細胞穩定化的制作方法
【專利說明】細胞穩定化 發明背景
[0001 ]本申請要求于2013年6月13日提交的美國臨時申請號61 /834，517的權益，該臨時 申請通過引用全文并入本文。
技術領域
[0002] 本發明設及細胞的穩定化。 相關領域的描述
[0003] 有核細胞(例如，真核細胞)的長期儲存通常需要在毒性冷凍保護劑DMSO的存在下 超低的溫度。除了由冷藏系統的常見失效導致的損失之外，活細胞從冷凍狀態的恢復是有 挑戰性的，且通常僅少部分的投入細胞存活。
[0004] 在過去的20年中，已花費數百萬美元的研究基金來嘗試開發用于在環境溫度下穩 定化真核細胞的替代方法。運些努力背后的動力是環境溫度穩定化的真核細胞儲備物用于 生物醫學研究、產品開發W及在診斷學、再生醫學、治療學、血液供應物流學和細胞移植中 直接應用的優勢。
[000引基于對可在干燥狀態下存活多年的極端微生物如緩步動物、輪蟲或面蟲（brine shrimp)的研究，有人假設可W在真核細胞培養物中開發模擬運一分子現象的技術和方案。 遺憾的是，即使在數十年的研究之后，仍未實現細胞的實用干燥儲存穩定化。所描述的最好 的穩定化技術采用海藻糖一一一種非還原糖分子作為干燥介質。載有海藻糖的哺乳動物細 胞可被干燥但需要幾乎立即再水化，并且即使那樣存活率仍然有限。已經證明，干燥細胞儲 存即使持續幾分鐘也會導致徹底的細胞死亡。
[0006] 因此，存在開發允許細胞在環境溫度下基本干燥儲存且再水化時保持活力的制 劑、組合物和方法的需要。

【發明內容】

[0007] 本文所述的制劑、組合物和方法有利地使細胞在基本干燥的條件下儲存時維持存 活狀態，使得細胞在干燥儲存至少一小時，且在某些實施方案中至少一周的時間段后再水 化時保持至少一種功能性質，例如，細胞活力，從而在無需冷凍或凍干的情況下顯著增加可 用于運輸和儲存活細胞的時間。在本發明的一個方面，提供了組合物，其包含在沒有冷凍或 任選地沒有凍干的情況下基本干燥儲存的細胞，其中該細胞在基本干燥儲存至少1小時后 再水化時，再水化的細胞表現出至少一種與脫水和基本干燥儲存之前的細胞基本相同的功 能性質。
[0008] 在某些實施方案中，所述組合物包含至少一種干燥儲存穩定劑，該干燥儲存穩定 劑優選地選自氨基酸、合成氨基酸、膚、非還原糖、馨合劑、水溶性聚合物和四氨喀晚。在一 個實施方案中，不存在為糖分子（例如，海藻糖）的穩定劑，或者如果存在為糖分子的穩定 劑，則還存在另一種不是糖分子的穩定劑。
[0009] 在某些其他實施方案中，提供了包含至少一種調亡抑制劑、優選可逆調亡抑制劑 的組合物。示例性的調亡抑制劑選自陽服-e IF2-a抑制劑、ASKl抑制劑、NRF2-KEAP1抑制劑、 JNK抑制劑、P38MAP激酶抑制劑、IREl抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑、PI3K通路抑制劑、巧 蛋白酶抑制劑W及脫天蛋白酶-1抑制劑。
[0010] 在另一個方面，提供了組合物，其中在脫水之前用包含至少一種調亡抑制劑的預 脫水制劑處理細胞W產生預處理的細胞。在某些實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑選 自PE服-eIF2-a抑制劑、ASKl抑制劑、NRF2-KEAP1抑制劑、JNK抑制劑、P38MAP激酶抑制劑、 IREl抑制劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑、PI3K通路抑制劑、巧蛋白酶抑制劑W及脫天蛋白酶-1 抑制劑。
[0011] 在一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是PE服-eIF2-a抑制劑。
[0012] 在另一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是ASKl抑制劑。
[0013] 在又一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是NRF2-KEAP1抑制劑。
[0014] 在又一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是GSK3抑制劑。
[0015] 在一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是MEK抑制劑。
[0016] 在另一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是JNK抑制劑。
[0017] 在又一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是JNK抑制劑和P38MAP激酶抑制 劑。
[0018] 在又一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是PI3K抑制劑。
[0019] 在一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是IRE-I抑制劑。
[0020] 在另一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是巧蛋白酶抑制劑。
[0021] 在又一個實施方案中，所述至少一種調亡抑制劑是脫天蛋白酶-1抑制劑。
[0022] 在某些實施方案中，所述預脫水制劑包含至少一種調亡抑制劑和至少一種邸蛋白 伴侶誘導劑。
[0023] 在某些其他實施方案中，所述預脫水制劑包含至少一種調亡抑制劑和至少一種自 隧誘導劑。
[0024] 在又一個實施方案中，所述預脫水制劑包含至少一種調亡抑制劑和至少一種存活 蛋白。
[0025] 在本發明的另一個方面，提供了包含再水化的細胞的組合物，其中該再水化的細 胞是在沒有冷凍或凍干的情況下基本干燥儲存的細胞，其中該細胞在基本干燥儲存至少1 小時后再水化時，該再水化的細胞表現出至少一種與脫水和基本干燥儲存之前的細胞基本 相同的功能性質。
[0026] 在某些實施方案中，所述細胞的再水化在再水化制劑的存在下發生，并且優選地 該再水化制劑包含至少一種調亡抑制劑。
[0027] 在某些其他實施方案中，所述再水化緩沖液中的至少一種調亡抑制劑選自PEW-e I F2-a抑制劑、ASK1抑制劑、NRF2-KEAP1抑制劑、JNK抑制劑、P38MAP激酶抑制劑、I RE 1抑制 劑、GSK3抑制劑、MEK抑制劑、PI3K通路抑制劑、巧蛋白酶抑制劑W及脫天蛋白酶-1抑制劑。
[0028] 在其他實施方案中，所述再水化制劑包含調亡抑制劑W及選自ER蛋白伴侶誘導 劑、自隧誘導劑和存活蛋白中的一種或多種。
[0029] 在一個實施方案中，再水化后的至少一種功能性質包括代謝活性。
[0030] 在某些實施方案中，所述代謝活性通過測定ATP含量或脫天蛋白酶測定試驗來度 量。
[0031] 在某些其他實施方案中，再水化后的代謝活性在細胞再水化后24小時、細胞再水 化后48小時、細胞再水化后72小時或細胞再水化后一周測量。
[0032] 在其他實施方案中，所述組合物在再水化前W脫水形式穩定化至少24小時，在再 水化前W脫水形式穩定化至少48小時，在再水化前W脫水形式穩定化至少72小時，或在再 水化前W脫水形式穩定化至少一周。
[0033] 在其他方面，提供了脫水制劑，其包含抑緩沖液;合成氨基酸、水溶性聚合物；W及 第一氨基酸或膚。在某些實施方案中，所述脫水制劑進一步包含非還原糖、至少一種調亡抑 制劑或第二氨基酸。
[0034] 在又一個方面，提供了在沒有凍干的情況下將一種或多種細胞在環境溫度下基本 干燥儲存的方法，該方法包括:將一種或多種細胞在脫水制劑中溫育，W及在脫水制劑的存 在下使該一種或多種預處理的細胞脫水，W產生一種或多種基本干燥儲存的細胞。在其他 方面，提供了在沒有凍干的情況下將一種或多種細胞在環境溫度下基本干燥儲存的方法， 該方法包括:將所述一種或多種細胞與包含調亡抑制劑的預脫水制劑一起溫育W產生一種 或多種預處理的細胞，去除所述預脫水制劑；W及在脫水制劑的存在下使所述一種或多種 預處理的細胞脫水，W產生一種或多種基本干燥儲存的細胞。
[0035] 在一個實施方案中，所述方法中使用的脫水制劑包含至少一種干燥儲存穩定劑， 并且在沒有使用預脫水制劑時可進一步包含至少一種調亡抑制劑(在一個實施方案中其為 可逆調亡抑制劑）。
[0036] 在另一個實施方案中，所述方法進一步包括在將一種或多種細胞與所述預脫水制 劑一起溫育之前將所述一種或多種細胞固定至固體支持體上。
[0037] 在又一個實施方案中，所述方法進一步包括采用包含至少一種調亡抑制劑的再水 化制劑將所述一種或多種基本干燥儲存的細胞再水化，W產生再水化的細胞。
[0038] 在某些實施方案中，所述預脫水制劑中的至少一種調亡抑制劑與所述再水化制劑 中的至少一種調亡抑制劑相同，而在其他實施方案中，所述預脫水制劑中的至少一種調亡 抑制劑與所述再水化制劑中的至少一種調亡抑制劑不同。
【附圖說明】
[0039] 圖1是ER應激通路的S種近端ER跨膜傳感器的示意圖，（A)GRP78結合的失活狀態， (B)GRP78的釋放導致激活IREl。
[0040] 圖2是邸應激通路(A)、由調亡抑制劑抑制的ER應激通路的阻斷步驟和祀標(B)的 示意圖。
[0041] 圖3示出了采用本文所述的制劑和方法基本干燥儲存的間充質干細胞(MSC)保持 在再水化時分化成脂肪細胞(B圖）、骨細胞(C圖）和軟骨細胞(D圖）的能力。
[0042] 圖4示出了化La細胞在脫水和室溫下儲存5小時后的長期活力。（A)干燥5小時并隨 后進行五天的再水化后的細胞活力。(B)每毫升的活細胞數目。將細胞接種到新鮮的細胞培 養板中，并采用根據本文公開的一個實施方案的組合物對各組進行處理。
[0043] 圖5示出了相對于未處理的對照的脫天蛋白酶3/7活化。脫天蛋白酶活化計算為在 標準組織培養條件下培養的測試樣品中的活性與未處理的細胞的活性之比。使測試的細胞 脫水并在室溫下干燥儲存5小時，隨后進行5天的再水化。
[0044] 圖6示出了細胞在脫水、干燥狀態儲存7小時并且儲存后再水化后的存活。在重新 接種后3天W及再水化后共7天評價細胞活力。不同的穩定化制劑影響細胞存活W及細胞增 殖。未受到保護的對照和海藻糖穩定化的細胞沒有產生任何存活的細胞。 發明詳述
[0045] 不希望受任何理論的限制，預期本文所述的某些實施方案的制劑和組合物穩定化 細胞膜和細胞的細胞器的完整性，同時還阻斷調亡(例如，通過在脫水前的限定階段和在再 水化時阻斷特定ER應激通路），W提供在環境溫度下儲存至少一個小時的基本干燥的細胞， 該基本干燥的細胞在被再水化至少一小時的時間段后保持至少一種功能性質。在某些實施 方案中，采用調亡抑制劑阻斷特定m?應激通路。在其他實施方案中，采用調亡抑制劑結合ER 蛋白伴侶誘導劑來阻斷特定ER應激通路，W驅使ER應激通路朝向適應性反應而非調亡。
[0046] 在某些實施方案中，采用脫水制劑使細胞脫水，該脫水制劑優選地包含至少一種 干燥儲存穩定劑和至少一種調亡抑制劑。
[0047] 在某些其他實施方案中，在將細胞在脫水制劑的存在下脫水W產生基本干燥儲存 的細胞之前，采用包含調亡抑制劑的預脫水制劑預處理細胞預定的一段時間，例如1小時。 將基本干燥儲存的細胞在再水化制劑的存在下再水化，該再水化制劑優選地包含調亡抑制 劑，該調亡抑制劑可與預脫水制劑中的調亡抑制劑相同或不同。在特定的一段時間，例如1 小時之后，去除再水化制劑，并且可根據預期的最終用途，將細胞在生長培養基或其他合適 的溶液和緩沖液中再水化。 定義
[0048] 除非另外定義，本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域的技術 人員通常理解的含義相同的含義。本文引用的所有專利、專利申請和出版物均通過引用全 文并入本文。
[0049] 如本文所用的，術語"真核細胞"是指在真核生物(優選人類)的真核細胞發育的任 何給定階段(包括受精的卵母細胞、母細胞W及其他胚胎階段、胎兒或成人）的體液或組織 中存在的至少一種有核細胞。可采用本發明的制劑、組合物和方法在環境溫度下基本干燥 儲存的示例性細胞包括但不限于成纖維細胞、角質形成細胞、軟骨細胞、黑素細胞、成骨細 胞、骨細胞、肌細胞、屯、肌細胞、神經元、雪旺細胞、膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、 T細胞、B細胞、記憶細胞、網織紅細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細 胞、巨隧細胞、巨核細胞、樹突細胞、脂肪細胞、膜島細胞、卵母細胞、精母細胞、胎盤廝帶血 細胞、母細胞、合子、上皮細胞(例如，乳腺細胞、子宮內膜細胞、膜腺腺泡細胞、杯狀細胞、朗 格漢斯細胞、成釉細胞和帕內特細胞）、牙細胞(odontocytes)、肝細胞、脂細胞、壁細胞、肺 細胞、內皮細胞、腫瘤細胞、循環腫瘤細胞、視網膜光感受器和色素細胞、晶狀體細胞W及干 細胞(包括多能或全能胚胎干細胞、胎兒干細胞、iPS細胞和間充質干細胞)或其混合物。干 細胞可WW未分化或部分分化狀態在環境溫度下基本干燥儲存。
[0050] 如本文所用的，術語"預處理的細胞"是指在脫水之前已經用包含至少一種調亡抑 制劑的預脫水制劑處理過的細胞。預處理的細胞預先載有調亡抑制劑，W允許采用含有或 缺少調亡抑制劑的脫水制劑在沒有m?應激通路活化的情況下基本干燥儲存預處理的細胞。 在某些實施方案中，在添加脫水制劑之前，將包含調亡抑制劑的預脫水制劑從預處理的細 胞中去除，但細胞內調亡抑制劑的濃度足W在沒有邸應激通路活化的情況下基本干燥儲存 細胞。
[0051 ]如本文所用的，術語"在環境溫度下基本干燥儲存"或"在環境溫度下基本干燥儲 存的"是指采用本發明的制劑、組合物和方法，在沒有冷凍或凍干的情況下將細胞在環境溫 度下儲存，同時使細胞在再水化狀態下保持至少一種功能性質的能力。基本干燥儲存的細 胞不一定需要消除所有的內部自由水，但優選去除至少45%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或最多98%的內部自由水。根據待干燥儲存的細胞的 類型、所使用的預脫水和/或脫水制劑W及基本干燥儲存的細胞的預期用途，可將基本干燥 儲存的細胞在環境溫度下儲存不同的時間段。可將細胞W脫水狀態儲存W下的時間段：1) 數小時，例如，1、2、6、12或18小時；2)數天，例如，1天、2天、4天或6天;3)數周，例如，1周、2周 或3周;4)數月，例如，1個月、2個月、4個月、6個月、8個月或11個月；W及5)甚至數年，例如，1 年、2年、5年、10年、20年或更多年。
[0052] 如本文所用的，術語"固定的"是指粘附于固體表面或與固體表面直接接觸的基本 干燥儲存的細胞。可將細胞在添加脫水制劑和干燥之前固定，或可在預脫水步驟之前固定 并在整個脫水過程中保持固定。合適的固體表面包括但不限于:載玻片、珠子、忍片、膜、片、 網、柱、親和樹脂、海綿、塑料(包括96孔板）、培養皿和燒瓶、管、容器、器皿、天然基質(諸如 但不限于膠原和藻酸鹽水凝膠)或細胞可W借其生長的任何其他基層。
[0053] 如本文所用的，"調亡抑制劑"是指能夠下調、減少、抑制或W其他方式調節所期望 的酶的量和/或活性或通路(優選地在ER應激通路中的步驟)W防止誘導細胞調亡的任何化 合物或試劑，包括ER蛋白伴侶誘導劑、自隧誘導劑W及內源或外源性存活蛋白。對運些酶或 通路的抑制可通過本領域已知的多種機制中的任何機制來實現，該機制包括但不限于:直 接與酶結合(優選W可逆的方式），或者短暫地抑制編碼酶或祀標的基因的表達(例如，轉錄 成mRNA，翻譯成新生多膚，和/或最終多膚修飾成成熟蛋白質）。調亡抑制劑包括本文所述的 具體的調亡抑制劑。
[0054] 如本文所用的，術語"抑制"是指化合物或試劑下調、減少、降低、抑制、滅活或至少 部分地抑制酶的活性或者酶或蛋白質的表達的能力。優選地，該抑制是可逆的。 ER應激通路
[0055] 在某些實施方案中，所述預脫水制劑、脫水制劑和/或再水化制劑包含至少一種調 亡抑制劑，該調亡抑制劑阻斷ER應激通路中的至少一個必要步驟。
[0056] 如圖IA所示，高等真核生物的未折疊蛋白質反應(UPR)信號傳導通過S個近端邸 跨膜傳感器一陽服、激酶/RNA酶IRE巧日轉錄因子ATF6來引發(例如，參見Kaufman RJ(2002) J Clin Invest HO:1389-1398.doi:10.1172/jci0216886；Mori K(2000)Cell 101:451-454.doi:10.1016/s0092-8674(00)80855-7;Ron D，Walter P(2007)化t Rev Mol Cell Biol 8:519-529.(1〇1:10.1038/11^11219)。陽服的活化通過61的〇(〇翻譯起始因子）的憐酸化 導致蛋白質翻譯在整體范圍內的抑制（圖lB;Harding等人，（2000)1〇10611 5:897-904.(1〇1:10.1016/31097-2765(00)80330-5)。與此相伴，陽服通過增加轉錄因子41。4的翻 譯促進UPR特異性基因的轉錄。IRE1通過從XBP1 mRNA上切除內含子產生選擇性剪接的更有 效形式的XBPl (例如，參見Calfon等人（2002)化ture 415:92-96. doi : 10.1038/415092a)。 第SUPR傳感器一ATF6，是一種ER跨膜蛋白質，在其胞質側上具有轉錄激活結構域。
[0057] 如圖2A所示，在邸應激事件中，ATF6經歷蛋白質水解，由此從邸膜釋放其胞質反式 激活結構域。一旦被釋放，該胞質反式激活結構域即進入細胞核化aze等人，（1999)Mol Biol Cell 10:3787-3799.doi :10.1091/mbc. 10.11.3787)并啟動另外的UPR基因的轉錄。 由UPR引起的ER應激的近端傳感器的活化導致復雜的基因調節模式。因此IPR信號旨在通過 上調邸蛋白伴侶如BiP、GRP94、巧網蛋白和化dj4提高蛋白質折疊能力來減輕和減少邸中高 水平的錯折疊蛋白質（例如，參見Okada等人，（2002)Biochem J 366:585-594.doi: 10.1042/bj20020391;Yoshida等人，（1998)J Biol Chem 273:33741-33749.doi :10.1074/ jbc. 273.50.33741)。然而，在邸中的正確蛋白質折疊無法得到恢復的事件中，基因如CHOP 被上調并可導致調亡通路的激活。 l.GRP78/BiP
[0058] GRP78/BiP是內質網完整性和應激誘導的自隧所需的分子蛋白伴侶HSP家族的成 員。GRP78在調節未折疊蛋白質反應化PR)中起核屯、作用，并且是真核細胞中自隧的專性組 分，并可在細胞適應和致癌存活中發揮重要作用。GRP78的一種客戶蛋白質是蛋白質雙鏈 RNA激活的蛋白樣內質網激酶(PE服），并且其與陽服的結合阻止陽服寡聚。GRP78還與客戶 蛋白質IREl和ATF6結合W防止IREl的寡聚和ATF6的活化。GRP78在促進邸內部多聚體蛋白 質復合物的組裝中發揮作用。 2.IREl
[0059] 需要肌醇的酶I(IREl)是一種具有核酸內切酶活性的ser/thr蛋白質激酶。IREl在 作為對基于內質網的應激信號的響應而改變基因表達方面是重要的，并且通過其N末端結 構域感測內質網的網眼中的未折疊蛋白質，從而導致酶的自活化。活性的核糖核酸內切酶 結構域對XBPlmRNA進行剪接W產生新的C末端，從而將其轉化成有效的未折疊蛋白質反應 轉錄激活因子并觸發生長停滯和調亡。激酶結構域通過反式自憐酸化而得到激活，并且激 酶活性對于核糖核酸內切酶結構域的活化是必需的。IREl被廣泛表達且在膜腺組織中觀察 到其高水平。IREl是二硫鍵連接的同二聚體，且二聚體形成由N末端腔結構域內的疏水作用 驅動并通過二硫鍵而穩定化。IREl還與HSPA5(未折疊蛋白質反應的負調節物)結合。該相互 作用可破壞同二聚體化作用并阻止IREl的激活。 3. 陽服
[0060] 真核生物翻譯起始因子2-a激酶3，也稱為P服R樣內質網激酶或蛋白質激酶R(PKR) 樣內質網激酶(PE服），是一種在人類中由EIF2AK3基因編碼的酶。PE服對真核生物翻譯起始 因子2化IF2)的a亞基進行憐酸化，導致其失活，并由此導致翻譯引發的快速減少和對總體 蛋白質合成的抑制。它是位于內質網化R)中的I型膜蛋白，在內質網中它通過由錯折疊蛋白 質導致的ER應激而得到誘導。 4. ATF6
[0061] 運種基因編碼在內質網化R)應激過程中激活未折疊蛋白質反應(UPR)的祀基因的 轉錄因子。雖然它是轉錄因子，但運種蛋白質是不常見的，因為它作為嵌入ER中的跨膜蛋白 質而合成。它起到邸應激傳感器/轉導器的作用