一種用于篩選流感病毒聚合酶組裝抑制劑的細胞系及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種用于篩選流感病毒聚合酶組裝抑制劑用細胞系及其構建方法，屬 于醫藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 流感病毒是一種負鏈RNA病毒，能造成人類急性上呼吸道感染并能致死。季節性流 感影響世界5%-15%的人口，每年造成大約50萬人死亡。流感病毒按照抗原類不同可分為 A、B、CS種血清學上差異明顯的亞型，其中對人類危害最大的是甲型(A型)流感病毒，例如 高致病性禽流感冊N1和H7N9，及2009年出現的化N1的流行造成大量人員死亡[1，2]。
[0003] 目前治療流感的主要方式是疫苗和針對膜蛋白HA和M2的小分子藥物。因為流感病 毒變異非常快，導致無法準確預測將要流行的病毒，因此疫苗有時會錯配，導致保護效果降 低口]。
[0004] 目前治療流感的藥物按作用機制分為兩類:M2離子通道蛋白抑制劑，如金剛燒胺； 和NA抑制劑，如奧司他韋、帕拉米韋、扎那米韋。M2離子通道蛋白抑制劑存在神經毒性，長期 服用易產生耐藥毒株和對B型流感無效等缺陷;而NA抑制劑同樣也存在耐藥性問題，因此尋 找新型的抗流感病毒藥物和途徑勢在必行[4]。
[0005] 甲型流感病毒的基因組是由8條負鏈RNA組成，每條病毒RNA都與核蛋白、RNA聚合 酶亞單位(PB2、PB1、PA)組合形成聚合酶復合物。其中RNA聚合酶亞單位(PB2、PB1、PA)是負 責流感病毒復制和轉錄的重要復合物。該Ξ聚體復合物的有效組裝是流感病毒RNA復制的 限速步驟，對于流感病毒RNA的合成來說至關重要。在進化上，流感病毒聚合酶結構和功能 都非常的保守，針對流感病毒聚合酶的藥物相對于針對表面蛋白的藥物來講具有更好的廣 譜性和耐藥性[5，6]。現在已發現有多種能抑制流感病毒聚合酶組裝的多膚或小分子抑制 劑，譬如PBli-2日，PB1731-巧譜，能分別破壞PA-PB1，PB1-PB2的相互作用，小分子361能破壞PA-PB1的相互作用[7-9]。但研究運些抑制劑的方法都是采用類似CoIP，BiFC或GST pull down 等方法，比較費時費力。
[0006] 另外，天然存在的小分子種類和數量巨大，要想從運些小分子中篩選能有效抑制 流感病毒聚合酶組裝的抑制劑，使用一個高效的篩選方法就很有必要。目前對流感病毒聚 合酶研究主要應用的是流感病毒聚合酶的微型復制系統一表達?82、？81、？4、肥和1?^4報告 基因的細胞。為了更高效的檢測流感病毒的感染或篩選抑制流感病毒復制的抑制劑等，人 們將該RNA報告基因轉到細胞中形成穩定表達細胞系。然而，目前還沒有用于篩選針對流感 病毒聚合酶組裝的小分子抑制劑的細胞系。
[0007] 綜上所述，能用來篩選針對流感病毒聚合酶組裝的抑制劑的細胞系具有廣闊的應 用前景。
[000引 W上【背景技術】中提及的文獻具體分別參考于W下：
[0009] 1. Stamboulian'D.'Bonvehi，Ρ·Ε·，Nacinovich，F.M.&Cox，N.(2000)Influenza, Infect Dis Clin North Am.14,141-66.
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[0011] 3. de Jong,J.C.，Beyer，W.E.，Palache，A.M.，Rimmelzwaan，G.F.&Osterhaus， A.D.(2000)Mismatch between the 1997/1998influenza vaccine and the major epidemic A(H3N2)virus strain as the cause of an inadequate vaccine-induced antibody response to this strain in the elderly，J Med Virol.61,94-9.
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[0013] 5. Reuther'P.，Manz，B.，Brunotte，L.，Schwemmle，M.&Wunderlich，K.(2011) Targeting of the influenza A virus polymerase PB1-PB2interface indicates strain-specific assembly differences，J Virol.85，13298-309.
[0014] 6. Resa-Infante,P.，Jorba，N.，Coloma,R.&Ortin,J.(2011)1^6 influenza virus 民NA synthesis machine: advances in its structure and function,民NA Biol.8,207-15.
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[0016] 8.Ghanem，A.，Mayer，D.，Chase，G.，Tegge，W. Jrank，!？·，Kochs，G.，Garcia-Sastre,A.&Schwemmle,M.(2007)Peptide-mediated interference with influenza A virus polymerase,J Virol.81,7801-4.
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[0018] 10. Morell，M.，Czihal，P.，Hoffmann，R.，0tvos，L.，Aviles，F.X.&Ventura，S. (2008)Monitoring the interference of protein-protein interactions in vivo by bimolecular fluorescence complementation:the DnaK case，Proteomics.8，3433-42.
[0019] 11. Hu，C.D.，Chinenov，Y.&Kerppola，T.K.(2002)Visualization of interactions among bZIP and 民el family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation,Mol Cell.9，789-98.

【發明內容】

[0020] 本發明的目的在于解決上述的技術問題，提供一種篩選流感病毒聚合酶組裝抑制 劑用細胞系構建方法。
[0021] 本發明的目的通過W下技術方案來實現：
[0022] -種用于篩選流感病毒聚合酶組裝抑制劑的細胞系，所述細胞系為可誘導表達 PA/PB1 的 PA/PB1 293(Teton)細胞系。
[0023] -種用于篩選流感病毒聚合酶組裝抑制劑的細胞系的構建方法，所述構建方法包 括如下步驟，
[0024] S1、質粒的構建:構建PA、PB1質粒;通過特異性引物將流感病毒PA、PB1基因進行擴 增，并對擴增產物進行雙酶切，然后通過T4連接酶連接至載體，提取PA、PB1全長質粒；
[00巧]S2、慢病毒表達載體構建:采用Gaussia Luciferase巧光素酶作為報告基因，克隆 到慢病毒載體上；
[0026] S2、慢病毒載體構建:通過克隆技術，將構建好的PA、PB1全長質粒同源到可誘導型 的慢病毒表達載體，形成地iLC3-PA和地iLC2-PBl;
[0027] S3、穩定表達Teton-3G蛋白的293T細胞的構建:將可誘導型基因片段，其序列為 SEQIDN0:5，通過酶切連接至慢病毒載體FG上，轉化至T0P10感受態細胞，標記為FG-Teton-3G，通過 pMDLg/pRRE/，pRSV-Rev，pMD2. GS 質粒系統將 FG-Teton-3G 在細胞內穩定表 達；
[0028] S4、可誘導表達PA/PB1的細胞系構建:將構建好的pBiLC3-PA和pBiLC2-PBl通過Ξ 質粒系統，使PA/PB1穩定整合在293T細胞內，最終形成可誘導表達PA/PB1的PA/PB1293 (Teton)細胞系。
[0029] 優選地，所述S1中PA、PB1基因進行擴增的條件為95°C預變性5min;再進行30個循 環，循環所遵循條件為95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸2.5min，最后采用72°C延伸 lOmin，
[0030] 用于擴增流感病毒聚合酶的特異性引物，所述特意性引物的序列為SEQ ID NO: 1、 沈Q ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4。
[0031] 優選地，所述細胞系用于篩選抑制流感病毒的聚合酶亞單元PA-PBl的相互作用的 抑制劑。
[0032] 本發明的有益效果:能高效的對能夠抑制針對流感病毒聚合酶組裝的抑制劑進行 篩選，W更快的找出所需的抑制劑，大大的提高了效率。
【附圖說明】
[0033] 圖1是?4/?81(2931'，了6扣11)細胞系中0〇義〇7(311116對?4/?81可控誘導表達影響示意 圖。
[0034] 圖2是本發明的細胞系檢測抑制PA-PB1的相互作用的抑制劑效果示意圖。
【具體實施方式】
[0035] 本發明具體掲示了一種設計特異引物將流感病毒的PA、PB1基因從模板WSN33病毒 基因中擴增，所述擴增條件為95°C預變性5min;再進行30個循環，循環所遵循條件為95°C變 性30s，56°C退火30s，72°C延伸2.5min，最后采用72°C延伸lOmin。W上所述引物序列見表1。
[0036] 表1:引物序列表
[0037]
[003引用Notl、AscI (購自肥B公司）雙酶切PCR產物和pEnt巧載體（購自Invitrogen公 司），用T4連接酶(購自肥B公司）連接片段到祀ntry載體上，測序鑒定正確后提質粒保存。 [0039] BiLC(雙分子巧光素酶互補測定)慢病毒表達載體的構建
[0040] BiLC目piBimole州le Luminescence Complementation(雙分子巧光互補）的縮寫， 相對于 BiFC(BimoleculeFluorescenceComplementation)區別是前者使用Luciferase作 為報告基因，后者用GFP或YFP等巧光蛋白作為報告基因[10，11 ]。由于Lucif erase是酶催化 的化學發光反應，靈敏度比GFP單純的激發發光要高很多，使得BiLC方法的靈敏度都比BiFC 高很多。
[0041 ] 首先，將Gaussia luciferase從109位氨基酸的位置分為N端和C端，并將N端的16 個