作為抗腫瘤藥物的topk抑制劑的制作方法
【專利摘要】5-二氟甲氧基-2-[[(3,4-二甲氧基-2-吡啶基)-甲基]-亞磺酰基]-1H-苯并咪唑或其可藥用鹽作為TOPK抑制劑用作抗腫瘤藥物、用于制備抗腫瘤藥物的應用或者用于治療腫瘤疾病。
【專利說明】
作為抗腫瘤藥物的TOPK抑制劑
技術領域
[0001] 本發明涉及具有下列式I結構的化合物或其可藥用鹽作為TOPK抑制劑用作抗腫 瘤藥物、用于制備抗腫瘤藥物的應用或者用于治療腫瘤疾病。
[0002]

【背景技術】
[0003] TOPK 是英文 "T-LAK 細胞來源的蛋白激酶"（T-LAK cell-originated protein kinase)的縮寫，是2000年Abe等發現的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（J Biol Chem 2000， 275(28) :21525-21531)。現已證明，TOPK 與 Gaudet 等于同年發現的（Proc Natl Acad Sci USA 2000,97(10) :5167-5172)激酶 PBK (PDZ-binding kinase，PBK)是同一物質，因此也稱 為ΡΒΚ/Τ0ΡΚ。人體內的TOPK由322個氨基酸構成、相對分子質量約為40kD。
[0004] TOPK的表達具有較強的時間和組織特異性。已經發現，在胎兒時期，TOPK表達于 心、肝、腎等多種組織器官（Blood Cells Mol Dis 2001，27(5) :825-8294)。但當機體出生 后，卻只在睪丸、胸腺（Cancer Res 2006,66(18) :9186 - 9195)和增殖活性較強的神經前體 細胞（J Neurosci 2005, 25 (46) :10773-10785)中檢測到 TOPK mRNA。然而，當細胞發生惡 性變后，腫瘤細胞重新獲得TOPK表達。目前已證實，TOPK在乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、 肺癌、白血病等多種腫瘤細胞中呈強表達（Blood Cells Mol Dis 2004, 32 (1):240 - 245)， 并且表達量與乳腺癌和結直腸癌的惡性程度明顯相關（J Neurosci，同上）。
[0005] TOPK表達和活化水平直接調控著細胞的有絲分裂和細胞周期。目前普遍認為， TOPK可能是一個重要的周期標志物。TOPK在多種惡性腫瘤細胞中呈高表達，不僅調控著 腫瘤細胞的有絲分裂和細胞周期，并且參與了腫瘤細胞增殖、迀移、侵襲和凋亡過程，因此 據信有可能成為腫瘤治療的一個重要靶點（Br J Cancer, 2010, 102(1) :151-161 ;Cancer Res, 2012, 72(12):3060-3068)。
[0006] 式I化合物的系統命名為5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲 基]-亞磺酰基]-IH-苯并咪唑，其國際藥品通用名（INN)為pantoprazole(以下簡稱化合 物1)。化合物1或其藥用鹽作為質子栗抑制劑用于潰瘍的治療，CN1953750A雖然公開了 包括化合物1在內的質子栗抑制劑類（PPI)藥物在制備抗腫瘤劑中的用途，實際上只是利 用其制酸作用輔助抗腫瘤藥物發揮作用。

【發明內容】

[0007] 在本發明人等進行的基于結構的TOPK酶-配基相互作用的計算機分子對接中，化 合物1顯示了良好的TOPK結合特性。在此基礎上，本發明人等進行了深入研究，藥效學研 究證實了計算機分子對接的結果，最終實現了本發明。
[0008] 因此，本發明涉及：
[0009] 1. -種通過抑制腫瘤細胞中高表達的TOPK而抗腫瘤的藥物組合物，其特征在 于含有化合物1 一一5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）_甲基]-亞磺酰 基]-IH-苯并咪唑或其可藥用鹽作為活性成分。
[0010] 2.根據1所述的藥物組合物，化合物1的可藥用鹽是化合物1與堿金屬、堿土金 屬、胺、胍或含氮雜環化合物形成的鹽。
[0011] 3.根據2所述的藥物組合物，化合物1與堿金屬、堿土金屬形成的鹽是鋰鹽、鈉鹽、 鉀鹽、鎂鹽和/或鈣鹽。
[0012] 4.根據1所述的藥物組合物，所述TOPK高表達的腫瘤包括：宮頸癌、精原細胞瘤、 睪丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌、胰腺 癌、胃癌、食管癌、甲狀腺癌、和/或膀胱移行上皮癌。
[0013] 5.根據1~4任一項所述的藥物組合物，其中還包含藥用載體，并且實質上不包含 化合物1以外的活性成分。
[0014] 6.根據5所述的藥物組合物，所述藥用載體為適用于制成口服、注射、吸入、粘膜 給藥或者局部給藥劑型的載體。
[0015] 7.化合物1 一一5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）_甲基]-亞磺 酰基]-IH-苯并咪唑或其可藥用鹽在制備通過抑制腫瘤細胞中高表達的TOPK而抗腫瘤的 藥物中的應用。
[0016] 8.根據7所述的應用，化合物1的可藥用鹽是化合物1與堿金屬、堿土金屬、胺、胍 或含氮雜環化合物形成的鹽。
[0017] 9.根據8所述的應用，化合物1與堿金屬、堿土金屬形成的鹽是鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、 鎂鹽和/或鈣鹽。
[0018] 10.根據7所述的應用，所述TOPK高表達的腫瘤包括宮頸癌、精原細胞瘤、睪丸淋 巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、胃 癌、食管癌、甲狀腺癌和/或膀胱移行上皮癌。
[0019] 11.根據7~10任一項所述的應用，其中所述藥物中還包含藥用載體，并且實質上 不包含化合物1以外的活性成分。
[0020] 12.根據11所述的應用，所述藥用載體為適用于制成口服、注射、吸入、粘膜給藥 或者局部給藥劑型的載體。
[0021] 13. -種通過抑制腫瘤細胞中高表達的TOPK而抗腫瘤的腫瘤疾病治療方法，其 特征在于對于需要治療的對象投予5-二氟甲氧基-2-[[ (3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲 基]-亞磺酰基]-IH-苯并咪唑或其可藥用鹽。
[0022] 14.根據13所述的治療方法，化合物1的可藥用鹽是化合物1與堿金屬、堿土金 屬、胺、胍或含氮雜環化合物形成的鹽。
[0023] 15.根據14所述的治療方法，化合物1與堿金屬、堿土金屬形成的鹽是鋰鹽、鈉鹽、 鉀鹽、鎂鹽和/或鈣鹽。
[0024] 16.根據13所述的治療方法，所述TOPK高表達的腫瘤包括：宮頸癌、精原細胞瘤、 睪丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌、胰腺 癌、胃癌、食管癌、甲狀腺癌、和/或膀胱移行上皮癌。
[0025] 17.根據1~4任一項所述的治療方法，化合物1的給藥方式為經口、注射、吸入、 粘膜給藥或者局部給藥。
【附圖說明】
[0026] 圖1化合物1與TOPK結合的作用模式
[0027] 圖2化合物1對TOPK下游激酶Erk2磷酸化的影響
[0028] 圖3化合物1對HCTl 16細胞中Erk2、histone H3磷酸化的影響
[0029] 圖4化合物1對SW480細胞的轉化和增殖抑制作用
[0030] 圖5化合物1對HCTl 16細胞的轉化和增殖抑制作用
[0031] 圖6化合物1顯著抑制HCTl 16移植腫瘤的生長
【具體實施方式】
[0032] 為了使本領域的技術人員可以更好地理解本發明，下面結合附圖和實施例對本發 明技術方案進一步說明。
[0033] TOPK在多種惡性腫瘤細胞中呈高表達，調控腫瘤細胞的有絲分裂和細胞周期，并 且參與腫瘤細胞增殖、迀移、侵襲和凋亡過程，抑制TOPK的表達可以抑制腫瘤的產生和發 展的這些環節從而起到抗腫瘤作用，TOPK抑制劑的抗腫瘤譜為TOPK高表達的腫瘤，目前 已知的包括：宮頸癌、精原細胞瘤、睪丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌、皮 膚鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、甲狀腺癌、膀胱移行上皮癌等。本發明 經過計算機篩選得到5-二氟甲氧基-2-[[ (3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰 基]-IH-苯并咪唑的結構，經過TOPK受體結合試驗、細胞和動物水平的活性測試確認其為 有效的、靶向性的TOPK抑制劑。
[0034] 作為藥物須具有特定的存在形式，本發明中，根據不同的使用要求選擇給藥方式 和劑型，可將5-二氟甲氧基-2- [[ (3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-IH-苯 并咪唑直接以原形形式進行制劑，或者將其制成堿金屬、堿土金屬、胺、胍或含氮雜環化合 物形成的鹽進行使用。相應的藥用鹽的形態采用常規的成鹽制備手段來獲得：具體包括： (1)合成5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-IH-苯并 咪唑；（2)轉化成為相應的鹽；（3)必要時通過重結晶方法對產品進行純化精制。
[0035] 采取治療的方式為將5-二氟甲氧基_2-[[ (3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）_甲 基]-亞磺酰基]-IH-苯并咪唑及其可藥用的鹽單獨給藥，也可以根據需要與其他有效治療 藥物聯合治療發揮協同作用增強治療效果。給藥方式可根據臨床需要選擇口服、注射或者 局部外用，根據給藥途徑的選擇相應的藥物劑型，口服劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服 溶液、微丸劑、微片劑，注射劑型包括粉針劑、注射液、脂質體微球注射液，外用劑包括溶液、 混懸液、乳劑、軟膏、凝膠劑等。
[0036] 本發明技術方案有以下特點：1、根據用藥的需要選擇5-二氟甲氧 基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-IH-苯并咪唑原形或其可藥用 的鹽；2、能有效地用于治療TOPK高表達的相關疾病，包括腫瘤；3、采取治療的方式可以單 獨給藥或者與其他藥物聯合治療；4、可以根據需要選擇給不同的藥方和劑型進行給藥。
[0037] 實施例
[0038] 通過體內外實驗驗證化合物1能靶向抑制TOPK激酶活性從而抑制腫瘤。
[0039] 實施例一化合物1的合成
[0040] 5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-IH-苯并 咪唑的合成
[0041] 5-二氟甲氧基-2-[[ (3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]硫]-IH-苯并咪唑10g， 溶于60ml氯仿中，攪拌冷卻至0°C，分批加入間氯過氧苯甲酸6. 3g，攪拌反應4h后加入飽 和碳酸鈉溶液60ml，萃取分液，水層用60ml氯仿萃取一次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥、 過濾、濃縮，濃縮物用乙酸乙酯重結晶得產物8. 8g，收率85. 4%。
[0042] 5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-IH-苯并 咪唑鈉的合成
[0043] 5-二氟甲氧基-2-[[(3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-IH-苯并 咪唑8g，氫氧化鈉 lg，乙醇60ml，攪拌下加熱至50°C保溫lh，減壓濃縮，濃縮物加入乙酸乙 酯50ml和0. 4g水攪拌3h，冷卻至0°C再攪拌2h，得白色結晶產品7. lg，收率85. 2%。
[0044] 實施例二基于TOPK結構的化合物篩選
[0045] 一、計算機篩選
[0046] 本發明的工作在具備高速圖形工作站式的計算機上進行，具體包括：CPU為 i7-4960(6核12線程），圖形卡為專業麗臺Nvidia Quadro 4000,配備32GB DDR3內存，3TB 高速硬盤。
[0047] 根據PDB數據庫4m66, 4gs6和3dtc對TOPK進行同源建模，建模軟件使用 Modeller。化合物數據選擇：Drug Bank "所有數據庫"。虛擬篩選的軟件選用AutoDock Vina，M0E，ICM-Pro和Glide。根據對接的化合物和TOPK復合物結構，排除結合在活性中心 之外的化合物，對活性中心契合程度較好或幾何形狀匹配的化合物計算評分后排序，其中 化合物1的結合作用最優，與TOPK結合作用的模式見圖1。
[0048] 評分前三位的化合物見表1，將其進行后續的受體-配體結合活性測試做進一步 篩選。
[0049] 表1 TOPK-化合物的計算機分子對接結果
[0051] 二、測定與TOPK酶的結合能力
[0052] I、TOPK蛋白表達和純化
[0053] (I) TOPK基因轉入pET28a質粒，將構建好的測序正確的質粒轉入表達宿主感受態 細胞BL21DE3,挑取單克隆子至5ml含有相應抗性的LB培養基中，37°C，200rpm，搖床過夜 培養。次日按1:100 (體積比）接入含有相應抗性的IL LB液體培養基中，繼續搖床培養至 對數期，使0D600 = 0. 8,加入IPTG至終濃度0. 4mM，轉移至20°C，200rpm繼續誘導培養過 夜。（2)離心收集細胞，加入適量體積的裂解液，超聲破碎細胞，將破碎液體4°C，HOOOrpm 離心30min，分離上清和沉淀，利用AKTA Pure蛋白純化系統，分別采用親和層析、離子交換 層析和分子篩層析純化得到TOPK酶蛋白，供結合實驗使用。
[0054] 2、MST (微量熱泳動儀）測定化合物1與TOPK酶的結合能力
[0055] 待測化合物用DMSO溶解，配制成50mM母液，隨后用緩沖液（20mM HEPES)稀釋成 2. 5mM的初始工作液1，測定緩沖液為含5% DMSO的20mM HEPES。初始工作液1作為結合 力測定的最高濃度，然后用測定緩沖液倍比稀釋工作液1，共稀釋9次，得到10個工作液，工 作液10的濃度為4. 882 μ M。各工作液加入50nM TOPK酶蛋白，在微量熱泳動儀上測定平衡 解離常數KcL待測化合物和TOPK酶蛋白結合的平衡解離常數為Kd見表2 :
[0056] 表2 MST檢測不同化合物與TOPK結合的平衡解離常數Kd
[0058] 實施例三化合物1的體外試驗
[0059] -、體外實驗驗證化合物1抑制TOPK活性，從而抑制其下游激酶ERK2, histone H3 磷酸化。
[0060] 1、體外激酶分析實驗（in vitro kinase assay)，采用體外激酶分析試劑盒，應用 有活性的TOPK激活其下游信號Erk2,并分為化合物1實驗組和對照組，將激酶反應樣品用 Western Blot檢測，觀察化合物1是否抑制TOPK下游激酶Erk2的磷酸化。如圖2所示， 50mM和IOOmM化合物1都能顯著抑制Erk2的磷酸化。
[0061] 2、細胞內信號通路實驗，用EGF作用的結腸癌細胞HCT116,分為化合物1實驗組和 對照組，藥物作用不同時間后，收蛋白樣品，用Western Blot檢測，觀察化合物1是否抑制 TOPK下游激酶Erk2、histone H3的磷酸化。如圖3所示，IOOuM化合物1顯著降低histone H3的磷酸化水平，但是對激酶Erk2的磷酸化影響不大，部分原因可能是由于在體內Erk2和 TOPK能夠互相磷酸化激活造成。
[0062] 二、軟瓊脂集落形成實驗（soft agar assay)驗證化合物1抑制細胞轉化和腫瘤 細胞增殖
[0063] 使高表達TOPK的結腸癌細胞（SW480, HCTl 16)處于不貼壁的單細胞狀態，模擬體 內細胞處于半固液態的情況，在此狀態下，通過比較化合物1實驗組與對照組細胞集落的 大小和數量，檢測細胞轉化和錨定增殖的能力。如圖4和圖5所示為25、50、100 μ M的化合 物1作用于高表達TOPK的結腸癌細胞SW480和HCT116集落計數統計數據，結果表明，各個 濃度的化合物1均能顯著抑制SW480和HCT116細胞的增值，其中100 μ M的化合物1抑制 細胞的增值均超過50%。
[0064] 實施例四動物實驗建立裸鼠荷瘤模型，確證化合物1能在體內水平抑制腫瘤增 殖
[0065] 將15只接種了 HCT116細胞的荷瘤裸鼠隨機等分為治療組（7只）和對照組（8只） 兩組，其中治療組以每日一次l〇〇mg/Kg給予化合物1鈉鹽，對照組只給予空白載體，每周稱 重；從第11天開始每兩天測量腫瘤大小，連續給藥19天后將裸鼠處死，量取腫瘤組織，測量 實驗組和對照組腫瘤塊。在各測量天數，和對照組相比，治療組的腫瘤體積顯著縮小，提示 腫瘤生長受到明顯抑制。在實驗終點，治療組腫瘤體積平均值為111. 〇4±32. 02mm3,對照 組腫瘤體積平均值為285. 37±87. 71mm3,縮小了 61. 1% ;圖6顯示了這種變化。
[0066] 表3化合物1對實驗性腫瘤模型-HCTl 16移植腫瘤的治療作用
[0068] *，Ρ〈0· 05 ;**，P〈0. 01
[0069] 以上具體實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指 出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明 進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種通過抑制腫瘤細胞中高表達的TOPK而抗腫瘤的藥物組合物，其特征在于含有 化合物1 一一5-二氟甲氧基-2-[[ (3, 4-二甲氧基-2-吡啶基）-甲基]-亞磺酰基]-1Η-苯 并咪唑或其可藥用鹽作為活性成分。2. 根據權利要求1所述的藥物組合物，化合物1的可藥用鹽是化合物1與堿金屬、堿土 金屬、胺、胍或含氮雜環化合物形成的鹽。3. 根據權利要求2所述的藥物組合物，化合物1與堿金屬、堿土金屬形成的鹽是鋰鹽、 鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和/或鈣鹽。4. 根據權利要求1所述的藥物組合物，所述Τ0ΡΚ高表達的腫瘤包括：宮頸癌、精原細 胞瘤、睪丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸癌、肝 癌、胰腺癌、胃癌、食管癌、甲狀腺癌和/或膀胱移行上皮癌。5. 根據權利要求1~4任一項所述的藥物組合物，其中還包含藥用載體，并且實質上不 包含化合物1以外的活性成分。6. 根據權利要求5所述的藥物組合物，所述藥用載體為適用于制成口服、注射、吸入、 粘膜給藥或者局部給藥劑型的載體。7. 化合物1或其可藥用鹽在制備通過抑制腫瘤細胞中高表達的Τ0ΡΚ而抗腫瘤的藥物 中的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，化合物1的可藥用鹽是化合物1與堿金屬、堿土金屬、 胺、胍或含氮雜環化合物形成的鹽。9. 根據權利要求8所述的應用，化合物1與堿金屬、堿土金屬形成的鹽是鋰鹽、鈉鹽、鉀 鹽、鎂鹽和/或鈣鹽。10. 根據權利要求7所述的應用，所述Τ0ΡΚ高表達的腫瘤包括宮頸癌、精原細胞瘤、 睪丸淋巴瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌、乳腺癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸癌、肝癌、胰腺 癌、胃癌、食管癌、甲狀腺癌和/或膀胱移行上皮癌。11. 根據權利要求7~10任一項所述的應用，其中所述藥物中還包含藥用載體，并且實 質上不包含化合物1以外的活性成分。12. 根據權利要求11所述的應用，所述藥用載體為適用于制成口服、注射、吸入、粘膜 給藥或者局部給藥劑型的載體。
【文檔編號】A61K31/4439GK105982895SQ201510086072
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月16日
【發明人】朱峰, 李華, 段秋紅, 曾孝玉, 鄭夢竹, 陳捷
【申請人】武漢華杰世紀生物醫藥有限公司, 朱峰, 李華