鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應用，該鐵死亡抑制劑為Ferrostatin?1。本發明為以鐵死亡為靶點的鐵過載疾病的治療提供了理論依據，特別是對遺傳性血色病的藥物研發提供了基礎。
【專利說明】
鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在治療鐵過載疾病中的應用。
【背景技術】
[0002]鐵死亡(Ferroptosis)是一類鐵依賴的細胞死亡途徑，不同于凋亡、壞死、自噬等其他死亡途徑。鐵死亡表現為細胞脂質過氧化水平和標志基因Ptgs2表達量升高，可特異性被鐵離子螯合劑抑制。
[0003]Ferrostatin-1是目前公認的鐵死亡抑制劑。作為含有N-環己基的化合物，Ferrostatin-1與細胞膜磷脂雙分子層有較高親和性，能有效清除細胞膜脂質過氧化。體外實驗中，Ferrostatin-1作用于癌細胞，抑制Erast in誘導的胞楽和脂質ROS積累，進而抑制鐵死亡。在新生大鼠大腦中，Ferrostatin-1抑制谷氨酸鹽誘導的神經元鐵死亡。此外，Ferrostat in_l不能抑制細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化或螯合鐵，說明Ferrostat in_l抑制鐵死亡不通過調控MEK/ERK通路、細胞鐵水平或抑制蛋白合成。與生育酚等還原劑類似，Ferrostatin-1不穩定，容易被氧化成穩定的2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)。
[0004]鐵是人體必需的微量元素之一，鐵代謝平衡紊亂會導致嚴重的疾病。在鐵過載時，細胞內過量的鐵會通過Fenton反應產生大量氧化自由基，破壞蛋白質、核酸等細胞結構，導致細胞死亡。血色病(Hemochromatosis)又稱遺傳性血色病，是常見的慢性鐵負荷增多的常染色體遺傳疾病，表現為過多的鐵儲存于肝臟、心臟和胰腺等實質性器官，導致組織器官退行性病變，引發肝病、糖尿病、心臟病等慢性疾病。血色病通常由鐵調素及其調控基因突變導致，目前治療方法較為局限。
[0005]雖然鐵在鐵死亡過程中發揮重要作用，但目前還沒有關于鐵代謝與鐵死亡的報道。鐵代謝紊亂(尤其是鐵過載)是否會導致Ferroptosis也不得而知。目前已知的鐵死亡抑制劑有Ferrostatin-1、生育酸、β-巰基乙醇等，均未被使用或報道過用來治療遺傳性血色病等鐵過載疾病。
[0006]因此，以鐵死亡為靶點，通過鐵死亡抑制劑靶向抑制鐵過載引發的鐵死亡，對遺傳性血色病的治療具有重要意義。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題是提供鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在制備治療鐵過載疾病藥物中的應用，為新藥研發和創新療法提供基礎。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明提供一種鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應用，該鐵死亡抑制劑為Ferrostatin-1。
[0009]在發明過程中，發明人發現鐵過載會導致鐵死亡。根據文獻報道，小分子化合物Ferrostatin-1是鐵死亡特異性抑制劑。發明人發現在小鼠肝原代細胞中，Ferrostatin-1能明顯抑制鐵離子刺激導致的鐵死亡。通過對野生型小鼠飼喂高鐵飼料誘導鐵過載，Ferrostatin-1處理能明顯抑制鐵過載導致的鐵死亡。進一步通過血色病小鼠模型證實，Ferrostatin-1能明顯抑制鐵過載導致的鐵死亡，但并不改變小鼠的組織鐵含量。該研究結果為Ferrostat in-Ι改善鐵過載疾病提供了理論依據，特別是對遺傳性血色病的藥物研發提供了基礎。
[0010]鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1在治療鐵過載疾病時，其用法和用量為:每天肌肉注射或靜脈滴注ferrostatin-l(lmol/kg體重)，2周為一療程。
[0011]綜上所述，本發明提供了鐵死亡抑制劑在治療鐵過載疾病中的應用，具體的，所述鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1可用于制備治療遺傳性血色病(HereditaryHemochromatosis)并發癥的藥物，或者預防補鐵時鐵死亡毒性的補充劑。本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了Ferrostatin-1在抑制膳食性鐵過載和遺傳性血色病中的鐵死亡過程，為以鐵死亡為靶點的鐵過載疾病的治療提供了理論依據，特別是對遺傳性血色病的藥物研發提供了基礎。
【附圖說明】
[0012]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0013]圖1為Ferrostatin-1體外抑制鐵過載引發的鐵死亡；
[0014]A:空白處理(Con)、檸檬酸鐵FAC(10yM)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加二甲基亞砜(DMSO)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加Ferrostatin-1 (2μΜ)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加DFO(1yM)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(10yg/mL)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加壞死抑制劑Necrostat in-1 (10yg/mL)共處理小鼠肝原代細胞12小時，對細胞脂質過氧化的抑制效果;
[0015]B:空白處理(Con)、檸檬酸鐵FAC(10yM)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加二甲基亞砜(DMSO)、檸檬酸鐵FAC(10yM)加Ferrostatin-1 (2μΜ)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加DFO(1yM)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(10yg/mL)，檸檬酸鐵FAC(10yM)加壞死抑制劑Necrostatin-1(10yg/mL)共處理小鼠肝原代細胞12小時，對細胞Ptgs2 mRNA表達的抑制效果。
[0016]圖2為Ferrostatin-1腹腔給藥能抑制小鼠膳食鐵過載導致的鐵死亡；
[0017]A:高鐵飼料飼喂8周，Ferrostatin-1 (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，C57BL/6小鼠肝臟Ptgs2mRNA表達水平；
[0018]B:高鐵飼料飼喂8周，Ferrostatin-l(Ferr_l，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，C57BL/6小鼠肝臟非血紅素鐵含量。
[0019]圖3為Ferrostatin-1腹腔給藥能抑制血色病小鼠中的鐵死亡并改善肝損傷；
[0020]A:Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠肝臟Ptgs2 mRNA表達水平；
[0021 ] B: Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠肝臟非血紅素鐵含量。
[0022]C: Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg體重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠血清ALT活性。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0024]實施例1:
[0025]1.材料和方法
[0026]1.1實驗原料制備
[0027]化合物單體Ferrostatin-l、DFO、Z-VAD-FMK、Necrostatin_l和朽1檬酸鐵均購自SIGMA公司。Ferrostatin-l、DF0、Z_VAD-FMK、Necrostatin_l溶于無菌二甲基亞諷DMSO中，檸檬酸鐵溶于磷酸鹽緩沖液中，配置成所需濃度。
[0028]1.2小鼠肝原代細胞
[0029]小鼠肝原代細胞通過II型膠原酶緩沖液灌流法從C57BL/6小鼠肝臟中獲得。培養條件:含10%FBS(GIBC0)的DMEM高糖型培養基(GIBC0)，37°C，5%C02飽和濕度培養箱。待細胞貼壁后，在培養基中分別加入磷酸鹽緩沖液PBS，檸檬酸鐵(ΙΟΟμΜ，終濃度，下同)，檸檬酸鐵(ΙΟΟμΜ)+凋亡抑制劑(10yg/mL)，檸檬酸鐵(ΙΟΟμΜ)+壞死抑制劑(10yg/mL)，檸檬酸鐵(100yM)+Ferrostatin-l(2yM)。處理 12小時后，收集細胞，進行Real-time PCR(見1.3)和細胞膜脂質過氧化水平測定(見1.4)。
[0030]1.3RNA提取和Real-time PCR
[0031 ] Trizol(Life Techno1gies)法提取細胞和組織的RNA，具體操作按說明書進行。Nanodrop lOOOSpectrophotometer上檢測RNA純度(00260/00280^?= 1.9-2.1)及RNA濃度(ng/μ?)，調整RNA濃度到lyg/μ?。
[0032]2.0yg RNA經DNase (Promega)處理后，]\1_]\11^反轉錄酶(？1'01116 8&)和01丨80((1丁)18primer(Takara B1 Inc.)進行反轉錄。CFX96Real_Time System(B1-Rad)中進行Real-time PCR檢測Ptgs2mRNA水平，檢測體積為1ul，試劑米用iQ SYBR Green Supermix(B1-Rad)，引物序列如下:
[0033]mouseActb(P-actin):
[0034]forward:AAATCGTGCGTGACATCAAAGA
[0035]reverse:GCCATCTCCTGCTCGAAGTC
[0036]mouse Ptgs2:
[0037]forward:CTGCGCCTTTTCAAGGATGG
[0038]reverse:GGGGATACACCTCTCCACCAo
[0039]1.4細胞膜脂質過氧化水平測定
[0040]貼壁的小鼠肝原代細胞用胰酶消化成單細胞懸液。Cll-BODIPY(1yM)室溫避光孵育30分鐘，PBS洗3次，流式細胞儀檢測。C11-B0DIPY購自Invitrogen。
[0041 ] 1.5實驗動物
[0042]3周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，SPF環境飼養。標準飼料AIN-76A(鐵含量50mg/Kg，Research Diets，Inc)適應喂養一周后，按體重隨機分組，每組6?8只。根據實驗設計，對照組用基礎飼料喂養8周；高鐵組用高鐵飼料喂養8周；治療組用高鐵飼料(鐵含量8.3g/Kg,Research Diets，Inc)喂養8周，最后2周每隔一天腹腔注射Ferrostatin-l (lmol/kg體重)。5 %水合氯醛腹腔麻醉后，心臟采血，分離血清，并收集肝脾腎組織(液氮保存)，檢測肝損傷指標(見1.6)和肝臟Ptgs2表達量(方法同1.3)。
[0043]1.6肝損傷指標的檢測
[0044]臨床上常用血清中谷氨酸-丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性來衡量肝損傷水平。血清ALT活性檢測使用上海申索佑福醫學診斷用品有限公司的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒，檢測方法依照說明書。
[0045]1.7統計方法
[0046]所用統計采用R軟件分析，實驗數據以Mean± SD表示。細胞和動物實驗的組間比較采用Tukey ’ s檢驗(ANOVA)，兩組間比較以Student ’ s t_test檢驗，以P〈0.05認為有統計學意義。
[0047]2.結果
[0048]2.1 Ferrostatin-l在小鼠肝原代細胞中抑制鐵過載導致的鐵死亡
[0049]分離商品化C57BL/6小鼠的肝原代細胞并體外培養，在培養基中分別加入磷酸鹽緩沖液I3BS，檸檬酸鐵FAC( ΙΟΟμΜ，終濃度，下同)，檸檬酸鐵FAC( ΙΟΟμΜ)+凋亡抑制劑Z-VAD-FMK(10yg/mL)，檸檬酸鐵 FAC(10yM)+壞死抑制劑Necrostatin-1 (10yg/mL)，檸檬酸鐵 FAC(100yM)+Ferrostatin-l (2μΜ)。12小時后，檢測鐵死亡指標，包括細胞膜脂質過氧化和Ptgs2 mRNA水平。每個處理設3個復孔，實驗重復三次。
[0050]實驗發現檸檬酸鐵刺激能顯著上調細胞膜脂質過氧化水平和Ptgs2mRNA表達，說明體外鐵過載會引發鐵死亡。鐵離子螯合劑DFO和Ferrostatin-l處理能明顯抑制鐵對脂質過氧化和Ptgs2表達量的上調，而凋亡抑制劑Z-VAD-FMK和壞死抑制劑Necrostatin_l處理則沒有抑制作用。這說明Ferrostatin-l在體外水平能抑制鐵過載導致的鐵死亡。
[°°511 2.2 Ferrostatin-l抑制膳食鐵過載導致的鐵死亡
[0052]4周齡的C57BL/6雄性小鼠隨機分成3組，分別飼喂標準飼料(鐵含量50mg/kg，Research Diets, Inc)8周、高鐵飼料(鐵含量8.3g/kg，Research Diets, Inc)8周、高鐵飼料8周加最后2周腹腔注射Ferrostatin-l (每天lmol/kg)，檢測肝臟Ptgs2mRNA水平和肝臟非血紅素鐵含量。
[0053]結果顯示，高鐵飼料飼喂能明顯上調肝臟非血紅素鐵含量和Ptgs2mRNA水平，說明體內水平鐵過載也會導致鐵死亡。Ferrostatin-l聯合處理能明顯抑制高鐵膳食對Ptgs2表達的上調，說明Ferrostatin-l在體內水平能抑制鐵過載導致的鐵死亡。同時，高鐵飼料與Ferrostatin-l聯合處理組同高鐵飼料單獨處理組相比，肝臟非血紅素鐵含量沒有明顯差異，說明Ferr ο s tat i η-1抑制鐵死亡的同時，并不影響機體的鐵代謝水平。
[0054]鐵劑補充目前常在臨床上用于治療缺鐵性貧血，但鐵的過量攝入會導致鐵死亡。該研究提示，鐵劑可以與Ferrostatin-l聯合使用，在不影響補鐵效果的同時，降低鐵的鐵死亡毒性。
[0055]2.3 Ferrostatin-l緩解血色病小鼠的表型
[0056]遺傳性血色病是常見的鐵過載疾病。Smad4肝臟特異敲除小鼠(Smad4Alb/Alb)的表型與發病機制與遺傳性血色病相似。6周齡的雄性Smad4Alb/Alb小鼠給予腹腔注射Ferrostatin-l (lmol/kg每天)，2周后檢測肝臟非血紅素鐵含量、血清ALT活性和Ptgs2mRNA水平。
[0057]結果顯示，與對照小鼠(Smad4fl°x/fl°x)相比，Smad4Alb/Alb小鼠的肝臟鐵含量、Ptgs2mRNA水平明顯上升，說明血色病小鼠中存在鐵死亡。給予Ferrostatin_l處理后，肝臟Ptgs2表達量明顯下降，說明Ferrostatin-l能抑制血色病小鼠中的鐵死亡。血色病模型中，鐵過載會導致肝損傷，進而引發一系列并發癥。本底狀態下，Smad4Alb/Alb小鼠的血清ALT水平較SmacMfzMnIl明顯升高；對Smad4AllVA1M、鼠給予Ferrostatin-l處理后，血清ALT水平明顯下降至對照小鼠水平，說明通過F err ο s tat i η-1革El向抑制鐵死亡能明顯改善了血色病小鼠的病理狀態。
[0058]基于此，Ferrostatin-l抑制鐵過載導致鐵死亡是治療鐵過載相關疾病(血色病)的治療方法。
[0059]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.鐵死亡抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應用，該鐵死亡抑制劑為Ferrostatin-10
【文檔編號】A61P3/12GK105943530SQ201610307748
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】王福俤, 王浩, 閔軍霞
【申請人】浙江大學