一種穩定表達hpv16 e5蛋白細胞株的構建方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種穩定表達HPV16E5蛋白細胞株的構建方 法及應用。
【背景技術】
[0002] 慢病毒(Lentivirus)載體是以I型人類免疫缺陷病毒為基礎發展起來的基因治療 載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體 上，從而達到持久性表達。慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息， 需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝。包裝好的病毒 顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，產生高滴度的病毒顆粒，可以直接用于 宿主細胞的感染。目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平 的表達目的基因。在細胞相關的實驗操作中，對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染 的細胞，通過慢病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率，以達到目的基因的高效表 達。
[0003] 人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一類能引起皮膚和黏膜鱗狀上皮 增殖的DNA腫瘤病毒。高危型HPV16的感染與宮頸癌、食管癌、喉癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種惡 性腫瘤的發生發展密切相關。HPVE5癌基因是導致和維持腫瘤發生發展的關鍵基因之一， 其編碼的HPVE5癌蛋白是一種具有高度疏水性的膜結合蛋白，主要定位于細胞膜、內質網、 高爾基體等結構上。在HPV感染相關腫瘤形成的早期階段，細胞中含有豐富的E5 0RF及E5蛋 白，而在晚期腫瘤細胞中，E5蛋白的表達常因HPV基因組整合而缺失。由于E5蛋白具有高度 疏水性及較弱的抗原性，并且目前沒有相應的抗體，因此，對該蛋白的研究受到了阻礙。基 于HPVE5蛋白的特點，若能構建一種帶有標簽的穩定表達HPV16E5蛋白的細胞株，就能為 E5蛋白生物學特性及功能的研究提供一個良好的工具。也望成為HPV相關腫瘤治療的一個 理想細胞模型。

【發明內容】

[0004]本發明目的是利用重組慢病毒系統制備一種帶有標簽蛋白并能高效表達HPV16 E5蛋白的細胞株，該細胞株為研究HPV16E5蛋白的生物學功能提供平臺，并可作為HPVE5 蛋白研究中的陽性對照細胞株。
[0005] 該細胞株的建立方法包括構建pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重組慢病毒表達載體的步 驟，重組慢病毒包裝、收獲、轉染Balb/c3T3細胞的步驟，經嘌呤霉素(puromycin)篩選以及 RT-PCRwesternblot鑒定的步驟，最終獲得穩定表達HPV16E5蛋白細胞株。所獲得的細胞 株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 11794。
[0006]本發明以重組慢病毒為載體，將其感染Balb/c3T3小鼠胚胎細胞，篩選獲得能高效 表達HPV16E5蛋白的細胞株，此細胞株帶有的His標簽方便用于HPV16E5蛋白表達的檢測。
[0007] 在此發明所述的構建pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重組質粒的步驟中，首先根據HPV16 E5基因設計引物，通過PCR反應擴增帶有His標簽的HPV16E5基因，在pLVX-Puro載體的EcoRl和BamH1多克隆位點處插入HPV16E5-His基因。在制備重組慢病毒步驟中，利用構建 好的pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重組質粒與病毒包裝質粒共轉染293T細胞，經培養、出毒、收 取病毒上清、過濾后收獲重組慢病毒液。取包裝好的重組慢病毒感染Balb/c3T3細胞，用含 有嘌呤霉素的培養基篩選，經RT-PCR、westernblot鑒定，最終獲得穩定表達HPV16E5蛋白 的Balb/c3T3細胞株，同時構建空載慢病毒并轉染Balb/c3T3細胞作為對照。將構建好的細 胞株凍存于_150°C冰箱中保藏。
[0008] 此發明建立了能穩定高效表達HPV16E5蛋白的細胞株，該細胞株為進一步深入研 究HPV16E5蛋白的生物學特性及致細胞惡性轉化的作用奠定了堅實基礎。
【附圖說明】
[0009] 圖 1pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重組質粒酶切鑒定圖，其中 1 為pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重組質粒，2為pLVX-Puro空質粒作為對照
[0010] 圖2pLVX-Pur〇-HPV16E5-His重組質粒測序圖
[0011]圖3穩定表達株的RT-PCR鑒定，其中1為Balb/c-HPV16 E5細胞株，2為作為對照的Balb/c-Lenti細胞株
[0012] 圖4穩定表達株的Western blot鑒定具體實施方案
[0013] (一)重組載體的構建
[0014] (1)HPV16E5基因擴增
[0015] 根據HPV16全基因組序列（GenBankNC_001526)，設計帶有His標簽、EcoRl和Bam Η1雙酶切位點及保護堿基的ΗPV1 6E5特異引物，引物序列為：5 ' -CCG GAATTCGCCACCATGACAAATCTTGATACTGCATCC-3'（SEQIDΝ0·1)和5'-CGCGGATCCTTAA TGATGATGATGATGATGTGTAATTAAAAAGCGTGCATGT-3'（SEQIDN0.2KPCR反應體系為：
[0018] (2)DNA瓊脂糖凝膠電泳
[0019] 配置1.5%的瓊脂糖，微波爐加熱使瓊脂糖顆粒完全溶解;將洗凈、干燥的制膠板 水平放置在工作臺上;混勻，灌膠，插入梳子，避免產生氣泡;待凝膠凝固后，小心拔去梳子； 將膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液;將PCR產物上樣，經110V電泳30min。
[0020] (3)PCR產物凝膠回收（QIAquickGelExtraction Kit)
[0021 ] 切下HPV16E5-His基因條帶的凝膠，加入3倍體積QGBuffer溶解凝膠；于50°C孵 育lOmin，搖晃混勻，直至膠完全溶解;加入1倍體積異丙醇沉淀DNA，翻轉混勻，靜止5min;吸 取混合物至Silica柱上，13000rpm離心lmin，棄去濾液；加入500μ1PBBuffer使DNA結合于 Silica柱，13000rpm離心lmin，棄去濾液；加入750μ1PEBuffer，13000rpm離心lmin，棄下 管濾液，13000rpm離心2min;換新離心管，加入10μ1已50°C預熱的EBBuffer至Silica柱上， 13000rpm離心3min，洗脫得到DNA。
[0022] (4)HPV16 E5_His和pLVX-Puro載體雙酶切
[0023] 將HPV16E5-His凝膠回收產物與pLVX-Puro載體(購于Clontech公司）分別進行BamH1和EcoR1雙酶切。酶切體系于37°C水浴過夜，電泳，將正確的目的條帶進行凝膠回 收。酶切體系如下：
[0026] (5)HPV16 E5基因與pLVX-Puro載體連接
[0027]將凝膠回收后的酶切產物HPV16E5-His基因與pLVX-Puro載體在16°C連接4KT4酶 連接體系如下：
[0029] 對構建好的重組質粒進行雙酶切鑒定(見圖1)。
[0030] (6)質粒轉化感受態大腸桿菌Stbl3
[0031] 取出E.coliCompetentCellsstbl3(購自廣州復能