G6PD缺陷型Caki-1穩轉細胞株及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學分子生物學相關技術，尤其是采用SiRNA干擾技術構建細胞研宄 模型。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脫氛酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)是憐 酸戊糖途徑（pentose-phosphate pathway, PPP)的關鍵限速酶，定位于基因高密度區 Xq2. 8(NM_000402)，全長18kb，由13個外顯子和12個內含子組成。G6H)是看家基因，在所 有組織細胞均有表達，其mRNA全長為2395bp，cDNA為1548bp，編碼515個氨基酸。磷酸 戊糖途徑可產生五磷酸核糖和還原型煙酰胺腺嗓呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)，是細胞生長生存的重要核酸合成原料，及還原劑。腫瘤 細胞是增殖和分化失控的細胞，并且存在氧化還原應激的失衡。近年來，越來越多的研宄表 明G6H)及磷酸戊糖通路的異常與腫瘤的發生發展、治療轉歸密切相關。
[0003] 在正常細胞中，G6ro的表達及活性是受到嚴格調控的。然而，在腫瘤細胞中G6ro 卻表現出異常激活。有文獻報道，在NIH 3T3細胞中過表達人G6H)基因，可使細胞生長迅 速，形態發生改變，接觸抑制和貼壁依賴性消失。進一步將上述細胞注射到裸鼠皮下，可快 速誘導裸鼠產生腫瘤，并且腫瘤的大小與G6ro活性呈正相關。這一結果表明，G6ro表達增 加可發揮類似癌基因促進腫瘤發生發展的作用。另有研宄指出，Gero在膀胱癌、胃腸癌、結 腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中出現了高表達，并具有高活性。Ohl等在檢測人膀 胱癌和前列腺癌細胞內看家基因時發現，Gero表達出現異常并與腫瘤的惡性程度相關。另 夕卜，應用的非競爭性抑制劑脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA)可抑制細胞 內G6ro酶活性，并減慢伯基特淋巴瘤的生長速度。G6ro可通過磷酸戊糖途徑產生重要的還 原劑NADPH，從而保護細胞免受超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等產生氧化應激而引起細 胞的凋亡。我們先前的研宄表明，在人黑色素瘤A375細胞中敲低G6H)，氧化應激所引起的 細胞凋亡明顯增加，由此提示Gero的高表達可能是人惡性黑色素瘤臨床耐藥性產生的原 因之一。綜上可見，Gero與多種腫瘤的發生發展及治療預后存在相關性。然而，Gero與腫 瘤關系的研宄并不充分，甚至有不一致的觀點和結論，其具體作用機制更加不明確。因此， G6ro在腫瘤領域的角色如何，仍需要大量工作去研宄、探討。
[0004] 腎細胞癌（簡稱腎癌）是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，又稱腎腺 癌，占腎惡性腫瘤的80%?90%，是泌尿系統中惡性度較高的腫瘤。據調查，腎癌在我國泌 尿生殖系統腫瘤中占第二位，僅次于膀胱腫瘤，占成人惡性腫瘤的2%?3%、小兒惡性腫 瘤的20%左右。流行病學統計資料顯示，腎癌可見于各年齡階段，并且腎癌在我國的發病率 正呈現出逐年上升趨勢。腎細胞癌具有初診轉移率高、病程進展快、對常規放化療十分不敏 感、術后易轉移、預后差等特點，成為長期困擾醫生和患者的難題。雖然目前腎癌的治療取 得了一定進展，但其詳細發病機制仍不清楚。因此，相關分子靶標的鑒定，以及更為有效的 靶向治療策略仍有待進一步探索。
[0005] 在本發明人的前期研宄中，我們采用免疫組化方法證實，與癌旁組織對比，Gero在 人腎細胞癌中出現了表達升高的現象。然而，G6PD的表達及活性是否在腎細胞癌相應細胞 系中存在異常，Gero在腎細胞癌發生發展中的具體作用是什么，以及其調控機制又如何？ 上述疑問，國內外至今未見相關報道。

【發明內容】

[0006] 本發明旨在提供一種Gero缺陷型Caki-I穩轉細胞株，作為細胞模型用于研宄 Gero與腎細胞癌的相關性及其作用機制。
[0007] 本發明所述的G6H)缺陷型Caki-I穩轉細胞株是含有靶向干擾G6H)基因表達的 DNA雙鏈片段和綠色焚光蛋白（green fluorescent protein, GFP)基因、可將Caki-I細胞 株經siRNA干擾技術靶向沉默了內源性G6H)表達量80%以上的穩轉細胞株；所述的DNA雙 鏈片段為：干擾 F 鏈 5' -GATCCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTCAAGAGATGTCAAGTGGCACTGAGGCTTT TTTA-3' 和干擾 R 鏈 5' -AGCTTAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACATCTCTTGAATGTCAAGTGGCACTGAGG CGGG-3, 。
[0008] 上述Caki-I細胞株為現有技術，購自中國科學院細胞庫。它來源于一位49歲白 種男性腎透明細胞癌患者的皮膚轉移灶，由J Fogh等人于1977年建立。該細胞貼壁生長， 屬上皮細胞，具有致瘤性（接種該細胞至免疫抑制的裸鼠，可產生類似于腎癌基本特征的 透明細胞癌）。經細胞遺傳學分析，Caki-I為亞三倍體合并Y染色體缺失的細胞。除N9和 N19外，其他常染色體均存在于該細胞中，呈2倍體或3倍體形式。該細胞已被鑒定的染色體 標記有 13個：9q+，t(lp ; ? )，t(lqter>lq21: :20)，t(lql7q)，der(ll)t(3 ;11) (q21 ;ql4)， 19q+，4q+，4p+等。Caki-1 細胞DNA上的短串聯重復序列（short tandem repeat, STR)包括： Amelogenin:X ；CSF1P0:10, 11 ；D13S317:11, 12 ；D16S539:12 ；D5S818:11, 12 ；D7S820:8, 12 ； THOl :6, 8 ;TP0X: 8, 11和vWA: 15, 17。本發明所述的G6H)缺陷型Caki-I穩轉細胞株 (Caki-1-G6PD siRNA)是將上述DNA雙鏈片段插入含GFP的pSP-GFP/Neo表達載體，再轉入 Caki-I細胞株，在細胞中表達siRNA，經陽性細胞克隆篩選，得到siRNA靶向沉默了內源性 G6PD表達量達80%以上的穩轉Caki-1-G6PD siRNA細胞株。
[0009] 本發明所述的G6H)缺陷型Caki-I穩轉細胞株的構建方法由以下步驟組成：
[0010] 一、SiRNA序列和DNA模板的設計與合成
[0011] 用01 igoEngine RNAi軟件設計針對人G6H)基因3'端非編碼區的干擾序列 5' -GCCTCAGTGCCACTTGACA-3'，并以無關序列 5' -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3' 為對照，再分別 合成兩條互補并含干擾序列或無關序列的正義鏈和反義鏈的DNA模板，中間以9個脫氧核 苷酸的Hairpin結構相連，后接RNA Poly III轉錄中止點，并在兩端引入Bgl I和Hind III 酶切位點；對應于人G6H)基因3'端非編碼區的干擾序列的DNA模板是干擾F鏈5' -GATCC CCGCCTCAGTGCCACTTGACATTCAAGAGATGTCAAGTGGCACTGAGGCTTTTTTA-3' 和干擾 R 鏈' -AGCTTA AAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACATCTCTTGAATGTCAAGTGGCACTGAGGCGGG-3' ；而對應于無關序列的 DNA 模板是無關 F 鏈 5' -GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGITTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAAITT TTTA-3' 和無關 R 鏈 5' -AGCTTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGA AGGG-3，；
[0012] 二、siRNA表達載體的構建
[0013] 上述DNA模板分別經稀釋、退火，與線性質粒pSP-GFP/Neo連接；再轉化E. coli DH 5 α，涂布平板，過夜培養；挑取兩4個單菌落進行擴增培養，提取質粒后進行測序；對于測 序正確的陽性克隆，提取其不含內毒素的重組質粒；
[0014] 三、Caki-I細胞株的轉染
[0015] 復蘇培養Caki-I細胞至狀態良好，轉染前一天傳代細胞至6孔板，每孔2 X IO5細 胞，次日觀察其匯合度為70 %?80 %時進行細胞轉染，轉染采用Lipofectamine 2000轉染 試劑和Opti-MBl培養基，6孔板每孔的轉染量為4 μ g質粒稀釋到250 μ L Opti-MBl培養 基，得到A液；取10 μ L Lipofectamine 2000溶解于250 μ L Opti-MEM培養基，得到B液； 室溫孵育5min后將A液和B液混合，室溫孵育20min后加入棄培養基的細胞中，孵育6? 8hr后更換為新鮮不含抗生素的完全培養基；
[0016] 四、Caki-1-G6PD siRNA穩定