抗Ki67蛋白單克隆抗體及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及可特異結合Ki67蛋白的單克隆抗體 UMAB107,產生所述單克隆抗體的細胞株，及應用該抗體用于診斷的方法和用途。
【背景技術】
[0002] Ki67是一種大分子蛋白質，存在于細胞核內，由兩條肽鏈組成，相對分子量分別 為345kDa和395kDa。Ki67抗原是1983年由Gerdes等人確定的，他們首次利用霍奇金淋 巴系IA28細胞核對小鼠進行免疫，制備出了 Ki67抗體。由于當時的實驗地點為德國的城 市kiel，并且由于Ki67抗體所用的組織培養板編號是67號，故被命名為Ki67。1993年， Schluter等得出其氨基酸序列，發現他包含有40個弱的和10個強的PGST區（富含脯氨 酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）。PGST區很不穩定，是蛋白容易降解的部位，故Ki67對蛋白酶 非常敏感，這使Ki67的半衰期比較短，約為lh，所以Ki67不容易被分離、提取。
[0003] Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關。Ki67可以識別 除G0期以外的G1、S、G2和Μ期的細胞。Ki-67增殖指數高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤、 轉移以及預后密切相關。Ki67在細胞增殖中是不可缺少標記，是目前已知的增殖抗原中最 具增殖能力代表性、應用最廣泛的增殖細胞標記之一。因此廣泛用于各種惡性腫瘤的標記， 在惡性腫瘤早期診斷、治療及選擇方法、治療療效的評估和判斷預后中存在巨大潛力。
[0004] Ki67作為增殖標記物抗原在疾病，特別是腫瘤的研究中有廣闊的應用前景，是目 前國內外研究的熱點。在乳腺癌方面的研究中，健康乳腺組織可以表達Ki67的水平很低 (〈3%的水平），乳腺癌的Ki67表達大約為78%。在乳腺癌中，腫瘤大小、組織學分級、淋巴 結轉移、病理分期等臨床病理因素對于乳腺癌患者預后的影響很大。Ki67能可靠反映出乳 腺正常組織和病變組織的增殖活性，Ki67還可以通過與ER、PR、053、C. erbB-2的聯合檢測， 更好地評估乳腺癌的生物學行為及增殖活性，可以更精確的幫助臨床醫師進行乳腺癌的高 危、復發和轉移因素的分析，為臨床個體化治療提供更多的理論依據。
[0005] 目前臨床上通常通過免疫組織化學（IHC)病理實驗檢測腫瘤細胞中Ki67的表達 狀況。IHC實驗的核心為特異性結合Ki67的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定著整個檢 測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的針對Ki67蛋白的單克隆抗體具 有重要的意義。

【發明內容】

[0006] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種結合特異性較高的Ki67蛋白的單克隆抗 體，及其在制備用于檢測Ki67蛋白的免疫檢測工具中的應用。
[0007] 本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏日期為2014年8月22日，保藏編號為CGMCC No. 9574。
[0008] 本發明還提供了一種特異性結合Ki67蛋白的單克隆抗體UMAB107,由上述雜交瘤 細胞株產生。
[0009] 本發明所述單克隆抗體的制備方法如下：
[0010] (1)重組表達載體的構建：通過基因合成的方式合成Ki67的第1160-1493位氨基 酸的核苷酸序列并引入酶切位點Sgfl、Mlul，通過Sgfl和Mlul兩個酶切位點將目的序列 連接到載體pET23a-N-His上，構建Ki67重組表達質粒；
[0011] (2)Ki67重組蛋白的表達與純化：將Ki67重組表達質粒轉化大腸桿菌Rosetta PlysS，表達純化，獲得純化的Ki67重組蛋白；
[0012] (3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的Ki67重組蛋白免疫B6/C57小鼠， 取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤 細胞，獲得能分泌抗Ki67特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為UMAB107,亞型鑒定為IgG2a ; 制備小鼠腹水，通過親和層析柱純化Ki67單克隆抗體。分別通過Western Blot、免疫組化 實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。
[0013] 進一步采用OriGene高密度蛋白芯片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證：
[0014] OriGene高密度蛋白芯片上包含10, 000個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種 蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘 蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣， 每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反 應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。
[0015] 本發明將所述單克隆抗體UMAB107與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯 示：本發所述明單克隆抗體UMAB107特異性結合Ki67蛋白，而與其他蛋白無交叉反應。
[0016] DAK0公司的MIB1抗體是目前臨床免疫組化（IHC)應用的"金標準"抗體，本發明 采用免疫組化的方法分別以本發明制備的Ki67單克隆抗體UMAB107和DAK0公司的MIB1抗 體為一抗，對人的扁桃體、乳腺癌和直腸組織進行染色，比較UMAB107與MIB1的靈敏度，結 果顯示UMAB107和MIB1在人的扁桃體、乳腺癌和直腸組織中的染色模式和染色強度一致， 說明二者在染色特性上沒有差別。為UMAB107替代MIB1應用臨床診斷提供了有力的證據。
[0017] 同時采用免疫組化的方法分別以本發明制備的Ki67單克隆抗體UMAB107和DAK0 公司的MIB1抗體為一抗，對鼠直腸組織進行染色，比較UMAB107與MIB1的靈敏度，結果顯 示UMAB107能檢測到鼠直腸中的Ki-67的表達，而MIB1則不能，說明本發明制備的Ki67單 克隆抗體UMAB107能同時識別人源和鼠源的KI-67,而MIB1不識別鼠源KI-67。
[0018] 進一步分別以本發明制備的Ki67單克隆抗體UMAB107和DAK0公司的MIB1抗體 為一抗，按照所述免疫組化的方法檢測629份臨床病理組織樣本中的細胞增殖核抗原標記 指數（燈67-1^1)，結果顯示1]嫩8107在95%的樣本中的燈67-1^都高于[81。綜上所述說 明本發明所述Ki67單克隆抗體UMAB107優于MIB1抗體。
[0019] 本發明還提供了單克隆抗體UMAB107在制備用于檢測Ki67蛋白的免疫檢測工具 中的應用。
[0020] 具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。
[0021] 在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗 體UMAB107 ;可檢測組織細胞中Ki67的表達狀況。
[0022] 本發明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。
[0023] 其中所述腫瘤具體是指腫瘤細胞的增殖與Ki67的表達密切相關的腫瘤。包括但 不限于乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌或頭頸腫瘤。
[0024] 與現有技術相比，本發明提供了一種雜交瘤細胞株（保藏編號為CGMCC No. 9574)，以及由此雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體UMAB107。本發明還提供了單克隆抗體 UMAB107在制備用于檢測Ki67蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體UMAB107的免 疫組化試劑盒，以及單克隆抗體UMAB107在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。本發明 所述單克隆抗體可與Ki67蛋白特異性結合，而與細胞內其他蛋白無交叉反應，顯著提高了 Ki67蛋白免疫檢測的特異性和可靠性，廣泛適用于用于各種腫瘤的標記。
[0025] 保藏信息
[0026] 用于保藏的雜交瘤細胞株UMAB107的分類命名為：Ki67鼠單克隆抗體的雜交瘤細 胞株；
[0027] 保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0028] 保藏單位簡稱：CGMCC ;<