一種高效易感prrsv的bhk-21細胞系的構建方法
【專利摘要】本發明涉及細胞系構建，具體公開了一種利用PB轉座系統加CAG強啟動子策略制備高效易感PRRSV的BHK?21細胞系的構建方法。本發明通過PiggyBAC轉座系統構建含有pCD163、pCD169和sCD151基因的CDS序列的表達載體，并將所構建載體單獨或者以不同組合轉染導入BHK?21細胞，使BHK?21細胞穩定表達上述基因。本發明通過實驗證實，以pCD163為主的三個受體共表達的轉基因細胞系具有高效感染PRRSV的能力。說明了三種受體聯合作用可以大幅提高不易感細胞對PRRSV易感性，成功獲得了對病毒制備、感染機制研究以及PRRSV疫苗的制備等具有重要應用價值的BHK?21?TTG細胞系。同時也提供了一種具有廣闊應用前景的PRRSV各種易感細胞制備的方法。
【專利說明】
一種高效易感PRRSV的BHK-21細胞系的構建方法
技術領域
[00011本發明涉及細胞系構建，具體地說，涉及一種利用PB轉座系統加 CAG強啟動子策略 制備高效易感PRRSV的BHK-21細胞系的構建方法。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)，俗稱"藍耳病"，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的，以母豬的繁殖障礙以 及各年齡段豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染性疾病，并引起嚴重的免疫抑制。PRRS自1987 年首次報道發現于美國以來，現已遍及世界各主要養豬國家與地區，并已成為危害養豬業 最嚴重的傳染病之一，對全世界的養豬業造成了巨大的經濟損失。
[0003] 2006年在我國爆發并廣泛傳播的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，俗稱無名高熱病，其病原體為高致病性PRRSV(HP-PRRSV)，該毒株在NSP2上存在30個 氨基酸的不連續缺失。HP-PRRS的主要特征包括病豬高熱、高發病率、高死亡率等，并已經造 成我國養豬業的巨大經濟損失，引起了高度重視。
[0004] 由于至今仍沒有治療藍耳病的特效藥，所以疫苗成為控制PRRSV爆發及傳播的有 效方法和主要手段。PRRSV在體內主要感染豬的肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophages，PAM)，在體外能夠感染MARC-145細胞系。體外分離的原代PAM也能高效感染 PRRSV，但由于PAM來源不便及不能體外傳代，MARC-145細胞系成為體外分離PRRSV毒株、制 備PRRSV疫苗和檢測PRRSV病毒滴度的主要細胞系。雖然MARC-145來源的疫苗在預防藍耳病 爆發方面已經起到了很大作用，但也一直存在很多問題，主要表現在：1、PRRSV進入MARC-145方式與PAM不同，導致中和表位改變或被修飾;2、MARC-145細胞不易培養，對PRRSV感染 性不穩定;3、MARC-145細胞不能懸浮培養，限制了PRRSV疫苗的大量生產。
[0005] BHK-21細胞系作為多種病毒的體外繁殖和疫苗生產的工具，具有很多優勢，比如 生長速度快，易培養;經過多次傳代后可懸浮生長;已廣泛用于增殖各種病毒、生產獸用疫 苗。
[0006] 若利用BHK-21細胞系進行PRRSV疫苗的大量生產，特異的受體是使病毒進入細胞 內的首要條件，但目前對如何賦予BHK-21細胞系高效易感PRRSV的能力并沒有研究和報道。

【發明內容】

[0007] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種高效易感PRRSV的 BHK-21細胞系的制備方法。
[0008] 為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0009] 第一方面，本發明提供一種高效易感PRRSV細胞系的構建方法，包括如下步驟：
[0010] (1)構建重組表達載體:將豬源⑶163基因（P⑶163)、豬源⑶169基因（P⑶169)和猴 源⑶151基因（s⑶151)的⑶S序列分別連接到包含1?轉座系統和CAG強啟動子的真核表達載 體上，獲得三種重組表達載體；
[0011] (2)構建高效易感PRRSV細胞系:將步驟（1)獲得的三種重組表達載體，通過共轉染 的方法導入細胞，得到共表達P⑶163、p⑶169和s⑶151基因的轉基因細胞系；
[0012] 所述PCD163基因的CDS序列如SEQ ID No.l所示，所述pCD169基因的CDS序列如SEQ IDNo.2所示，所述sCD151基因的CDS序列如SEQIDNo.3所示。
[0013] 在PAM中發現三個PRRSV受體，分別是硫酸乙酰肝素（HS)、唾液酸凝集素（Sn或 CD169)和CD163分子;在MARC-145上發現與PAM中不同的受體，分別是波形蛋白（vimentin) 和四次跨膜蛋白⑶151分子。
[0014] PCD169在PRRSV入侵細胞過程中僅能發揮粘附和內化的作用，不能介導病毒的脫 衣殼和釋放基因組。而s⑶151具體的作用尚未明確報道，只知其能和病毒的3'UTR相互作用 促進病毒基因組復制。PCD 163在PRRSV感染過程中發揮病毒脫衣殼和釋放基因組的作用，但 大量文獻已明確表明單獨的PCD163能介導病毒實現一個完整的復制周期，說明pCD163本身 可能發揮內化病毒的作用，或者還存在未知的其他粘附受體。
[0015] 本發明首次利用PRRSV不同受體共轉染的方法，證明了以PCD163為主的三個受體 共表達的轉基因細胞系具有高效感染PRRSV的能力。說明了三種受體聯合作用可以大幅提 高不易感細胞對PRRSV的易感性，成功獲得了具有對病毒制備、感染機制研究以及PRRSV疫 苗的制備等具有重要應用價值的細胞系。同時也提供了一種具有廣闊應用前景的PRRSV各 種易感細胞制備的方法。
[0016] 其中，所述步驟(2)中的篩選是通過qPCR實驗、PRRSV感染實驗以及免疫熒光試驗 進行的，目的在于篩選穩定轉染的細胞，其他能實現相似功能的篩選方法也在本發明的保 護范圍之內。
[0017]進一步地，本發明優選以BHK-21細胞作為出發細胞構建細胞系，即所述步驟(2) 為:將步驟（1)獲得的三種重組表達載體，通過共轉染的方法導入BHK-21細胞，得到共表達 pCD163、pCD169 和 SCD151 基因的轉基因細胞系(BHK-21-TTG)。
[0018] 但相似方法亦可用于PK-15、MARC-145等常用于PRRSV研究的細胞系，將上述三個 受體通過共表達實現協同作用效果的同類細胞系均在本發明的保護范圍之內。
[0019] 對于本發明提供的穩定共轉染三受體(P⑶163、pCD169和S⑶151)的轉基因細胞系 BHK-21-TTG可不必再進行篩選，但如利用此方法進行其他相關細胞系的轉染，仍需要利用 相同或相似方法篩選新的高效易感的穩轉細胞系。
[0020] 第二方面，本發明提供一種高效易感PRRSV的BHK-21細胞系，其為共表達PCD163、 PCD169和SCD151基因的轉基因 BHK-21細胞。
[0021] 第三方面，本發明提供一種重組表達載體，其是通過將pCD163、p⑶169或s⑶151基 因的CDS序列連接到包含PB轉座系統和CAG強啟動子的真核表達載體上而獲得。
[0022] 進一步地，將pCD163、pCD169或SCD151基因的CDS序列，構建到包含1?轉座系統質 粒的CAG啟動子和IRES之間。
[0023]本發明的有益效果在于：
[0024]本發明首次利用PRRSV不同受體共轉染的方法，證明了三個受體共表達的轉基因 細胞系具有最強感染PRRSV的能力。本發明通過包含Pi ggyBac轉座元件和CAG強啟動子的質 粒將pCD163、pCD169和SCD151基因的CDS序列導入BHK-21細胞，獲得穩定表達三種受體的 BHK-21轉基因細胞系。
[0025] 分析表明，相對于常用于PRRSV繁毒和制備疫苗的MARC-145細胞系，同時過表達 PRRSV三個受體基因的BHK-21細胞系能夠更高效的感染PRRSV并能產生具感染性的子代病 毒，而且BHK-21比MARC-145具有更優良的培養和生長特性。因此，可以用制備的BHK-21轉基 因細胞系來代替MARC-145進行體外PRRSV的繁殖和疫苗制備，從而可以達到在體外大量、快 速、高效制備PRRSV毒株和疫苗的目的。
[0026] 在本發明提供的技術方案的基礎上，可以利用轉基因等基因工程學的方法，設計 使PRRSV受體基因在小鼠中的表達，從而得到表達PRRSV三個受體的轉基因小鼠，獲得易感 PRRSV的小鼠模型。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明實施例1中分別表達p⑶163、p⑶169和s⑶151的載體示意圖；
[0028]圖2為本發明實施例2中檢測受體轉基因細胞系外源基因 mRNA和蛋白的表達；其 中：
[0029] 圖2a為四種轉基因細胞系所有克隆點的外源基因 mRNA的相對表達量檢測；
[0030] 圖2b為BHK-21-DTG2和BHK-21-TTG細胞的綠色熒光圖片；
[0031] 圖 2c 為免疫熒光技術檢測冊1(-21-5了6、8服-21-0了61、8冊-21-0了62和冊1(-21-1'丁6 中p⑶163和p⑶169蛋白的表達；
[0032] 圖2d為免疫熒光技術檢測BHK-21-DTG2和BHK-21-TTG中SCD151蛋白的表達。
[0033]圖3為本發明實施例3中各轉基因細胞系對PRRSV感染能力的比較;其中：
[0034]圖 3a 為選取的冊1(-21-5了6、8冊-21-0了61、8服-21-0了62和冊1(-21-1^6單克隆細胞 中外源基因的mRNA表達量檢測；
[0035] 圖3b為各轉基因細胞系和對照的野生型fflK-21細胞系在感染CH-la和JXwn06 36hpi時細胞內的病毒N蛋白的免疫熒光檢測結果；
[0036] 圖3c為各轉基因細胞系和對照的野生型BHK-21細胞系12hpi和24hpi時胞內的 PRRSV粒子定量；
[0037] 圖3d為各轉基因細胞系和對照的野生型BHK-21細胞系12hpi和24hpi時細胞上清 液中的PRRSV粒子定量；
[0038] 圖4為BHK-21-TTG和MARC-145細胞對PRRSV感染能力的比較;其中：
[0039] 圖4a為BHK-21-TTG和MARC-145細胞接種CH-la或JXwn06毒株36h后細胞內PRRSV的 N蛋白的免疫熒光檢測結果；
[0040] 圖4b為在不同的接毒劑量下BHK-21-TTG和MARC-145細胞接種CH-la或JXwn06毒株 12h、24h和48h細胞內病毒的定量PCR結果；
[0041 ]圖 4c 為 BHK-21-TTG 和 MARC-145 細胞接種 CH-la 或 JXwn06 毒株后 12h、24h 和 48h 后細 胞上清液中病毒粒子的定量PCR結果；
[0042] 圖4d為BHK-21-TTG和MARC-145細胞釋放出的病毒粒子感染MARC-145的免疫熒光 檢測；
[0043] 圖4e為BHK-21-TTG和MARC-145細胞繁殖的PRRSV滴度檢測 [0044] 各圖中BHK-21細胞作為對照。
【具體實施方式】
[0045] 下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技 術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0048]實施例1 PRRS受體基因真核表達載體的構建
[0049] 1 ·分別設計針對pCD163基因（GenBank登錄號為EU016226 · 1)、pCD169(GenBank登 錄號為NM_214346.1)和SCD151基因（GenBank登錄號為NM_001032822.1)的引物，利用反轉 錄PCR技術反轉錄mRNA并擴增得到上述3個基因的CDS序列，引物序列如下：
[0065]其中，上述上游引物中標記下劃線的序列是Mlul酶切位點，與載體骨架上的CAG啟 動子序列末端相連，下游引物中標記下劃線的序列是Notl酶切位點，用于與載體上的IRES 的5 '端相連。以PAM細胞基因組DNA為模板，利用上述引物分別擴增得到pCD163和pCD169的 帶酶切位點的全長CDS序列；以MARC-145細胞基因組DNA為模板，利用上述引物擴增得到 SCD151的帶酶切位點的全長CDS序列。純化PCR產物并測序驗證正確后，酶切連接到載體骨 架上。所用載體骨架為本實驗室保留的帶有不同篩選標記的PB-psp72-CAG載體(簡稱為PB-pCAG)，構建的各載體示意圖如圖1所示，其中：
[0066] PB-pCAG_pO)163-neo質粒為表達pCDl 63的質粒，同時攜帶neomycin (neo)篩選基 因；
[0067] ?1?1〇461〇)1691111'〇質粒為表達。0)169的質粒，同時攜帶。111'〇1115^;[11(。111'0)篩選 基因；
[0068] PB-pCAG-s⑶151-EGFP質粒為表達s⑶151的質粒，同時攜帶EGFP篩選基因；
[0069] 2、通過常規轉化法分別轉化上述3個載體、涂板，待單菌落長成后，挑取數個擴大 培養并測序。測序驗證正確，說明本發明成功構建3個整合PB轉座系系統的PRRSV受體表達 載體。
[0070] 3、陽性單菌落擴大培養
[0071] 測序正確的克隆進行擴大培養，具體步驟為:a、初始培養，用槍頭挑取陽性單菌 落，加入盛有5ml LB培養基(胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g溶于1L蒸餾水中）的滅 菌管中，37 °C，220rpm，培養8h至12h; b.擴大培養，將過夜培養液按體積1:500的比例轉移到 盛有100ml LB培養基的滅菌三角瓶中，37°C，220rpm，培養12h至16h。
[0072] 4、質粒去內毒素大提
[0073] 按照質粒去內毒素大提試劑盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)上提供的方法，提 取上述3個表達PRRSV的質粒，所提的質粒用于細胞的轉染。
[0074]實施例2轉基因陽性細胞單克隆的篩選及鑒定 [0075] 1、細胞轉染及篩選
[0076]細胞轉染采用Lonza Nucleofector電轉儀進行電轉。具體流程如下：a.將消化并 收集的6孔細胞培養板中一個孔的BHK-21細胞(約1 X 106個），將試驗質粒分別和TOase質粒 混合（試驗質粒為PB-pCAG-pCD 163-neo、PB-pCAG-pCD 169-puro和PB-pCAG-sCD 151-EGFP，用 量和組合方式見表1)，取總質量3.2yg的質粒和100μ1 Nucleofector試劑混勾，裝入電擊杯 用FF-137程序進行電擊轉染;b.電擊結束后，沿電擊杯內壁緩慢加入37°C預熱的細胞培養 基（10 % FBS+DMEM) 500yL，按照10倍倍比稀釋的方法稀釋電轉后的細胞，分別稀釋1 0-1、10 ―2、10-3、10-4、10- 5、10-6 6個梯度后，將各梯度細胞都鋪于10cm培養皿中。c ·用無篩選藥物的 細胞培養基（10%FBS+DMEM)于37°C，5%⑶2培養箱培養。d. 12h后細胞貼壁，將各轉基因細 胞系培養基按表1中所示更換為含相應抗生素的細胞培養基（10%FBS+DMEM)，其中轉染PB-pCAG-pCD163-neo 質粒的細胞加入700yg/mL 的 G418 抗生素，轉染 PB-pCAG-pCD169-puro 質粒 的細胞同時加入2yg/mL的puromycin抗生素。e.每兩天換一次培養基，培養基仍然為含相應 抗生素的細胞培養基。細胞培養7-9天后，可以觀察到10- 4和10-5兩個梯度下有細胞單克隆 點形成。在顯微鏡下找到抗性細胞克隆點，用常規挑取單克隆的方法挑取單克隆細胞。f.將 挑取的單克隆細胞接種到48孔細胞培養板中培養。待細胞匯合度達到80 %時，消化細胞，接 種到12孔細胞培養板中繼續培養，細胞繼續擴大培養至六孔細胞培養板，進行傳代及后續 的陽性細胞單克隆鑒定工作。
[0077] 表 1
[0078]
[0079] 表示未轉染相應的質粒
[0080] 2、陽性細胞單克隆的鑒定
[0081 ] BHK-21-STG挑取16個單克隆，BHK-21-DTG1挑取14個單克隆，BHK-21-DTG2挑取6個 單克隆，BHK-21-TTG挑取9個單克隆。
[0082]利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術鑒定四種細胞系中目的基因的表達情況，BHK-21細胞作為對照，如圖2a所示，四種細胞系的所有克隆點在mRNA水平均有外源基因的表達， 且表達量高低不同。由于PB-pCAG-sCD151-EGFP質粒有EGFP(增強型綠色熒光蛋白）序列（圖 1)，所以該質粒轉染的BHK-21-DTG2和BHK-21-TTG細胞系在熒光顯微鏡下均可觀察到綠色 熒光（圖2b)。利用免疫熒光實驗檢測各細胞系中目的蛋白的表達情況，圖2c所示為pCD163 與pCD 169在BHK-21-STG、BHK-21-DTG1和BHK-21-TTG中的表達情況，BHK-21細胞作為陰性對 照，結果顯示上述三種轉基因細胞系中均有PCD163的表達，BHK-21-DTG2和冊K-21-TTG細胞 中有PCD169的表達；圖2d所示為SCD151在M1K-21-DTG2和BHK-21-TTG細胞中的表達檢測，結 果表明這兩種細胞系中均有SCD151的表達。綜上，挑取的所有克隆在mRNA水平和蛋白水平 均表達了外源基因，可以確定為陽性細胞單克隆。
[0083]本實施例實驗操作中包含：
[0084] RNA的提取、反轉錄和熒光實時定量PCR:
[0085] 1)總RNA的提取
[0086]總RNA的提取是用Invitrogen公司生產的TRIzol試劑，并嚴格按照產品說明書要 求進行操作。
[0087] 2)反轉錄 PCR
[0088]反轉錄所采用的是MMLV逆轉錄DNA聚合酶并嚴格按照Promega公司的說明書要求 進行操作。
[0089] 3)利用熒光實時定量PCR技術檢測PRRSV 0RF7的表達情況
[0090] 熒光實時定量PCR:
[0091]儀器型號：Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀
[0092] 試劑盒:Roche公司生產的SYBR Green I，并按照產品說明書操作。
[0105]反應體系：
[0106] 2XSYBR Green mix:10yL
[0107] Primer-F:0.3yL
[0108] Primer-R:0.3yL
[0109] DNA 模板：5yL
[0110] ddH20:4.4yL
[0111] 目的基因相對表達量分析方法：
[0112] 2-ACt方法：Δ =
[0113]細胞免疫熒光實驗，具體操作如下
[0114] 1)固定：吸去細胞培養液，PBS洗兩次，加甲醇：丙酮=1 : 1固定液4°C固定細胞 15min〇
[0115] 2)透化：棄去固定液，PBS清洗3次，每次5min，然后用0.1%的1^如1^-100透化 15min〇
[0116] 3)封閉：棄去透化液，PBS清洗3次，每次5min，然后用1 %的BSA封閉細胞30min。
[0117] 4)一抗孵育：分別用含pCD163抗體（鼠源單抗，2A10/11，AbD Serotec公司，美國）、 pCD169抗體(兔源多抗，金斯瑞公司制備，中國）、sCD151(鼠源單抗，llG5a，AbD Serotec公 司，美國）的抗體的封閉液孵育細胞lh。
[0118] 5)二抗孵育：吸去一抗孵育液，PBS清洗3次，每次5min，然后用不同熒光標記的二 抗孵育細胞lh。
[0119] 6)染核:棄去二抗孵育液，PBS清洗3次，每次5min，封閉液1: 3000稀釋DAPI，室溫孵 育3min。
[0120] 7)觀察熒光:棄去DAPI染液，PBS清洗3次，每次5min。在熒光顯微鏡下觀察熒光。
[0121] 實施例3不同受體轉基因細胞系對PRRSV感染能力的鑒定
[0122] 1、選取不同受體轉基因系中p⑶163表達一致的克隆
[0123] 由于pCD163對引發PRRSV的感染是必不可少的受體，所以為了保證每種細胞系都 能引發感染，實施例2中每種轉基因細胞系中都有pCD163的表達；同時為了鑒定pCD169和 SCD151對PRRSV引發感染貢獻，根據實施例2中圖2a檢測的四種轉基因細胞系中mRNA定量結 果，本實施例選取各轉基因細胞系中pCD163，p⑶169和SCD151表達水平一致的一個克隆點 進行后續的攻毒實驗。攻毒之前，利用qPCR方法進一步確認所選的四個克隆點受體基因的 表達情況，如圖3a所示四個單克隆細胞中相應的外源基因表達水平是相似的。
[0124] 2、對各轉基因細胞系進行攻毒實驗
[0125] 將本實施例步驟1篩選出的受體表達水平一致的BHKH-STGJHKH-DTGUBHK-Sl-DTGS 和 BHK-21-TTG 四種轉基因細胞系和對照的野生型 BHK-21 細胞鋪于 24 孔板中 ，每組 實驗每種細胞鋪3個孔，作為平行對照，每個孔鋪IX 105個細胞，用于攻毒實驗。每個孔按 Μ0Ι = 1接種PRRSV傳統毒株CH-la和高致病毒株JXwn06病毒，待病毒液與細胞孵育2h后，換 成無血清的DMEM培養基。在36hp i時細胞用預冷的甲醇：丙酮=1:1固定液固定，對PRRSV病 毒衣殼蛋白N蛋白進行免疫熒光檢測。結果分別如圖3c所示，均能在四種細胞系中檢測到病 毒粒子，表明外源基因的表達發揮了介導病毒進入細胞內的作用。為了檢測病毒在轉基因 細胞系內的復制情況，按照上述接種病毒方法，四種細胞系接種CH-la和JXwn06病毒(Μ0Ι = 0.5)，分別在感染病毒12h和24h后收取細胞和上清液進行qPCR分析。如圖3c所示，在感染兩 個毒株12h后，BHK-21-DTG1和BHK-21-DTG2比BHK-21-STG胞內含有更多的病毒粒子，但在接 種JXwn06組未達到顯著水平，而BHK-21-TTG在接種兩種毒株后，胞內病毒量均顯著尚于其 他三種轉基因細胞系。并且由于在24hpi時病毒復制循環數多于12hpi，所有細胞內病毒量 在24hpi時均比12hpi時增加，并且BHK-21-TTG增加的程度最強。上清液中病毒定量結果顯 示感染JXwn06或CH-la后，表達兩個受體的轉基因細胞系釋放出比只表達pCD163的細胞系 更多的病毒粒子，但均未達到顯著水平，而共表達三個受體的細胞系釋放出的病毒粒子顯 著多于另外三個細胞系（圖3d)。綜合上述實驗結果，說明病毒在BHK-21-DTG1和BHK-21-DTG2中的復制效率和釋放到上清液中的子代病毒粒子數量略微高在BHK-21-STG細胞，而 BHK-21-DTG1和BHK-21-DTG2這兩種細胞系之間在這些方面幾乎不存在差異，但是同時表達 p⑶163、pCD169和s⑶151三個受體基因的細胞系，病毒在胞內的感染效率和釋放到上清液 中的病毒粒子數均顯著高于另外三個轉基因細胞系。
[0126] 本實施例中涉及到的免疫熒光實驗和RNA提取、反轉錄、相對定量PCR等實驗操作 和方法按實施例2中描述的進行。涉及到的其他材料、試劑與操作如下：
[0127] 1)細胞內PRRSV定量PCR的內參基因為實施例2中的BHK-21細胞的GATOH，定量引物 如實施例2中所列。
[0128] 2)PRRSV 0RF7 引物為：
[0129] 上游引物 0RF7-F: AATAACAACGGCAAGCAGCA;
[0130] 下游引物0RF7-R: GCACAGTATGATGCGTCGGC。
[0131] 細胞內0RF7相對表達量分析方法：
[0132] 2 AACt方法：Δ Ct = CtciRF7-CtGAPDH
[0133] Δ Δ ct = Δ Δ CtBHK-21纖
[0134] 3)上清液中病毒粒子拷貝數檢測：
[0135] 細胞上清液中病毒RNA的提取參照Qiagen的QIAamp R〕v丨rus kits使用說明；
[0136] 用含有0RF7序列的pJET1.2載體質粒10倍倍比稀釋作模板進行qPCR制作標準曲 線，得到Ct值與拷貝數的計算公式;根據計算公式和上清液中病毒cDNA的Ct值計算上清液 中病毒粒子的拷貝數。
[0137] 實施例4 BHK-21-TTG細胞系與MARC-145細胞系對PRRSV感染能力的比較
[0138] 將BHK-21-TTG細胞系和MARC-145細胞以及對照的野生型BHK-21細胞鋪于24孔板 中，每組實驗每種細胞鋪3個孔，作為平行對照，每個孔鋪1 X 105個細胞，用于攻毒實驗。
[0139] 三種細胞接毒以后本實施例分三部分對其細胞感染性進行比較。
[0140] 第一部分:細胞內病毒粒子含量的比較
[0141] 本實驗分別用CH-la和JXwn06接種細胞，為了直觀比較病毒在BHK-21-TTG細胞與 MARC-145細胞胞內復制情況，在接毒36h后固定細胞，利用免疫熒光技術對細胞中的PRRSV 進行染色，結果顯示，無論是感染CH-la還是JXwn06，均是BHK-21-TTG胞內顯示出有更多的 病毒粒子（圖4a)。為了更精確的比較病毒在兩種細胞系中的復制，本文接著采用了qPCR的 方法驗證了胞內的病毒量。兩種細胞和BHK-21對照細胞分別接種不同劑量的CH-la或 JXwn06(M0I = 0.1和Μ0Ι = 1)，分別在感染12h，24h和48h后收取細胞進行qPCR分析。結果顯 示，無論是感染CH-la還是JXwn06,在兩個攻毒劑量下，BHK-21-TTG胞內的病毒量均顯著高 于MARC-145細胞內的，并且隨著時間的延長，病毒復制循環數增加，這一差異更加明顯（圖 4b) 〇
[0142] 第二部分:上清液中病毒粒子拷貝數和感染性分析
[0143] M0I = 1接毒，收取感染后不同時間點的細胞上清液，提取RNA進行反轉錄，利用絕 對定量PCR的方法檢測不同時間點細胞上清液中的病毒量來分析其動態變化。BHK-21-TTG 細胞在病毒感染后在不同的時間點（12hpi、24hpi和48hpi)均能檢測到上清液中的病毒粒 子，并且含量高于MARC-145細胞（圖4c)。
[0144] 為了進一步檢測釋放出的子代病毒是否具有感染性，接著將收集的BHK-21-TTG細 胞上清液感染MARC-145細胞，同時用收集的MARC-145的上清液作為陽性對照、BHK-21上清 液作為陰性對照。在接毒后36h，固定MARC-145細胞，通過免疫熒光技術檢測細胞內PRRSV的 感染。結果顯示，BHK-21-TTG產生的子代CH-la或JXwn06均比MARC-145產生的病毒粒子更 (圖4d)。本實驗說明BHK-21-TTG細胞能夠釋放出在胞內復制后的病毒粒子，并且子代病毒 的數量比MARC-145釋放的子代病毒更多。
[0145] 第三部分:繁殖病毒的滴度分析
[0146] 病毒滴度測定是檢測胞內和胞外具有感染性病毒總量的一個標準，產生的病毒滴 度的高低是評價細胞易感性的一個關鍵指標。滴度測定是通過將感染病毒的細胞連同培養 液反復凍融后使細胞破裂釋放出胞內的病毒粒子，再經過離心后使細胞碎片沉淀，測定含 有病毒的上清液的中具有感染性病毒粒子數量的方法。本文用1 m L初始滴度為5 X 106TCID50的JXwn06感染T-25培養瓶中的BHK-21-TTG和MARC-145細胞，在感染后72h將培養 瓶放-80°C凍5h，然后放4 °C融化，如此反復3次，將凍融物離心后收取上清液即為病毒液。結 果表明，BHK-21-TTG細胞繁殖的病毒滴度顯著高于MARC-145繁殖出的病毒滴度（圖4e)。
[0147] 本實施例中涉及到的免疫熒光實驗和RNA提取、反轉錄、胞內定量PCR等實驗操作 和方法按實施例2中描述的進行，上清液中病毒拷貝數檢測操作和方法按實施例3中描述的 進行，涉及到的其他材料、試劑與操作如下：
[0148] (1 )MARC-145細胞進行PRRSV定量PCR的內參為猴GAPDH，定量引物為：
[0149] 上游引物QsGAPDH-F: 5' -TCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3' ；
[0150] 下游引物QsGAPDH-R: 5 ' -ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3 '。
[0151] (2)病毒滴度測定實驗
[0152] 1)選擇生長旺盛的MARC-145細胞，消化、離心后，用DMEM生長培養基(含10%FBS和 1 %雙抗)重懸細胞沉淀，用細胞計數板計數，使細胞終濃度為2 X 105個/mL左右；
[0153] 2)加入100yL細胞懸液鋪到96孔細胞培養板中，相當于每孔約2X 104個細胞;放在 細胞培養箱中培養12~24h，待細胞長到80~90 %匯合度時準備接毒；
[0154] 3)準備8個1.5mL無菌離心管，每管加入900yL DMEM維持液培養基(含2%FBS和1% 雙抗），將1〇〇此病毒原液加入第一個管中，標注ΠΓ1，接下來依次從上一個管中吸100yL加入 下一個管，如此做10倍倍比梯度稀釋(從ΠΓ 1稀釋到ΚΓ8);
[0155] 4)在96孔細胞板上預先標記好稀釋倍數和對照細胞孔。然后將96孔板中的培養液 吸棄并接種病毒。從稀釋倍數最高（ΠΓ 8)的病毒液開始，由高到低接種病毒，每個梯度的病 毒接種8個孔。每棄去同一個梯度的細胞培養液后，立即加入該稀釋倍數的病毒液；
[0156] 5)然后再吸棄下一個梯度的培養液，再加入該稀釋倍數的病毒液。以此類推。同時 至少設置5個孔的細胞只加細胞維持液，不加病毒液，作為不感染病毒的對照；
[0157] 6)將培養板放在37°C、5%C02培養箱中培養，逐日觀察細胞病變狀態并做記錄，一 般這個過程需要4~5天；
[0158] 7)4~5天后統計每個梯度的細胞病變的孔數，用Reed-Muench的方法進行計算 TCID50,方法如下：
[0159] A)距離比例=(大于50% - 50% )/(大于50% -小于50% );
[0160] B)log TCID50 =距離比例X稀釋度對數之間的差(稀釋10倍為-1)+高于50%病變 率的稀釋度的對數。
[0161]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種高效易感PRRSV細胞系的構建方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 構建重組表達載體:將pCD163、pCD169和SCD151基因的CDS序列分別連接到包含I3B 轉座系統和CAG強啟動子的真核表達載體上，獲得三種重組表達載體； (2) 構建高效易感PRRSV細胞系:將步驟（1)獲得的三種重組表達載體，通過共轉染的方 法導入細胞，得到共表達P⑶163、p⑶169和s⑶151基因的轉基因細胞系； 所述PCD163基因的CDS序列如SEQ ID No.l所示，所述pCD169基因的CDS序列如SEQ ID No.2所示，所述SCD151基因的CDS序列如SEQ ID No.3所示。2. 根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中，通過qPCR實驗、PRRSV 感染實驗以及免疫熒光試驗進行篩選。3. 根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)為:將步驟（1)獲得的三 種重組表達載體，通過共轉染的方法導入BHK-21細胞，得到共表達p⑶163、pCD169和s⑶151 基因的轉基因細胞系。4. 一種高效易感PRRSV的BHK-21細胞系，其特征在于，其為共表達pCD163、pCD169和 s⑶151基因的轉基因 BHK-21細胞。5. -種重組表達載體，其特征在于，其是通過將pCD163、p⑶169或SCD151基因的⑶S序 列連接到包含PB轉座系統和CAG強啟動子的真核表達載體上而獲得。6. 根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于，將pCD163、p⑶169或SCD151基因 的⑶S序列，構建到包含PB轉座系統質粒的CAG啟動子和IRES之間。
【文檔編號】C12N15/12GK105886530SQ201610208177
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月6日
【發明人】李寧, 張林林, 于舒洋, 戴蘊平, 李笠
【申請人】中國農業大學