方法由以下五個階段組成： 1、 穩定高表達細胞株的重新篩選； 2、 工業規模細胞株生產力的評價； 3、 純化的單克隆抗體的特性分析； 4、 不同工業規模的產品特性評價； 5、 不同發酵時期的產物產品特性評價。
[0007] 第一步是采用有限稀釋方法獲得細胞克隆后（Freshney，R. Ian (2010). Culture of animal cells: (6th ed. ). Hoboken, N. J. : ffiley-Blackwell. pp. 208 - 211. ISBN 9780470528129 ; Davis, edited by John M (2011). Oxford: Wiley-Blackwell. pp. 239 - 240. ISBN 978047066658-6)，采用抗人 IgG 抗體偶聯 FITC 進行細胞內免疫球蛋白的染色并經流式細胞術檢測（Pluschke et al.，BMC Proceedings 2011，5 (Suppl 8) :P97)，分別在連續細胞培養10天和90天后測定每個克隆的平均熒 光強度（MFI)和陽性細胞百分比。在轉瓶中利用動力學試驗進行進一步特性分析，條件為 100rpm，37° C，5% 0)2細胞培養。細胞克隆顯示出均一的表達抗體的細胞群，平均熒光強 度高于1〇3,目標產品比生產速率值（QP)高于3Χ1(Τ μ g/cell/h，選擇較好性能的細胞克 隆在工業生產中進行了生產率評價。
[0008] 在1000L和2500L發酵罐中，采用預先選好的細胞克隆進行發酵生產。灌流發酵 工藝中采用90%以上活力的細胞接種。運行參數為37°C，5% C02，恒定的氧分壓和葡萄糖 濃度，細胞灌流濃度保持在（10-20) X 106cell/mL，灌流速率升高到0. 8WD，細胞培養90天 后終止灌流工藝。發酵運行過程中監測存活細胞數和抗體濃度。目標抗體濃度為200 μ g/ ml以上。
[0009] 發酵的下游工藝是通過基于兩個主要分離色譜步驟的標準純化步驟來進行的：蛋 白A親和層析與離子交換色譜。抗體純化工藝的目標平均產量大約為200 mg/L -300mg/L， 純度大于95%。
[0010] 采用的參考品來自于純化的抗體，經如下的分析技術進行進一步的特性分析：

【權利要求】
1. 一種獲得高產穩定表達重組抗體的骨髓瘤細胞的方法，所述方法用于工業規模中生 產治療抗體，其特征在于，所述的方法包括五個階段： (1) 1?廣穩定表達細胞株的獲得； (2) 工業規模上細胞克隆產量的評價； (3) 純化的單克隆抗體的特性分析； (4) 不同工業規模上產品特性的評價； (5) 不同發酵時間的產物產品特性的評價。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（1)中包括以下步驟： (1) 選擇細胞內免疫球蛋白染色呈現單峰的細胞克隆，且平均熒光強度大于1〇3 ; (2) 轉瓶內進一步動力學研究，選擇比生產率高于3X 1(Γ7μ g /cell/h細胞克隆。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（2)包括以下步驟： (1) 在1000L工業規模灌流發酵運行90天，通過測量90 %以上活力的活細胞濃度和最 大值高于200 μ g /ml時免疫球蛋白濃度評價所選克隆的生產能力； (2) 在2500L工業規模灌流發酵運行90天，通過測量90%以上活力的活細胞濃度和最 大值高于200 μ g /ml時免疫球蛋白濃度評價所選克隆的生產能力。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（3)包括以下步驟： (1) 采用蛋白A-親和層析和離子交換層析從發酵收獲液中純化抗體，所述抗體的平均 產量為200 mg/L - 300mg/L，純度大于95% ; (2) 使用下列分析技術對參考品進行特性分析：質譜法測定氨基酸序列及翻譯后修飾， 質譜法檢測分子量，高壓液相法分析肽圖圖譜及糖基化組成，弱陽離子交換色譜法測定電 荷異質性，表面等離子體共振法測定親和性，分析超速離心法分析沉降系數及分子量。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（4)包括以下步驟： (1) 評價1000L和2500L發酵規模的產品樣品的肽圖圖譜、電荷異質性和糖基化修飾； (2) 與參考品進行可比性分析，顯示無顯著差異。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述階段（5)包括以下步驟： (1) 隨著發酵的運行，評價不同細胞培養時期產物的分子量質譜數據、肽圖譜、弱陽離 子交換色譜法測定的電荷異質性、糖基化組成、分析超速離心法分析的沉降系數和分子量、 表面等離子體共振法測定的親和性； (2) 與參考品進行可比性分析，顯示無顯著差異。
7. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，所述的骨髓瘤細胞系為NS0細胞系。
8. 根據權利要求7所述的方法，所述NS0細胞系生產抗EGFR hR3抗體。
9. 根據權利要求8所述的方法，選擇使用NSO細胞系中穩定高表達的細胞克隆，命名 為2025/M031212,所述細胞克隆2025/M031212可制備以治療為目的的人源化單克隆抗體 hR3。
10. -種人源化單克隆抗體hR3的制備方法，所述方法包括使用權利要求9所述的細胞 克隆2025/M031212在不同工業規模進行灌流發酵工藝。
11. 一種包含人源化單克隆抗體hR3的藥物活性成分，所述藥物活性成分利用權利要 求10所述的方法制備。
【文檔編號】C12R1/91GK104152415SQ201410395389
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】路明, 喻志愛, 何偉, 蔡楊柳, 米蓋爾, 林峰, 美林, 胡里奧, 羅蘭多 申請人:百泰生物藥業有限公司, 分子免疫中心