專利名稱：肥大細胞穩定劑治療肥胖癥的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療和預防肥胖癥的組合物和方法。發明的背景肥胖癥是非常常見和有害的代謝性疾病，嚴重威脅美國以致全世界的公共衛生健 康。自二十世紀八十年代中期這種疾病的流行開始顯著上升。在美國，50%的成年人超重 并且30%肥胖。更為嚴重的是，兒童的肥胖癥的流行和相關的糖尿病也快速增加。尤其是 在衛生保健資源的費用和利用方面，肥胖癥對個人、家庭、社會的影響是很嚴重的。因此，控 制體重不僅僅是科學課題，而是不斷發展的社會所關切的問題。肥大細胞(MCs)通過釋放細胞質顆粒(其成分通過被IgE或補體因子致敏而促進 過敏性炎癥)幫助誘導過敏反應(Schwartz, et al.，Prog. Allergy 34 :271_321 (1984)； Mekori, et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 104 517-523 (1999)) 最近生物化學和組 織學觀察結果提示MCs可能參與血液來源的白細胞聚集(Mekori，et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 104 :517-523 (1999))，平滑肌細胞(SMC)/ 內皮細胞(EC)增生(Toda, N.，Circ. Res. 61 280-286 (1987) ；Inoue, et al.，Am. J. Pathol. 149 2037-2054 (1996)； Mueller, et al., Circ. Res.77 54-63 (1995)), _ t (Latti, et al. , J.Cell. Physiol. 195 130-138 (2003) ；Leskinen, et al. , Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 23 238-2343(2003) ；Leskinen, et al. , Biochem. Pharmacol. 66 :1493_1498 (2003))，T 淋巴細 胞遷移和活化(Mekori, et al.，J. Allergy Clin. Immunol. 104 :517_23 (1999))，血管發生 (Zudaire et al.，Am. J. Pathol. 168 :280_291 (2006))，和基質重塑(Daugherty, et al.， Curr. Atheroscler. Rep. 4 -.222-221 (2002))。迄今為止，肥大細胞對肥胖癥的作用尚不明 確。現在，肥大細胞缺陷型小鼠的發現(Duttlinger，etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3754-3758(1995) ；ffolters, et al. ,Clin. Exp Allergy 35:82-88(2005))和肥胖 癥模型(基因和飲食引起的肥胖癥小鼠)的獲得使我們可以評價肥大細胞在肥胖癥及其并 發癥中的作用。此外，重要的的肥大細胞介質或白色脂肪組織(WAT)趨化因子受體的基因 敲除小鼠的獲得使我們可以鑒定肥大細胞中對肥胖癥重要的介質和WAT中肥大細胞歸巢 所需要的趨化因子。發明概述本發明以實驗研究結果為基礎，結果提示肥大細胞在肥胖癥的發展中起重要作用，可能是由于促炎細胞因子和其他介質的產生和釋放。缺乏肥大細胞的小鼠在給予西方膳食后，與正常對應體相比，體重增加顯著較少。然而，如果給予正常小鼠肥大細胞穩定劑， 也顯著避免了體重增加。第一方面，本發明涉及通過給予有效量的使肥大細胞穩定的藥物來治療或預防 動物或人中的肥胖癥的一種方法。術語“有效量”是指藥物達到治療目的的充足的量。在 本發明中，這是指當作為用于肥胖癥的療法時，必需給予以促進體重減輕的肥大細胞穩定 劑的足夠的量，或者當被給予以預防肥胖癥發展時，必需給予以預防體重增加的肥大細胞 穩定劑的足夠的量。如果經鼻給藥，通常劑量為5-100mg/天，口服劑量會高一些，通常為 50-1500mg/天。出于本發明的目的，如果人或動物超過理想體重20%、體重指數(BMI)在 30或更高和/或身體脂肪超過30%的，則被視為肥胖。在上述方法中給予的肥大細胞穩定性藥物，優選在24小時期間分為兩次或者更 多次平均給予。首選的藥物是色甘酸、奈多羅米、酮替芬和洛度沙胺。這些藥物可以任何藥 物學可接受的形式，包括藥物學可接受的鹽類如鈉鹽、二鈉鹽、鉀鹽或鋰鹽。應該理解為，除 非另外說明，涉及這些藥物的一種就包括所有藥物學可接受的形式。一些優選的形式為 奈多羅米鈉(尤其是經鼻5-50mg/天或口服50-500mg/天)；富馬酸酮替芬(尤其是口服 l-200mg/天)和洛度沙胺氨丁三醇(尤其是口服l-200mg/天)。最優選的藥物是色甘酸 鈉或二鈉，以200-1，OOOmg/天的劑量口服給藥。在此提及的所有劑量是就人的藥物給予而 言的。如果將所述藥物給予動物，可以人的劑量為參考再根據體重差異調整。例如，體重約 為501bs的動物應接受人劑量的三分之一。上述方法可用于促進肥胖個體的體重下降或者預防個體的體重增加，尤其是由于 遺傳或環境因素而容易增加體重的個體。當給予人或動物治療肥胖癥時，需要持續每天給 藥直到個體體重下降至少原來體重的10%，優選15或20%。在特別優選的實施方式中，給 予肥胖個體色甘酸，特別是色甘酸鈉或二鈉，在此期間，以約200-1，OOOmg/天的劑量給予。 被治療的患者在治療期間可有除肥胖癥以外的其他癥狀，或者它們可以沒有癥狀，如過敏， 心血管疾病或糖尿病。另一方面，本發明涉及具有肥大細胞穩定劑和將該穩定劑給予患者以預防和治療 肥胖癥的說明書的治療組合物。所述穩定劑應該是單位劑型的藥物組合物的一部分，并被 包裝在成品藥物容器中。單位劑型是指單個藥物給予實體如片劑，膠囊或溶液量。成品藥 物容器中是指任何個用于藥物包裝的不同類型，如瓶、小玻璃瓶、泡罩包裝等。出于本發明 的目的，成品藥物容器中包括設計用于經鼻給藥的包裝，即，瓶或小玻璃瓶，其包含或可用 于遞送鼻腔噴霧的溶液或者粉末。類似地，單位劑型包括藥物在其中以提供治療效果的濃 度溶解的溶液，當以固定的量經鼻或口服給予患者時。包含在治療組合物中的最優選的肥大細胞穩定劑是色甘酸、奈多羅米、酮替芬和 洛度沙胺。當這些藥物以片劑或膠囊形式口服給予時，單位劑量通常為5-l，000mg，并且更 通常用地為10_500mg。以口服溶液給予的單位劑量是等量的。如果經鼻給藥，溶液應該通 常包含充足的藥物濃度，以便患者每噴一下可以接受0. l-10mg。形成治療組合物的一部分的說明書可以出現在包含肥大細胞穩定劑的包裝上，在 成品藥物容器上或作為單獨的包裝說明書。所述說明書包括應給與患者的肥大細胞穩定劑 的劑量，例如用于治療或預防肥胖癥。主治的患者典型地是肥胖患者，以前肥胖，有肥胖癥家族史，或者是會由于體重增長帶來嚴重的健康風險的患者，如罹患心血管疾病的患者。本發明也包括通過檢測化合物穩定肥大細胞的能力來確定具體的化合物是否對肥胖癥的治療或預防有用。活性有抑制作用本領域公知的任何一種穩定作用檢測方法，特 別是那些已開發的用以篩選在過敏性治療中無用的藥物的，均可用于該目的。發明詳述本發明基于以下表明肥大細胞穩定劑可以用來控制肥胖癥的實施例部分總結的 實驗。這些藥物可以用于幫助肥胖癥患者減輕體重或者預防人們變胖。A.肥大細胞穩定劑穩定肥大細胞的藥物在治療過敏方面已經被廣泛研究，并且這些藥物的數種已經 是商購可得的。最優選的肥大細胞穩定劑是色甘酸、奈多羅米、酮替芬和洛度沙胺，并且可 以購得，或者可以使用本領域已知的方法合成。此外，本領域中描述的其他任何藥物學可 接受的肥大細胞抑制劑也可用于本發明。這些包括在以下的美國專利中公開的化合物 6，207，684 ；4，634，699 ；6，207，684 ；4，871，865 ；4，923，892 ；6，225，327 和 7，060，827。在每 一項美國專利中提供了制備所述化合物的方法，伴隨如何純化的所述化合物以及其以何種 方式使用的信息。這些化合物可以任何任何何藥物學可接受的形式給與患者，包括任何任 何何藥物學可接受的鹽類，最優選的藥物是色甘酸鈉或色甘酸二鈉。B.制備制藥組合物肥大細胞穩定性藥物可以依據本領域的標準方法摻入藥物組合物中(參見例如 ReminRton' s Pharmaceutical Sciences, MackPublishinR Co., (1990))。配制齊阿以設 計為通過本領域常規使用的任何任何途徑遞送，優選制劑設計為口服或經鼻遞送。對于口 服組合物，例如片劑或膠囊，肥大細胞穩定性藥物應典型地以1和500mg的劑量提供。對 于經鼻遞送的組合物，穩定劑應典型地以0. 5mg/ml-50mg/ml的劑量提供并更優選以Img/ ml-20mg/ml。類似的濃度范圍可以用于口服溶液。盡管不是優選的，但是其他的給藥途徑 也可以采用。肥大細胞穩定劑可以與任何藥物制劑中常規使用的任何賦形劑和輔料結合使用， 包括水，鹽溶液，醇類，阿拉伯樹膠，植物油，苯并醇(benzo-alcohol)，聚乙二醇，明膠，碳水 化合物如乳糖、淀粉酶(amylase)或淀粉，硬脂酸鎂，滑石粉，水楊酸，石蠟，脂肪酸酯，聚合 物等。藥物制劑可以被滅菌，如果需要的話，與以下佐劑混合如分散劑，潤滑劑，防腐劑，穩 定劑，潤濕劑，乳化劑，影響滲透壓的鹽類，緩沖劑，著色劑，調味劑和/或芳香物質。溶液，尤其是注射用溶液，可以用水或生理上相容的有機溶劑如乙醇，1，2_丙二 醇，聚乙二醇，二甲基亞砜，脂肪醇類，甘油三酯類，甘油偏酯等制備。可以采用常規技術所 述制劑，并且可包括滅菌的等滲鹽水，水，1,3- 丁二醇，乙醇，1,2-丙二醇，聚乙二醇與水混 合，Ringer溶液等。C.劑型和給藥途徑本發明適合任何給藥途徑，包括口服，經口服，內服，直腸，經鼻，舌下，經皮，陰 道，靜脈內，動脈內，肌內，腹膜內，皮內和皮下途徑。可以采用的劑型包括片劑，膠囊，粉 齊 ，氣霧劑，栓劑，皮膚貼劑，非口服劑，緩釋制劑和口服液，包括混懸液溶液和乳液。最 優選的給藥途徑是口服和經鼻。如果需要的話，將組合物，尤其是用于注射的組合物可 以凍干并將凍干物給藥前重構。劑型可以包括肥大細胞穩定劑作為唯一的活性成分，或者可以同時包含其他的活性劑。所有劑型可以采用本領域常規方法并在參考文獻如 Remington' sPharmaceutical Sciences(Osol，A, ed.，Mack Publishing Co. (1990))中 教導的方法制備。D.治療方法在此描述的方法的治療目的是減輕患者體重或預防體重進一步增加。當用于預防 體重增加時，最佳劑量是基于動物研究的結果的，例如本文所述的那些，以及使用本領城眾 所周知的方法進行的臨床研究。穩定肥大細胞的藥物已經可獲得用于其他癥狀的治療，特 別是過敏反應，并且目前的劑量可以用作評價在預防和治療肥胖癥中有效劑量的起點。在 現有知識的基礎上，預計，使用口服遞送的方法，患者典型地接受口服劑量50和1500mg/天 的肥大細胞穩定劑，優選分為相等的兩劑。當經鼻給藥時，預計給予5和IOOmg/天量的穩 定劑，同樣將該量分為相等的幾劑。
E.關于糖尿病的注釋盡管在此描述的實驗主要針對肥胖癥，某些方面提示同樣的方法也可以用來治療 或預防1型糖尿病。治療糖尿病的治療目的是減輕或消除胰島素依賴。優選的藥物和劑量 與用于肥胖癥的相同。F.治療組合物的包裝正如之前描述的，包含肥大細胞穩定劑的藥物組合物應置于成品藥物容器中，并 與針對醫生的關于該組合物的使用說明書一同銷售。在經鼻遞送的制劑的情況下，藥物組 合物典型地為溶液或粉末，其包裝在設計為將組合物作為噴霧遞送的裝置中。本領域已知 的任何以此方式遞送藥物的裝置均適用于本發明。取決于意欲的遞送途徑，其他容器可以 包括瓶，小玻璃瓶，安瓿瓶，泡罩包裝等等。關于藥物組合物的使用的說明書可以與藥物組合物一起包含在容器上或作為包 裝說明書。可替代地，說明書也可以包含其中銷售有藥物組合物的盒子或其他包裝上。在 所有情況下，說明書都應該標明給予藥物組合物以用來促進體重減輕或預防體重增加的目 的。活性成分的描述也與關于劑量和如何給予藥物組合物的信息一起包括在內。G.檢測方法本發明也包括基于化合物使肥大細胞穩定的能力來評價其在治療和預防肥胖癥 中的潛在用途的方法。這些檢測方法是本領域眾所周知的并且曾經用于在治療過敏性反應 中有用的藥劑的鑒別。可以使用的一個適合的檢測方法的實例在美國6，225，327中描述。簡言之，肥大 細胞(約5，000/測定管)在37°C與試驗化合物孵育約15分鐘，然后暴露于抗人IgE(約 10yg/ml)中。再孵育15分鐘后，通過離心終止反應。然后收集上清液，并分析組胺含量， 例如通過放射免疫法。然后將該樣品(試驗樣品)中存在的組胺量與通過在不存在試驗化 合物的情況下孵育肥大細胞和抗人IgE而獲得的對照制劑中的量進行比較。與對照相比， 試驗樣品中組胺含量的減少是試驗化合物起穩定肥大細胞的作用的指示。穩定劑的效力可 以通過達到給定抑制水平所需的濃度來反應，例如，組胺釋放減少50%。
實施例本研究證實肥大細胞對飲食引起的肥胖癥和糖尿病起重要作用。來自肥胖的人和小鼠的白脂肪組織(WAT)比來自他們的瘦對應體的WAT包含較多的肥大細胞。小鼠中遺傳 決定的肥大細胞缺陷和肥大細胞的藥物穩定減少了體重增加和血清和/或WAT中炎性細胞 因子、趨化因子和蛋白酶的水平，并且與改善的葡萄糖內穩態和能量消耗相呼應。機制研究 揭示肥大細胞提高WAT和肌肉的血管發生和相關的脂肪生成有關的組織蛋白酶活性。與減 少體重增加和改善葡萄糖耐量一致，肥大細胞缺陷和穩定提高肌肉和WAT中抗脂肪生成的 基質纖維連接蛋白、葡萄糖運載體Glut4和胰島素受體的水平。細胞因子缺陷型肥大細胞 的使用確立了這些細胞體外誘導小鼠脂肪細胞的脂質沉積和組織蛋白酶的表達，并且體內 通過產生IL6和IFN-γ促進飲食引起的肥胖癥和葡萄糖代謝。臨床使用肥大細胞穩定劑 減輕了小鼠肥胖癥和糖尿病，提示對這些常見人類代謝性疾病的新療法。I.方法小鼠野生型(C57BL/6)、116+型(C57BL/6, Nil)和 Ifng+ 型(C57BL/6, N10)小鼠 購自Jackson實驗室(Bar Harbor, ME)。同基因型的Tnf+型(C56BL/6, N10)和肥大細 胞缺陷型Kitw_slVw_sh(C57BL/6，N> 10)小鼠通過與C57BL/6背景如所述地回交(Sim，et al.Nat. Med. 13 :719-724(2007) ；ffolters,et al. ,Clin Exp Allergy 35 :82_88 (2005))而 產生。哈佛大學醫學院常務委員會批準了所有動物研究草案，所有小鼠都飼養在無病原體 的設施內。為誘導肥胖癥，給6周齡小鼠(雌性和雄性)飼以西方膳食(Research Diet, New Brunswick，NJ) 12-20周。每周監測小鼠體重。直至西方膳食的消耗的各個過程結束 為止，如先前所報道地進行葡萄糖耐量和能量消耗檢測(Yang，etal.，Nat. Cell Biol. 9 970-977(2007))。采集小鼠血樣用于血清脂肪因子測量。獨立采集皮下脂肪、內臟脂肪和 棕脂肪以及骨骼肌用于蛋白提取和石蠟切片的制備。組織蛋白提取物用于進行酶聯免疫吸 附試驗(ELISA)、免疫印跡分析和半胱氨酸組織蛋白酶活性中心標記。對于免疫印跡分析， 30 μ g蛋白在8% SDS-PAGE上分離以檢測220kDa的纖維連接蛋白(小鼠單克隆，1 100， NeoMarkers, Fremont, CA)和 200kDa 的胰島素受體(小鼠單克隆，1 100，Calbiochem, SanDiego，CA)，或者在12% SDS-PAGE上分離以測定Glut4(小鼠單克隆，1 200，R&D Systems, Minneapolis, MN)、解偶聯蛋白 UCPl(兔多克隆，1 3000，Abeam, Cambridge, ΜΑ)、肌動蛋白(小鼠單克隆，1 500，Abeam)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH，兔多克隆， 1 1000，Santa Cruz Biotechnolog, Santa Cruz, CA)。對于組織蛋白酶活性中心標記， 將30 μ g蛋白與1 μ 1的600mM的二硫蘇糖醇、1 μ 1的[125I]-JPM在ρΗ5. 5的緩沖液中如在 先所述地一起孵育。在37°C孵育反應混合物1小時后，于12% SDS-PAGE上分離經標記的 蛋白。凝膠用考馬斯藍染色、脫色、干燥并暴露于χ射線膠片。采集肝臟和胃腸道用于組織 學分析。患者選擇本研究入選在2003-2007 年H0tel-Dieu 醫院營養科(ReferenceCenter for the Medical and Surgical Care of Obesity, Paris, France)預征募的 80 位月巴胖受試 者(平均年齡37. 5歲，在20-66歲之間；平均BMI為48. 5kg/m2，范圍是32-85 ；女性/男 性比69/11)。在Assistance Publique-Hopi taUX de Paris支持的臨床研究計劃中，受 試者是飲食干預或者胃手術的候選人。排除了有炎癥或傳染性疾病、癌癥、酒精濫用或腎 臟疾病跡象的那些。在胃手術時，在肥胖受試者小組(N = 6，BMI = 51.71±1.40kg/m2，&糖:5. 38士0. 13mmol/l，胰島素:13. 32士 1. 06 μ U/ml)中，我們獲得了臍周區的皮下脂肪組 織。在同一地理區域生活的健康不肥胖的年齡匹配的(P = 0. 2)個體(N = 32，平均年齡 41. 4歲，范圍20-62 ；平均BMI 22. 8kg/m2，范圍19. 9-28. 4 ；女性/男性比22/10)征募為 對照組。在10位瘦對照(BMI = 23. 67士0. 48kg/m2，葡萄糖4. 82士0. 45mmol/l，胰島素 7.20±1.56yU/ml)中我們通過穿刺活檢獲取了臍周區的皮下脂肪組織。參與代謝研究的 志愿者在干預前3個月是體重穩定的。在禁食后的早上得到的血液樣本和血清，于-80°C冷 凍直至使用。將組織標本進行福爾馬林固定和石蠟包埋。HGtel-Dieu醫院倫理委員會批 準該臨床研究，并且所有受試者都簽署了書面知情同意書。免疫組織學將人和小鼠的WAT和肌肉組織用10%福爾馬林固定過夜并包埋在石蠟中，由此制備厚度5μπι的切片。抗人肥大細胞類胰蛋白酶(小鼠單克隆，1 100，Dako，TRAPPES CBDEX, France)，抗小鼠肥大細胞 CDl 17 (兔多克隆，1 10，eBiosciences, Inc.，San Diego, CA)，和抗小鼠 CD31(兔單克隆，1 400，Pharmingen, San Diego, CA)對 WAT，肌肉 和肝切片上的肥大細胞和微血管進行免疫染色。對組織來源不知情的研究者計數人的類胰 蛋白酶陽性和CD117陽性的肥大細胞，并且數據提供為每mm2的細胞數。在WAT和肌肉組織 中的⑶31陽性區如所述地使用Image-Pro Plus軟件來測定，并且數據提供為⑶31陽性區 的百分比(Wang，et al.，J. Biol. Chem. 281 :6020_6029 (2006) ；Wild，Microvasc Res. 59 368-376 (2000) )0蘇木精和伊紅染色有助于胃腸道的組織學評價。ELISA將經冷凍的小鼠WAT粉化并溶解在包含組織蛋白酶抑制劑雞尾酒(Calbiochem， San Diego, CA)的 RIPA 緩沖液(Pierce，Rockford, IL)中。WAT 和血清樣本都根據 生產商的說明書經針對 IL6 (BDBiosciences)，TNF- α (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-y (PeproTech), MCP-1 (P印roTech)，脂連蛋白(R&D Systems), MMP-9 (R&D Systems), CatS (R&D Systems)禾口 CatL(Bender MedSystems Inc，Burlingame，CA)的 ELISA 檢測。為測量人血清中類胰蛋白酶水平，將96孔板用兔的抗人的類胰蛋白酶多克隆抗 體(1 1000,Calbiochem)預涂覆。將經稀釋的人血清樣本(1 2)與重組的人的類胰蛋 白酶一起作為標準添加到抗體涂覆孔板中。室溫孵育2小時后，洗滌板，并與抗人的類胰蛋 白酶單克隆抗體(1 2000,AbD Serotec,Raleigh,NC)孵育1小時。過氧化物酶(HRP)綴 合的抗鼠 lgG(l 1000, Thermo scientific，Waltham，MA)用作檢測用抗體。3T3-L1細胞培養和分化將小鼠前月旨肪細胞 3T3_Ll(The American Type CultureCollection, Manassas, VA)在胰島素、地塞米松和異丁甲基黃嘌呤中在6孔板或24孔板上如所述地培養并分化為 脂肪細胞(Yang, et al.，Nat. Cell Biol. 9 :970_977 (2007))。為評價肥大細胞在 3T3-L1 分 化中的作用，我們在100%融合的3T 3-L1細胞中加入活肥大細胞(對于6孔板加入2 X IO6 個細胞/孔，或對于24孔板加入5X IO5個細胞/孔)或者肥大細胞脫粒蛋白提取物(等于 活細胞數)。將共同培養物保持7-9天，每2天更換具有活肥大細胞或肥大細胞脫粒蛋白提 取物的培養基。油紅0染色定量脂質沉積，并且數據提供為OD51tlnm讀數。通過如所述地將 細胞溶解在PH5. 5的緩沖液中，分化的3T3-L1細胞還用于組織蛋白酶活性中心標記(Shi， et al.，J. Biol. Chem. 267 :7258_7262 (1992))。
骨髓來源吧大細胞(BMMC)的培養和重津由WT, 116+，Tnf+，and Ifng+小鼠的骨髓制備BMMC，如在先報道(Sun, et al. Nat. Med. 13 :719_724(2007) ；Sun, et al.，J.Clin. Invest. 117 :3359_3368(2007))。 在重組小鼠IL3 (P印roTech)和干細胞因子(PeproTech)分化5周后(Sun, et al. Nat. Med. 13 :719-724(2007))，分別用⑶117介導的熒光活化細胞分選系統(FACS)分析和甲苯 胺藍染色鑒定細胞純度和形態。為檢測肥大細胞在小鼠肥胖癥中的作用，將來自每種小鼠 的BMMCaxiO7/小鼠)注入6周齡雄性Kitw_slVw_slM、鼠的尾靜脈。BMMC重建2周后，小鼠 消耗西方膳食以誘導肥胖癥和糖尿病。每周記錄小鼠體重，在收集WAT制備蛋白提取物之 前進行葡萄糖耐量分析。Mt來自所有小鼠的數據以平均值士標準差表示，并且由于我們的數據大小小和數 據分布是非正態的因此采用非參數秩和檢驗(Marm-Whitney test)來確定統計顯著性。人 血清糜蛋白酶和類胰蛋白酶數據表示為平均值士標準差。Shapiro-Wilcoxon檢驗估計 所有臨床和生物學參數的高斯分布。統計分析前，將偏態變量(糜蛋白酶和類胰蛋白酶) 經對數轉換并驗證以使它們的分布正態化。不連續數值的Student' s t檢驗，方差分析 (ANOVA)和X2檢驗被用于組間比較。用JMP統計軟件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)進 行統計分析。P <0.05被認為是顯著的。II.結果除脂肪細胞外，肥胖受試者中的WAT還包含巨噬細胞和淋巴細胞(Weisberg， et al. , J.Clin. Invest. 112 1796-1808 (2003) ；ffu, et al. , Circulation 115 1029-1038 (2007))。這些炎性細胞提供WAT中的細胞因子、生長因子、趨化因子和蛋 白 _ (ffu, et al. , Circulation 115 1029-1038(2007) ；Fantuzzi, J. Allergy Clin. Immunol. 115 :911_919 (2005))。但是這些細胞在肥胖癥和相關的代謝并發癥糖尿病的發病 機制中的作用仍不清楚。其他未明確的細胞也可能起重要作用。人脂肪組織切片用肥大細 胞特異性類胰蛋白酶單克隆抗體的免疫染色顯示，與瘦削供體相比，來自肥胖受試者的WAT 中肥大細胞數量增加。伴隨著較高的肥大細胞含量，肥胖供體的血清中肥大細胞蛋白酶水 平增高。使用ELISA，測得，與瘦削的受試者(BMI < 30kg/mm2)相比，肥胖供體(人體質量指 數=BMI彡30kg/mm2)在性別差異校正之前(P < 0. 01)和之后的(P < 0. 01，多變量分析) 具有顯著較高的類胰蛋白酶水平。這些觀察結果提示了肥大細胞在肥胖癥中的作用。為評價肥大細胞直接參與肥胖癥，我們研究了飲食誘導的肥胖癥的肥大細胞缺陷 型KitW-SlVhh小鼠。盡管由于C-Kit啟動子區域的倒位突變而使得KitW-sh/W-sh小鼠缺乏成 熟的肥大細胞(Duttlinger, et al. ,Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 92 :3754_3758 (1995))， 但是血液中其他淋巴細胞的數量和活性是正常的，所以允許體內探測肥大細胞的功能。飼 以西方膳食12周，與野生型(WT)同基因型的對照相比，6周齡雄性Kitw_slVw_sh小鼠增加顯 著較少的體重。類似地，接受每日腹膜內(i. P.)注射肥大細胞穩定劑色甘酸二鈉(DSCG) (Eigen，et al. ,J. Allergy Clin. Immunol. 80 :612_621 (1987))的 WT 小鼠也具有減少的體 重增加。DSCG治療并不進一步影響Kitw-slVw_sh小鼠的體重，提示是通過肥大細胞起作用的。 與減輕體重一致，雄性Kitw_slVw_sh小鼠或者接受DSCG的那些，與未治療的野生型WT對照相 比，具有顯著較少的皮下和內臟脂肪。雌性Kitw_sh/w_sh小鼠或DSCG治療的WT小鼠表現出相似的體重增加和皮下及內臟脂肪的減少。和人的脂肪組織一樣，來自飲食導致肥胖的小鼠 的WAT包含大量的c-Kit (CDl 17)陽性的肥大細胞，而來自飼料喂飼 (chow diet-fed)的瘦 削小鼠的WAT具有少得多的肥大細胞。有趣的是，在相同的飲食條件下，DSCG治療小鼠的 WAT中肥大細胞數量與未治療小鼠的WAT中肥大細胞數量相近，盡管在體重增加方面這些 小鼠與Kitw_slVw_sh小鼠反應類似，提示與未治療的WT小鼠相比，DSCG治療WT小鼠具有較少 的活性肥大細胞。與雄性和雌性Kitw_sh/w_sh小鼠或接受DSCG的那些的體重減輕一致，這些小 鼠還具有比WT對照顯著較低水平的血清瘦素水平。Kitw_sh/w_sh和經DSCG治療的小鼠不僅較 瘦，而且還證實它們對葡萄糖負荷的敏感性較高。葡萄糖耐量檢測表明無肥大細胞(Kitw_slV w_sh)的小鼠或具有被穩定的肥大細胞(用DSCG治療的WT)的小鼠中顯著改善的葡萄糖耐 量。為理解肥大細胞缺陷或失活的這些有益效果的機制，我們進行了能量消耗檢測并測量 了棕色脂肪非偶聯蛋白-1 (UCPl)。通過測量食物/水的攝入，糞便/尿液的產生和O2消耗 及CO2的產生，發現Kithh^h小鼠和經DSCG治療的WT小鼠的靜息代謝率增加，這通過與未 治療WT小鼠相比顯著更多的O2消耗及的CO2產生而闡明。相比WT對照小鼠，Kitw--小 鼠和接受DSCG的那些具有明顯較高的棕脂肪UCPl (能量消耗的標志)表達。重要的是，既 不是食物/水的攝入減少，也不是DSCG的毒性作用引起經DSCG治療的WT小鼠的體重減輕 和葡萄糖耐量改善。組織學分析表明，與飼料喂飼的WT小鼠相比，經DSCG治療的西方膳食 飲食喂飼的小鼠的肝臟和胃腸道(GI)病理上沒有差異。在西方膳食喂飼的WT小鼠的脂肪 肝里出現大量肥大細胞和脂肪細胞，而在飼料喂飼的WT小鼠或經DSCG治療的西方膳食飲 食喂飼的WT小鼠的肝臟中沒有檢測到肥大細胞或負載脂質的脂肪細胞。類似地，胰臟、胃、 結腸和小腸組織學檢查顯示飼料喂飼的WT小鼠和經DSCG治療的西方膳食喂飼的WT小鼠 之間沒有明顯區別。為進一步觀察，我們對WT小鼠飼以西方膳食12周以引發肥胖癥和糖 尿病，并將這些肥胖和糖尿病小鼠分為4個治療組1，持續用西方膳食喂飼，II，轉為飼料； III，持續用西方膳食喂飼連同每日腹膜內注射DSCG ；IV，轉為飼料并且用DSCG治療。盡管 飲食的改變(組II)也會引起預計到的體重減輕(8% )和葡萄糖耐量改善，然而飲食改變 與給予DSCG(組IV)聯合產生體重和葡萄糖耐量的最大改善。DSCG治療8周后，組III的 小鼠體重下降了 12%，但是組IV的小鼠下降了 19%，并且穩定在約40-41克。重要的是， 在這4四組中組的IV小鼠也顯示了最高的葡萄糖耐量，提示通過穩定肥大細胞來控制人的 肥胖癥和糖尿病的可能性。III.討論肥胖癥的發展包括脂肪生成、血管發生和基質重塑。血管發生在肥胖癥中尤為重 要。微血管除了給WAT提供營養，還為白細胞侵潤及隨之的脂肪因子釋放提供通道。血管 發生的抑制阻斷小鼠脂肪組織的發育(Rupnick, et al.，Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 10730-10735 (2002)) ο肥胖WT小鼠的WAT和肌肉組織顯示了內皮細胞標記物CD31明顯的 免疫染色。相反，西方膳食喂飼的Kitw-sh/w_sh小鼠或接受DSCG的那些具有與飼料喂飼的瘦 小鼠相似的CD31陽性區域。減少的血管發生可能影響白細胞侵潤，因此減少WAT炎癥介質 的產生(Skoura, etal.，J. Clin. Invest. 117 :2506_2516 (2007))。與此觀點一致，Kit[sh/ w_sh小鼠或接受DSCG的那些具有較低的血清和/或WAT中IL6，TNF-α，IFN- y , MCP-I，基 質金屬蛋白酶-9(ΜΜΡ_9)和組織蛋白酶S(CatS)，盡管某些脂肪因子(如脂連蛋白和CatL) 沒有明顯變化。基質蛋白酶解可能通過釋放促血管生成的肽而有助于血管發生(Xu，etal.，J. Cell Biol. 154:1069-1079(2001))。我們以前已經揭示了 CatS通過降解抗血管生成的 肽和產生促血管生成的核纖層蛋白-5的片段Y 2而在血管發生中發揮重要作用(Wang，et al.，J. Biol. Chem. 281 =6020-6029 (2006)) 0 在 Kit—小鼠或 DSCG 治療小鼠中血管發 生減少，伴有WAT和血清中的低CatS水平。將WAT蛋白提取物與選擇性標記活性組織蛋 白酶的[125I] -JPM孵育后，在Kitw-sh^sh小鼠WAT中我們發現活性受損的組織蛋白酶，包括 CatS, CatK和CatB。有趣的是，經DSCG治療的小鼠的WAT中仍具有與WT對照相似的活性 CatS和CatK水平，與在這些組織中觀察到大量肥大細胞一致。CatSELISA使我們能夠測定 不同小鼠中局部和全身的水平。與JPM標記實驗的觀察結果相似，雄性和雌性的Kitw-sh^sh 小鼠都顯示低于WT對照的血清和WAT中CatS水平。相反，DSCG治療組顯著降低在血清中 而不是在WAT中的CatS水平，提示該抗變態反應藥劑有效地使肥大細胞失活。我們以前的研究提示半胱氨酰組織蛋白酶不僅促進血管發生，而且通過降解抗 脂肪生成的基質構成纖維連接蛋白、葡萄糖運載體Glut4和胰島素受體(IR)參與脂肪生
(Wang, et al. ， J Biol Chem. 281 6020-6029 (2006) ；Yang, et al. ，Nat. Cell Biol. 9 970-977(2007) ；Taleb，et al. ,Endocrinology 147:4950-4959(2006))。肥大細胞缺陷和 失活由于組織蛋白酶活性降低可能間接影響這些蛋白。與該假說一致的是，Kitw-sh/w_sh小鼠 的WAT和肌肉組織中所有這三種分子都增加。有趣的是，在經DSCG治療小鼠的WAT和肌肉 組織中我們檢測到比Kitw_slVw_sh小鼠更多的纖維連接蛋白、Glut4和IR分子，提示DSCG比 肥大細胞影響更大。但是，DSCG的這種附加效應并未進一步改變Kitw_slVw_sh小鼠的體重增 加和葡萄糖耐量或者改變WT小鼠的肝臟及胃腸道組織學。為進一步理解肥大細胞控制小鼠肥胖癥和糖尿病的分子機制，我們制備了缺乏三 種常見肥大細胞分泌的細胞因子(IL6，TNF-α，和IFN-γ )之一的小鼠的骨髓來源的肥大 細胞(BMMC)，并檢查了任何細胞因子的缺乏是否損害肥大細胞體外誘導前脂肪細胞分化及 體內對飲食引起的肥胖癥和糖尿病中的活性。來自WT、Tnf+，和Ifng+小鼠的BMMC即使在 無分化誘導雞尾酒(胰島素，地塞米松，異丁基甲基黃嘌呤)的條件下也誘導3T3-L1細胞 的血管發生和相關的組織蛋白酶表達，盡管根本機制仍未知。相反，116+的BMMC對這兩個 變量具有低得多的效力。為體內驗證這些肥大細胞的細胞因子在肥胖癥中發揮作用，我們 將這些BMMC細胞過繼轉染到雄性Kitw-sh/w_sh小鼠。給予西方膳食13周后，與沒有進行BMMC 重建小鼠相比，WT和Tnf+B匪C重建但非116+和Ifng+B匪C的小鼠顯著增加更多的體重 盡管它們都比WT對照瘦。與體重差異一致，和未重建的小鼠或接受116+和Ifng+BMMC的 那些相比，接受WT和Tnf+BMMC的那些具有顯著更高的血清胰島素和葡萄糖水平。相比WT 對照，接受116+和Ifng+BMMC但非WT或Tnf+BMMC的Kitw-sh/w-sh小鼠也顯示了改善的葡 萄糖耐量，提示肥大細胞來源的IL6和IFN-Y促成了這些代謝紊亂。為支持該結論，相比 WT小鼠或者接受WT或Tnf+BMMC的那些，我們在116+和Ifng+BMMC重建的Kiw-slVw_sh小 鼠WAT提取物中檢測到更高量的基質纖維連接蛋白、Glut4和IR。WAT中這些分子的差異可 能是由于蛋白酶解的改變或脂肪細胞大小不同造成的。盡管我們發現Kitw_sh/w_sh小鼠比WT 對照的WAT脂肪細胞小，但是WAT脂肪細胞的大小在不同BMMC重建小鼠之間并沒有顯著變 化。相反，不同重建的接受者在半胱氨酰組織蛋白酶的表達上具有明顯不同。不知道為什 么Ifng+BMMC與WT BMMC相同地誘導3T3-L1脂肪生成和組織蛋白酶活性，但是不能恢復體 重和葡萄糖敏感性。肥大細胞來源的IFN-γ除了影響脂肪細胞分化外，還可能影響其他過程如通過旁分泌效應影響鄰近細胞的血管發生或蛋白酶表達。在Ifng+BMMC重建Kitw_slV w-s1mh^wat中觀察到低組織蛋白酶活性支持了這一觀點。因此，肥大細胞介質體外如何調 節WAT的生長及何種附加的肥大細胞因子參與還值得進一步研究。本研究確立了肥大細胞在鼠類肥胖癥和糖尿病中的新作用并提示了臨床常規應 用的抗過敏反應藥物用于這些常見人類代謝性疾病的潛在新療法。_本文引用的所有參考文獻通過參考完全并入。現在完整地描述了本發明，本領域 的技術人員了解本發明可以在寬的和相當范圍的條件、參數范圍等下實施，而不影響發明 及其任何實施方式的精髓或范圍。
權利要求
治療或預防人或動物對象肥胖癥的方法，其包括給予所述對象有效量的穩定肥大細胞的藥物。
2.權利要求1的方法，其中給予肥胖的人對象所述穩定肥大細胞的藥物至少足以使所 述對象相比他們開始治療時的總體重減少至少15%的時段。
3.權利要求1的方法，其中所述人或動物對象在開始治療時沒有過敏反應、心臟病和 糖尿病。
4.權利要求1的方法，其中所述藥物選自色甘酸、奈多羅米、酮替芬和洛度沙胺。
5.權利要求4的方法，其中所述藥物是以50-1500mg/天的劑量口服給予的。
6.權利要求4的方法，其中所述藥物是以5-100mg/天的劑量經鼻給予的。
7.權利要求4的方法，其中所述藥物是以200-1000mg/天的劑量口服給予的色甘酸鈉 或色甘酸二鈉。
8.權利要求4的方法，其中所述藥物是以5-50mg/天的劑量經鼻給予的奈多羅米鈉。
9.權利要求4的方法，其中所述藥物是以50-500mg/天的劑量口服給予的奈多羅米鈉。
10.權利要求4的方法，其中所述藥物是以l_200mg/天的劑量口服給予的富馬酸酮替芬。
11.權利要求4的方法，其中所述藥物是以l_200mg/天的劑量口服給予的洛度沙胺氨 丁三醇。
12.治療組合物，其包含a)成品藥物容器中的肥大細胞穩定劑，和b)給予人或動物患者所述肥大細胞穩定劑以治療肥胖癥的說明書。
13.權利要求12的方法，其中所述藥物選自色甘酸、奈多羅米、酮替芬和洛度沙胺。
14.權利要求13的方法，其中所述藥物是色甘酸鈉或二鈉。
15.權利要求13的方法，其中所述藥物是奈多羅米鈉。
16.權利要求13的方法，其中所述藥物是富馬酸酮替芬。
17.權利要求13的方法，其中所述藥物是洛度沙胺氨丁三醇。
18.權利要求13的治療組合物，其中所述肥大細胞穩定劑是藥物組合物的一部分，是 以單位劑量形式并且以每個單位劑量為l_500mg存在。
全文摘要
本發明涉及通過給予穩定肥大細胞的化合物來治療或預防肥胖癥發展的方法，此外，所述方法包括具有肥大細胞穩定劑和關于所述穩定劑用于治療或預防肥胖癥的說明書的藥物組合物。
文檔編號A61K31/517GK101808642SQ200880108966
公開日2010年8月18日 申請日期2008年9月24日 優先權日2007年9月28日
發明者施國平 申請人:布里格海姆婦女醫院公司