IL-12/CD107a融合蛋白增強CTL抗腫瘤效果的治療劑及其制法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥領域，具體地涉及一種基于IL-12膜迀移瞬時表達的高效低毒的 腫瘤治療劑及其制法和用途。
【背景技術】
[0002] IL-12是一種非常重要的免疫刺激因子。IL-12是由共價鍵鏈接的異質性二聚體細 胞因子，由P35和p40亞基組成，在體內由激活的免疫細胞分泌。IL-12是重要的細胞免疫調 控因子，在抗感染免疫及惡性腫瘤的免疫中通過NK細胞以及CTL發揮作用。
[0003] 雖然IL-12具有顯著的抑瘤效果，但是由于其系統性全身給藥會引起全身性毒副 反應，因而受到極大的限制。在本發明之前，IL-12的臨床應用由于其所誘導的全身性毒副 作用，以及早期臨床試驗通過全身系統性給藥引起的兩例患者的意外死亡，使其臨床應用 受到大大的限制。
[0004] 為了避免全身性給藥的毒副作用從而實現臨床應用的目的，臨床科研工作者們通 過腫瘤局部注射、瞬時表達及多點注射等途徑應用于腫瘤的臨床試驗，但是由于IL-12的治 療效果同回輸的IL-12的劑量直接相關，上述局部的臨床方案并未有取得顯著的抑瘤效果。
[0005] 為了解決這一問題，本發明人曾經試圖通過基因修飾抗腫瘤T細胞持續分泌IL-12 來實現抗腫瘤效果的最大化，但是由于未知的原因（一種可能的原因是IL-12的毒副作用） 通過持續分泌IL-12方案基因修飾的T細胞在體外不能有效擴增，并引起大量的T細胞凋亡。 [0006]腫瘤已經成為超越心血管疾病危害人類健康的第一殺手，本領域尚缺乏高效且低 毒副作用的基于IL-12的抗腫瘤藥物。因此，本領域迫切需要開發高效且低毒副作用的腫瘤 治療藥物。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的就是提供了一種高效且毒副作用低的腫瘤治療藥物及其制法和應 用。
[0008] 本發明構建了一系列IL-12/CD107a的融合蛋白，包括IL-12的全序列（包括IL-12 的分泌片段），及在IL-12的C-端與⑶107a的N-端加入一個鏈接肽段(SGSG)分別同⑶107a 的全長序列及去掉分泌肽的CD107a連接的分子策略。實驗數據顯示，上述兩種融合蛋白基 因修飾抗腫瘤CTL后，可以增強體內外的抗腫瘤反應，其中無分泌肽的CD107a融合蛋白不但 可以顯著延長荷瘤小鼠生存，同時對基因修飾的抗腫瘤T細胞的體外擴增沒有明顯的毒副 作用，是一種非常有臨床應用前景的抗腫瘤增效方案。
[0009] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0010] 圖1.抗腫瘤CTL表達融合蛋白hscIL-12/CD107a的增效分子機制示意圖。CD107a (又稱為LAMP1)是一種表達于溶酶體上的跨膜蛋白，它的N-端位于溶酶體腔囊一側，C-端是 一小段肽段，朝向胞漿一側，當抗腫瘤T細胞在識別腫瘤抗原時，溶酶體與T細胞膜融合而發 生T細胞或NK細胞的脫顆粒效應，即T細胞或NK細胞釋放效應分子顆粒酶(Granzyme B)及穿 孔素(perforin)而達到殺傷腫瘤細胞的過程。在T細胞與腫瘤T細胞發生反應的時，CD107a 迀移到T細胞膜上的特性已經被廣泛地應用于反映 T細胞殺傷功能的一個指標。如圖左側所 示，當抗腫瘤T細胞識別腫瘤的同時，T細胞內的溶酶體向胞膜一側迀移并融合，CD107a分子 暴露于細胞膜外，并可以檢測，標示為CD107a陽性細胞。如圖右側所示，為了實現IL-12的溶 酶體囊內表達，本發明構建了一系列IL-12/⑶107a的融合蛋白，包括IL-12的全序列(包括 IL-12的分泌片段）及在IL-12的C-端與⑶107a的N-端加入一個鏈接肽段分別與全長的 ⑶107a分子及去除分泌肽段的⑶107a分子融合，當T細胞識別腫瘤細胞時，IL-12分子通過 CD107a迀移到T細胞膜表面，實現抗腫瘤的增效反應。
[0011] 圖2.hscIL-12/⑶107a融合蛋白系列的構建及轉導抗腫瘤T細胞介導的表達。A.慢 病毒表達IL-12/CD107a融合蛋白系列載體的構建。通過第三代慢病毒載體表達融合蛋白， 所選用的啟動子為MSCV及EF-la，已經被廣泛地應用于人體的腫瘤免疫細胞治療，具有表達 的穩定性及安全性，表達基因構件可以替代為需要表達的基因，即MART-1TCR以及IL-12/ 0)107a融合蛋白系列等。該載體的5'及3'LTR( long terminal repeat)被改造成SIN-LTR (self-inactivating-LTR)，目的是降低慢病毒重組的機率，增強安全性能，聯合WPRE終止 RNA轉錄的功能，是目前廣泛應用于臨床的最新一代的基因工程載體結構。B.T細胞的基因 修飾策略。T細胞活化后，通過兩次轉導即MART-1TCR(第一天)及圖示中三個載體的序貫轉 導（第4天），于第14天，與表達MART-1識別靶點的腫瘤細胞526、938共培養。C.抗腫瘤T細胞 膜表面IL-12分子的表達。共培養4小時后，通過流式細胞儀檢測T細胞膜表面hscIL-12的表 達。
[0012] 實驗數據顯示，細胞膜表面的IL-12只有在表達a-12/CD107a的融合蛋白組同表 達MART-1的MHC A2+反應組中可以檢測出來，分泌型的IL-12膜表面沒有表達。
[0013] 圖3.慢病毒載體表達hscIL-12/CD107a轉導的T細胞的增效反應。如圖所示，T細胞 序貫轉導抗腫瘤TCR及hscIL-12/CD107a融合蛋白系列14天后，與腫瘤細胞526及938共培 養，16小時后，上清中IFN γ及IL-12表達水平通過ELISA試劑盒檢測。同TCR基因修飾組比 較，序貫轉到融合蛋白組表現出明顯的抗腫瘤增效反應，即分泌高水平的IFNy ;但是實驗 上清中，只有C1組（持續分泌IL-12組）可以檢測到分泌的IL-12。*表示與對照組比較，p〈 0.001。
[0014] 圖4.慢病毒載體表達IL-12/⑶107a系列轉導的T細胞可以有效避免持續性分泌 IL-12造成的體外Τ細胞擴增的毒副作用。Τ細胞序貫轉導抗腫瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋 白系列14天后，各組細胞與對照轉導組(T-cell)的擴增倍數比較，轉導持續分泌IL-12組較 其它各組的擴增倍數顯著降低，*，Ρ〈〇.〇〇1。其中，轉導IL-12/CD107a的C2組與轉到IL-12/ (no signal peptide)無分泌肽⑶107a的C3組比較，擴增倍數顯著降低，**，Ρ〈0.01 <Χ3組與 TCR-T組比較，擴增倍數接近，未見顯著差異。
[0015] 圖5.慢病毒載體hscIL-12/⑶107a系列轉導鼠 T細胞介導的細胞回輸治療顯著延 長荷瘤小鼠的生存。雌性pme 1小鼠（每組7只小鼠）通過B16F10細胞(5000細胞八鼠）植入顱內 (IC) 5天，細胞回輸前1天小鼠接受5 G y全身放療。鼠的T細胞取自小鼠的脾臟細胞，通過 10ug/ml的刀豆蛋白（Con A)在IL-2(5IU/ml)存在的條件下活化;第2天，用圖示中慢病毒載 體轉導T細胞，然后繼續培養6天，收集細胞，通過小鼠尾靜脈注射（IV) 5X 106個T細胞。星號 (*)表示該實驗組與其它組比較，P〈〇.〇〇l;其中C3組與C2組比較(**)，C3組的存活天數顯著 延長，有統計學意義，P〈〇. 05。
【具體實施方式】
[0016] 本發明人經過廣泛而深入的研究，首次開發了一種結構新穎的、具有高效殺傷腫 瘤細胞活性且毒副作用很小的IL-12融合蛋白。該IL-12/CD107a或IL-12/缺失分泌肽的 CD107a融合蛋白通過基因修飾抗腫瘤T細胞后，IL-12存在于細胞漿的溶酶體內，細胞膜表 面不能檢測到表達。實驗表明，當本發明融合蛋白在T細胞中表達后，只有在抗腫瘤CTL識別 殺傷腫瘤時會瞬時有效展示在T細胞的表面。出乎意料的是，該IL-12/缺失分泌肽CD107a融 合蛋白系列對T細胞的活力(viability)基本無影響，并且攜帶本發明融合蛋白的抗腫瘤T 細胞在接近腫瘤細胞時，IL-12才會瞬時表達在細胞膜表面，導致位于細胞膜表面IL-12更 有效而安全地作用于腫瘤細胞。在本發明中，通過T細胞攻擊腫瘤的局部并通過細胞表面瞬 時迀移的IL-12改變T細胞-腫瘤組織的免疫微環境，從而協同而有效地實現抗腫瘤免疫效 果的最大化，同時極其顯著地降低IL-12的毒副作用。在此基礎上完成了本發明。
[0017] 具體地，本發明人利用通過CD107a表達IL-12,開發了一種IL12/缺失分泌CD107a 的全新的融合蛋白，并通過慢病毒基因修飾抗腫瘤T細胞。實驗數據，顯示IL12/缺失分泌肽 CD107a慢病毒基因修飾抗腫瘤T細胞后，在抗腫瘤CTL識別腫瘤時瞬時表達于T細胞表面，對 腫瘤抗原的反應表現出增強免疫反應的效應。臨床前荷瘤鼠模型顯示，該方案修飾的T細胞 可以顯著延長荷瘤小鼠的生存期，沒有發現明顯的細胞毒效應。換言之，瞬時膜表達所述融 合蛋白的T細胞一方面可有效地殺滅腫瘤細胞，另一方面經證實具有體內外的安全性。此 外，所述經修飾的T細胞自身似乎僅受到所表達IL-12輕微的不利影響或基本上不受其影響 (與持續分泌IL-12的T細胞比較，本發明融合蛋白對T細胞的體外擴增無明顯影響）。
[0018] 術語
[0019]如本文所用，術語"頭部"指多肽或其片段的N端，尤其是野生型多肽或其片段的N 端。
[0020] 如本文所用，術語"尾部"指多肽或其片段的C端，尤其是野生型多肽或其片段的C 端。
[0021] 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構成"、 "基本上由……構成"、和"由……構成"；"主要由……構成"、"基本上由……構成"和 "由……構成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0022] ⑶107a又稱為LAMP1，是一種表達于溶酶體上的跨膜蛋白，它的N-端位于溶酶體腔 囊一側，（Eskelinen 2006)C-端是一小段肽段，朝向胞楽;一側，當抗腫瘤T細胞在識別腫瘤 抗原時，溶酶體與T細胞膜融合而發生T細胞或NK細胞的脫顆粒效應，即T細胞或NK細胞釋放 效應分子顆粒酶(Granzyme B)及穿孔素(perforin)而達到殺傷腫瘤細胞的過程。在T細胞 與腫瘤細胞發生反應的時，CD107a迀移到T細胞膜上的特性已經被廣泛地應用于反應T細胞 殺傷功能的一個指標。
[0023]