一種asbel抑制劑及其在治療三陰性乳腺癌藥物中的應用
【專利摘要】本發明一種ASBEL抑制劑及其在治療三陰性乳腺癌藥物中的應用，具體為一種抑制人BTG3基因天然反義轉錄物ASBEL的反義寡聚核苷酸及其應用。該抑制劑特異性結合天然反義轉錄物ASBEL，解除其對BTG3蛋白表達的抑制作用，從而有效抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖和遷移等。本發明的抑制劑不僅限于所述的修飾方法，任何可以有效防止其降解的修飾方法都是有效的。
【專利說明】
一種ASBEL抑制劑及其在治療三陰性乳腺癌藥物中的應用
技術領域：
[0001 ]本發明涉及一種ASBEL抑制劑及其在制備治療三陰性乳腺癌藥物中的應用。本發 明還涉及含有該抑制劑的藥物組合物。
【背景技術】：
[0002] 癌癥是一種惡性疾病。由于各種致癌因素的作用，機體細胞發生增殖調控的異常， 一旦其無法得到有效地控制，就可能導致癌癥的發生。這些致癌因素多種多樣，有些來自機 體自身的基因突變，有些來自于環境中的有毒有害物質，還有一些來自于其他疾病，等等。 細胞內基因表達量出現紊亂被證實是癌細胞的一大特征，而人為地對某些關鍵基因表達量 進行控制，可能會恢復癌細胞的凋亡過程或抑制其增殖的能力，從而使癌癥得到控制。
[0003] 三陰性乳腺癌是一種以ER(雌激素受體）、PR(孕激素受體）以及HER2(人表皮勝正 因子受體2)均為陰性為特征的乳腺癌亞型。三陰性乳腺癌惡性度很高，易發生轉移，預后 差，且當前沒有特有的針對性治療指南。目前主要的治療手段仍然是放療、化療及手術切除 治療，復發風險較大。乳腺癌已經成為當今世界上女性癌癥發病率最高的一種，而三陰性乳 腺癌又是乳腺癌各個亞型中最為危險的。從基因的角度找到能治療三陰性乳腺的全新的有 效藥物，具有十分重要的意義。
[0004] 人類全基因組中只有2%的DNA序列編碼蛋白，而其余的大部分DNA序列，可以轉錄 出非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。這些ncRNA對于細胞信號的傳遞，代謝及增殖水平 調控，蛋白表達量的控制等等方面都有著重要的作用。ncRNA的種類多種多樣，其中長度在 200nt以上的被稱為長非編碼RNA( long non-coding RNA，lncRNA)。目前已經發現的IncRNA 已經有超過三千種，它們的作用機制不盡相同，可以通過表觀遺傳調節，轉錄調節和轉錄 后調節等方式去調控靶點的活性。IncRNA中有一類被稱為天然反義轉錄物（nature antisense transcripts，NATs)，它們一般從基因的反義鏈上轉錄，并通過與信使RNA (message RNA，mRNA)形成雜交而抑制mRNA的翻譯過程。ASBEL(antisense ncRNA in the ANA/BTG31ocus)是NATs類別中的一種，長度約為2kb，基因位于人21號染色體。它通過與 BTG3的mRNA形成雜交，阻止其出細胞核進入胞漿，從而降低了細胞中抑癌蛋白BTG3的表達 量（Satoshi Yanagida,Kenzui Taniue,Hironobu Sugimasa,et al.ASBEL,an ANA/ BTG3antisense transcript required for tumorigenicity of ovarian carcinoma[J] ? Scientific Reports，2013;3:1305·)〇
[0005] 研究表明，癌細胞的增殖、代謝、迀移、侵襲等過程的失調與IncRNA的表達異常有 關。針對表達異常的IncRNA進行人為糾正，可能會恢復癌細胞的程序性凋亡或抑制其生長， 從而對癌細胞的發展進行有效地控制。當前對于IncRNA的研究還不夠全面和深入，而針對 IncRNA的癌癥治療將是一個很有發展前景的方向。

【發明內容】
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[0006] 本發明提供了一種ASBEL抑制劑在制備治療三陰性乳腺癌藥物中的應用。
[0007] 1. 一種ASBEL抑制劑，其特征在于，所述ASBEL抑制劑具有與天然反義轉錄物ASBEL 有16個連續的核苷酸互補的序列。
[0008] 2.所述抑制劑為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者肽核酸。
[0009] 3.所述抑制劑為脫氧核糖核苷酸時，序列為-CGGTCTGGGCCGCCGA-3 ' ；所述抑制劑 為核糖核苷酸時，序列為5 ' -CGGUCUGGGCCGCCGA-3 '。
[0010] 4.所述抑制劑進一步被修飾。所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾 中的一種或幾種的組合。
[0011] 5.所述修飾選自硫代修飾、2 甲氧基修飾、鎖核酸修飾和膽固醇修飾中的一種 或幾種。
[0012] 6.所述的抑制劑用于制備治療與BTG3低表達相關疾病的藥物的用途。
[0013] 7.所述抑制劑可與其他治療藥物聯合施用。例如阿霉素。
[0014] 8.所述BTG3低表達相關疾病為乳腺癌，優選為三陰性乳腺癌。
[0015] 9. -種藥物組合物，含有所述的抑制劑以及藥學上可接受的載體。例如脂質體類 納米載體。
[00?6]本發明中所述ASBEL抑制劑(命名為antago34)為一條長度為16nt的反義寡脫氧核 苷酸鏈，序列為5 ' -CGGTCTGGGCCGCCGA-3 '。所述ASBEL抑制劑用于制備治療三陰性乳腺癌藥 物。
[0017] 進一步，所述三陰性乳腺癌為三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231。
[0018] 本發明設計的反義寡脫氧核苷酸antag〇34,其序列具有特異性生物學活性，所以 任何增加反義寡脫氧核苷酸穩定性的修飾都可以適用。本發明中所述antago34在其5'端和 3 '端分別進行3個堿基的硫代磷酸化修飾。
[0019] 本發明的上述antag〇34被轉染進入MDA-MB-231細胞中后，能有效的誘導細胞凋 亡，且可觀察到細胞增殖減慢，迀移率下降。
【附圖說明】：
[0020] 圖1A表明ASBEL抑制劑(antago34)對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響。其中， antagoNC組為陰性對照，siASBEL組為靶向ASBEL的siRNA，Lipo組為轉染時只加入lipo， Blank組為不做任何處理的空白對照。
[0021] 1B圖表明PS (硫代磷酸化修飾)和LNA(鎖核酸修飾)修飾的antago34，在不同濃度 下對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響。
[0022] 圖2A、B表明antago34對人乳腺癌細胞MDA-MB-231中BTG3基因的mRNA和蛋白水平 的影響。其中，GAPDH為蛋白內參。
[0023] 圖3A、B表明antago34對人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響。
[0024] 圖4表明antago34對人乳腺癌細胞MDA-MB-231迀移能力的影響。
【具體實施方式】：
[0025]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但列舉這些實施例只是起說明作 用，本發明的保護范圍并不僅限于此。
[0026] 實施例1:合成ASBEL抑制劑、陰性對照及siRNA
[0027] 反義寡脫氧核苷酸鏈ASBEL抑制劑（即antag〇34)，由上海生工生物工程股份有限 公司合成，其序列為5'-0661'(^666(^6(^64-3'，其中第1、2、3、14、15、16位堿基間進行硫代 磷酸化修飾。陰性對照（a n t a g ο N C )的堿基修飾方式完全一樣，其序列為5 ' -TCCACGCGCAGTACAA-3 '。上述序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。鎖核酸修飾 的antag〇34,由上海輝睿生物科技有限公司合成，其序列、陰性對照的序列以及修飾的位置 和數量，與上述硫代磷酸化修飾完全相同。
[0028] 靶向ASBEL的siRNA序列為5'-GCAAACGTTTCTAGGAACA-3'，由廣州市銳博生物科技 有限公司合成。
[0029]實施例2:ASBEL抑制劑對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的抑制作用 [0030] 在96孔板中培養人乳腺癌細胞MDA-MB-231，細胞培養基為添加了 10%胎牛血清 (Gibco)(指胎牛血清在培養基中所占體積為10%，下同）的DMEM培養基(Gibco)。待細胞匯 合度在40% (指每孔中貼壁細胞所占面積占底面積40%，下同）時，使用lipofectamine2000 (Invitrogen)進行轉染，ASBEL抑制劑（即antago34)、陰性對照antagoNC以及siASBEL的濃 度均為ΙΟΟηΜ，以每孔0.25μ1的lipofectamine2000的用量準備轉染液，用不含血清的Opti-MEM培養基(Gibco)進行稀釋。按照說明書進行孵育和轉染后，在條件為37 °C、5 %⑶2(指C02 在孵箱中的氣體中所占體積比為5%，下同）的細胞培養箱中進行培養，分別在24小時、48小 時和72小時取出，使用CCK8細胞增殖檢測試劑盒(東仁化學科技有限公司)進行檢測。
[0031] 結果見圖1。結果顯示相比于對照，antago34能有效抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的 增殖。
[0032] 硫代磷酸化和鎖核酸修飾作用效果比較:在96孔板中培養人乳腺癌細胞MDA-MB-231，細胞培養基為添加了 10%胎牛血清(6丨1^〇)的01^1培養基(6丨1^〇)。待細胞匯合度在 40%時，使用 lipofectamine2000( Invitrogen)分別轉染濃度為 50nM、100nM 和200nM 的硫代 磷酸化修飾的antago34以及鎖核酸修飾的antago34。轉染分別用兩種修飾方法修飾的陰性 對照antagoNC，濃度均為100nM。以每孔0· 25μ1的lipofectamine2000的用量準備轉染液，用 不含血清的Opti-ΜΕΜ培養基(Gibco)進行稀釋。按照說明書進行孵育和轉染后，在條件為37 °C、5%C0 2的細胞培養箱中進行培養，在48小時取出，使用CCK8細胞增殖檢測試劑盒（東仁 化學科技有限公司)進行檢測。
[0033]結果見圖1B。結果顯示采用鎖核酸修飾的antago34與硫代磷酸化修飾的antago34 相比，作用效果類似，隨著藥物濃度的增加，對細胞的增殖抑制效果更加明顯。并且兩種修 飾對細胞均沒有非特異性的毒性作用。
[0034] 實施例3: ASBEL抑制劑對人乳腺癌細胞MDA-MB-231內BTG3基因表達的影響
[0035] 在6孔板中培養人乳腺癌細胞MDA-MB-231，細胞培養基為添加了 10 %胎牛血清 (Gibco)的DMEM培養基（Gibco)。待細胞匯合度在40%左右時，使用1丨？(^6(^3111丨1162000 (Invitrogen)進行轉染。共設三組，分別轉染100nM antago34,100nM antagoNC以及不添加 任何藥物的空白對照組。轉染時每孔的lip〇fectamine2000的用量為5μ1，用不含血清的 Opti-MEM培養基(Gibco)進行稀釋。按照說明書進行孵育和轉染后，在條件為37 °C、5 %⑶2 的細胞培養箱中進行培養，48小時后收取蛋白和RNA。
[0036] Western Blot檢測：收取6孔板中的細胞，用RIPA細胞裂解液冰上充分裂解，離心 后收取上清蛋白溶液。使用BCA蛋白定量試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司）進行蛋白 濃度測定，根據濃度進行稀釋并加入5X蛋白上樣緩沖液，混合均勻后煮沸十分鐘變性，-20 °(：凍存待用。進行Western Blot檢測時，每組樣品取20yg蛋白溶液，使用12%聚丙烯酰胺凝 膠進行電泳。電泳結束后，進行半干法轉膜將蛋白轉印到PVDF膜上。在室溫條件下，使用 5%脫脂奶粉(指lOOmllXTBS溶液中加入溶解5g脫脂奶粉)進行封閉，在水平搖床上封閉4 小時。用TBST溶液(含0 · 1 %吐溫20(指100ml 1 X TBS溶液中加入0 · lml吐溫20)的TBS溶液)洗 凈膜后，將膜置于用TBST溶液稀釋的一抗中，稀釋倍數根據抗體的說明書要求(BTG3-抗購 自Abcan^GAFOH-抗購自Cell Signaling Technology)。靜置于4°C冰箱過夜。第二天取出 用TBST溶液洗凈膜，置于暗盒中并加入相應的熒光二抗。在室溫避光的條件下，水平搖床上 放置45分鐘，TBST溶液洗凈膜并使用雙色紅外激光成像系統(Odyssey)進行掃描成像。 [0037] Realtime PCR檢測:使用Paris Kit試劑盒(Ambion)從6孔板的細胞中提取總RNA。 經過紫外分光光度計進行定量后，使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa)進行反轉錄反應，使用SYBR Premix DimerEraser?試劑盒（TaKaRa)進行 Realtime PCR反應，檢測轉染antago34后細胞內ASBEL和BTG3的mRNA水平的變化。所用儀器 為ABI ViiA? 7實時熒光定量PCR儀。
[0038] 結果見圖2A、B。結果顯示轉染antago34后，BTG3的mRNA和蛋白的表達量均有所增 尚。
[0039] 實施例4: ASBEL抑制劑對人乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響
[0040]用同樣的轉染方法分別將antag〇34和antagoNC轉染進人乳腺癌細胞MDA-MB-231。 轉染48小時后，使用AnnexinV，FITC凋亡檢測試劑盒(東仁化學科技(上海)有限公司）進行 處理，并使用流式細胞儀(BD)進行檢測。
[0041 ]結果見圖3A、B。結果顯示轉染隨著轉染antag〇34的濃度升高，人乳腺癌細胞MDA-MB-231的凋亡比例逐漸升高。
[0042] 實施例5 :ASBEL抑制劑對人乳腺癌細胞MDA-MB-231迀移能力的影響
[0043]用同樣的轉染方法分別以100nM的濃度將antag〇34和antagoNC轉染進人乳腺癌細 胞MDA-MB-231，24小時后收取細胞，加入無血清DMEM培養基(Gibco)進行重懸并調整細胞濃 度至5 X 105個/ml的濃度，使用Transwell (Corning)進行細胞迀移能力檢測。在Transwell 小室內加入細胞上述細胞懸液200μ1，在外室內加入700μ1含10 %FBS(Gibco)的DMEM培養 基。在條件為37 °C、5 % C02的細胞培養箱中進行培養24小時后取出，用PBS清洗并用棉簽擦 去小室內層細胞，用4 %多聚甲醛室溫固定15分鐘后用PBS洗凈，再在室溫下用0.025 %結晶 紫（指100ml水中溶解0.025g結晶紫）染色10分鐘，棄染液用PBS洗凈，在顯微鏡下用明場進 行觀察。
[0044] 結果如圖4。結果顯示在轉染antag〇34后，人乳腺癌細胞MDA-MB-231的迀移能力得 到了明顯抑制。
【主權項】
1. 一種ASBEL抑制劑，其特征在于，所述ASBEL抑制劑具有與天然反義轉錄物ASBEL有16 個連續的核苷酸互補的序列。2. 如權利要求1所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷 酸或者肽核酸。3. 如權利要求2所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑為脫氧核糖核苷酸時，序列為 5 ' -CGGTCTGGGCCGCCGA-3 ' ；所述抑制劑為核糖核苷酸時，序列為5 ' -CGGUCUGGGCCGCCGA-3 '。4. 如權利要求1~3中任一項所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑進一步被修飾。5. 如權利要求4所述的抑制劑，其特征在于所述修飾選自核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨 架修飾中的一種或幾種的組合。6. 如權利要求5所述的抑制劑，其特征在于，所述修飾選自硫代修飾、2 甲氧基修飾、 鎖核酸修飾和膽固醇修飾中的一種或幾種。7. 如權利要求1~6中任一項所述的抑制劑用于制備治療與BTG3低表達相關疾病的藥 物的用途。8. 如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述反義寡聚核苷酸與其他治療藥物聯合施 用。9. 如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述BTG3低表達相關疾病為乳腺癌。10. -種藥物組合物，其特征在于權利要求1~6中任一項所述的抑制劑以及藥學上可 接受的載體。
【文檔編號】A61K31/7088GK105969770SQ201610320390
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月15日
【發明人】盛望, 夏陽, 鄧雄威, 肖向茜, 張芳, 周韶梅, 曾毅
【申請人】北京工業大學