用于治療心力衰竭和增加心臟功能的不能產生環腺苷酸的腺苷酸環化酶和組合物和方法
【專利說明】用于治療心力衰竭和増加心臟功能的不能產生環腺苷酸的腺 苷酸環化酶和組合物和方法
[0001] 相關申請
[0002] 本專利合作條約（PCT)國際申請根據35U.S.C.§119(e)要求2013年6月7日提交的 美國臨時申請號61 /832，759的優先權權益。上述申請的全文出于所有目的以引用方式明確 并入本文中。
技術領域
[0003] 本發明大體上涉及細胞和分子生物學、基因療法和醫學;且更具體地涉及通過施 用不能產生環腺苷酸的（不能產生cAMP的)腺苷酸環化酶6型(AC6)蛋白質或多肽(也被稱為 "AC6mut"）或編碼AC6mut的核酸序列治療患有心力衰竭或心臟疾病或具有患心力衰竭或心 臟疾病的風險的受試者的組合物方法。
【背景技術】
[0004] 腺苷酸環化酶（心肌細胞和其它細胞中的跨膜蛋白質）是通過生成細胞內cAMP轉 導P-腎上腺素能信號傳導的關鍵效應分子。環-AMP是包括蛋白質激酶A激活在內的下游事 件的第二信使。心力衰竭與受損的cAMP產生相關，cAMP產生與心臟功能緊密關聯。已顯示增 加的心AC 6型(AC6)(在哺乳動物心肌細胞中表達的顯性AC異型體)對衰竭的左心室(LV)具 有多種有益作用。這些包括:1)在心肌病變和急性心肌梗塞中的延長存活、2)與AV阻滯降低 相關的減少的動作電位時程和房室傳導的易化、3)LV擴張和病理性肥大兩者的減小、4)通 過改善的SERCA2a活性、增加的受磷蛋白活性對鈣處置的有效作用和5)增加的心肌肌鈣蛋 白I磷酸化。
[0005] 因此，已經生成了增加細胞內cAMP水平的若干藥物，并且已經在患有心力衰竭的 患者中對其進行了測試。然而，這些藥物通常增加死亡率。當前的看法認定增加細胞內cAMP 水平的藥物和蛋白質對衰竭的心臟有害，且因此不適于治療心力衰竭。

【發明內容】

[0006] 在替代性實施方案中，本發明提供針對心臟疾病或降低的心臟功能治療、改善或 保護(預防)個體或患者的方法，其包括:提供不能產生環腺苷酸的（不能產生cAMP的）腺苷 酸環化酶6型(AC6)蛋白質或多肽(也被稱為"AC6mut"）或可操作地連接到轉錄調控序列的 編碼AC6mut的核酸或基因；或其中含有編碼AC6mut的核酸或基因的表達運載體、載體、重組 病毒或等同物，并且所述表達運載體、載體、重組病毒或等同物可以在細胞中或體內表達所 述編碼AC6mut的核酸或基因；和向需要其的個體或患者施用或遞送所述AC6mut或所述可操 作地連接到轉錄調控序列的編碼AC6mut的核酸或基因或所述表達運載體、載體、重組病毒 或等同物，由此針對所述心臟疾病或降低的心臟功能治療、改善或保護(預防)所述個體或 患者。在替代性實施方案中，所述AC6mut包含在腺苷酸環化酶(AC)多肽的催化核心中具有 不帶電荷的氨基酸或非極性氨基酸對帶電荷的氨基酸或酸性氨基酸的取代的AC多肽。
[0007] 在替代性實施方案中，本發明提供用于以下的方法和體內方法或以下的方法：
[0008] (1)治療患有心臟疾病或心力衰竭或具有患心臟疾病或心力衰竭的風險的受試 者；
[0009 ] (2)針對以下來治療、改善、逆轉其效應、保護或預防個體或患者：
[0010] 心臟疾病、
[0011] 心力衰竭、
[0012] 心臟功能或心輸出量的降低、
[0013]由于心臟感染或心臟病況所致的心臟功能或心輸出量的降低，
[0014] (3)通過增加完整心肌細胞中肌漿網（SR)Ca2+攝取和/或具有縮短的松馳時間的增 加的Ca 2+瞬變來增強完整心肌細胞中的鈣處置，
[0015] ⑷抑制心肌細胞中細胞內CAMP水平的生成，
[0016] (5)保護心肌細胞免受程序化細胞死亡（凋亡）信號影響，或降低在凋亡信號之后 被信號傳導至程序化細胞死亡(凋亡）的心肌細胞數量，或
[0017] (6)在心力衰竭患者中或在患有導致心臟功能或心輸出量降低的心臟感染或心臟 病況的個體中：增加心臟功能或心輸出量，降低癥狀和/或降低死亡率;或降低心力衰竭的 住院頻率，
[0018] 所述方法包括：
[0019] (a)提供：
[0020] (i)不能產生環腺苷酸的（不能產生cAMP的）腺苷酸環化酶6型(AC6)蛋白質或多肽 (也被稱為"AC6mut"），
[0021 ]其中任選地，所述AC6mut是重組的、合成的、擬肽的或分離的AC6mut多肽或肽;或 [0022] (ii)編碼AC6mut的核酸或基因：
[0023]其中任選地，所述編碼AC6mut的核酸或基因可操作地連接到轉錄調控序列，其中 任選地，所述轉錄調控序列是啟動子和/或增強子或心細胞特異性啟動子或肌細胞特異性 啟動子;或
[0024]其中任選地，所述編碼AC6mut的核酸或基因可操作地連接到轉錄調控序列，且任 選地，所述編碼AC6mut的核酸或基因被包含于遞送運載體、載體、表達載體、重組病毒或等 同物中，并且所述遞送運載體、表達運載體、載體、重組病毒或等同物可以在細胞中或體內 表達所述編碼AC6mut的核酸或基因，
[0025] 其中任選地，所述細胞是心細胞或肌細胞；
[0026] 其中所述AC6mut不催化ATP分解為cAMP，或具有催化ATP分解為cAMP的受損能力， 并且任選地，所述催化ATP分解為cAMP的受損能力被定義為所述AC6mut僅具有野生型AC6的 ATP 至 cAMP 的催化活性的約1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95% ,
[0027] 并且當所述AC6mut在體內心肌細胞中表達時，左心室（LV)功能不受影響或不降 低，或LV功能基本上不受影響或基本上不降低，
[0028] 并且任選地，心肌細胞中的AC6mut表達增加肌漿網Ca2+攝取，
[0029] 并且任選地，心肌細胞中的AC6mut表達降低用于SERCA2a激活的EC50，
[0030] 并且任選地，心肌細胞中的AC6mut表達降低受磷蛋白蛋白質的表達，
[0031]并且任選地，所述取代抑制Mg2+結合并且改變Gsa介導的催化核心的激活的效率； [0032] (b)向心細胞或心肌細胞遞送或施用所述AC6mut或所述編碼AC6mut的核酸或基 因，或在心細胞或心肌細胞中表達所述AC6mut，或在心細胞或心肌細胞中表達所述編碼 AC6mut的核酸或基因，
[0033]其中任選地，所述編碼AC6mut的核酸可操作地連接到轉錄調控序列，或任選地，向 心肌細胞或向需要其的個體或患者遞送或施用所述遞送運載體、載體、表達載體、重組病毒 或等同物，
[0034] 并且任選地，向體內心細胞或肌細胞遞送或施用所述編碼AC6mut的核酸或基因是 向心肌或心肌細胞的靶向遞送，或包括向心臟的直接遞送或施用，或包括心內注射或輸注，
[0035] 由此：
[0036] 治療所述患有心臟疾病或心力衰竭或具有患心臟疾病或心力衰竭的風險的受試 者，
[0037] 針對心臟疾病、心力衰竭、心臟功能或心輸出量的降低、由于心臟感染或心臟病況 所致的心臟功能或心輸出量的降低治療、改善或保護(預防)個體或患者，
[0038] 通過增加完整心肌細胞中肌漿網（SR)Ca2+攝取和/或具有縮短的松馳時間的增加 的Ca2+瞬變來增強完整心肌細胞中的鈣處置，
[0039] 抑制心肌細胞中細胞內cAMP水平的生成，
[0040] 保護心肌細胞免受程序化細胞死亡(凋亡)信號影響，或降低在凋亡信號之后被信 號傳導至程序化細胞死亡(凋亡）的心肌細胞數量，或
[0041 ] 在心力衰竭患者中或在患有導致心臟功能或心輸出量降低的心臟感染或心臟病 況的個體中：增加心臟功能或心輸出量，降低癥狀和/或降低死亡率。
[0042] 在替代性實施方案中，所述AC6mut包含在腺苷酸環化酶(AC)多肽的催化核心中具 有不帶電荷的氨基酸或非極性氨基酸對帶電荷的氨基酸或酸性氨基酸的取代的AC多肽，
[0043] 其中任選地，所述不帶電荷的氨基酸或非極性氨基酸是丙氨酸(Ala)，并且任選 地，所述酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp)，或任選地，所述不帶電荷的氨基酸或非極性氨基酸 是Ala并且所述酸性氨基酸是Asp。
[0044] 在替代性實施方案中，所述AC6mut包含：
[0045] 在基于SEQ ID N0:16的腺苷酸環化酶(AC)多肽的催化核心中的第426位具有Ala 對Asp的取代的鼠 AC多肽，其中SEQ ID NO: 17是D = >A取代之后的多肽氨基酸序列（SEQ ID NO: 16是D = >A取代之前的氨基酸序列）；或
[0046] 在基于SEQ ID N0:11的AC多肽的催化核心中的第436位具有丙氨酸或Ala對Asp的 取代的鼠 AC6mut多肽，其中SEQIDN0:12是D = >A取代之后的多肽氨基酸序列（SEQIDN0: 11是D = >A取代之前的氨基酸序列）。
[0047] 在替代性實施方案中，所述AC6是哺乳動物AC6多肽，或所述AC6是人AC6多肽。在替 代性實施方案中，所述人AC6多肽包含在基于SEQ ID N0:10的AC多肽的催化核心中的第426 位具有Ala對Asp的取代的人AC6多肽，其中SEQ ID N0:13是D = >A取代之后的多肽氨基酸序 列（SEQ ID從):10是0 = ^取代之前的氨基酸序列）。
[0048] 在所述方法的替代性實施方案中：
[0049] (a)將所述編碼AC6mut的核酸或基因穩定地插入到細胞的染色體中；
[0050] (b)所述遞送運載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物是或包括：腺相關病毒 (AAV);重組AAV病毒或載體;AAV病毒粒子或腺病毒載體或其任何假型、雜合體或衍生物； [0051 ] (c) (b)的方法，其中所述腺相關病毒(AAV)、重組AAV病毒或載體、AAV病毒粒子或 腺病毒載體是或包括:AAV血清型 AAVrhlO;或其任何雜合體或衍生物；
[0052] (d)所述編碼AC6mut的核酸或基因可操作地連接到受調控的或可誘導的轉錄調控 序列；
[0053] (e)(d)的方法，其中所述受調控的或可誘導的轉錄調控序列是受調控的或可誘導 的啟動子；
[0054] (f)(a)到（e)中任一個的方法，其中向需要其的個體或患者施用可操作地連接到 轉錄調控序列的所述編碼AC6mut的核酸或基因或所述遞送運載體、載體、表達載體、重組病 毒或等同物導致:所述AC6mut在心肌細胞中的革E1向遞送和表達、或AC6mut被釋放到血流或 全身循環中；或
[0055] (g)(a)到⑴中任一個的方法，其中響應體內增加的AC6mut水平的疾病、感染或病 況是心臟收縮功能障礙;充血性心力衰竭(CHF);心臟纖維化;心肌細胞疾病;心肌細胞功能 障礙或心肌細胞凋亡。
[0056] 在所述方法的替代性實施方案中：
[0057] (a)通過口服施用、通過肌內（頂)注射、通過靜脈內（IV)注射、通過皮下（SC)注射、 通過皮內注射、通過鞘內注射、通過動脈內（IA)注射、通過冠狀動脈內或心內注射、通過眼 內注射或施加、通過吸入或通過生物彈射擊(biolistic)粒子遞送系統或通過使用"基因 槍"、氣手槍或HELIOS?基因槍(Bio-Rad Laboratories,Hercules，CA)，向需要其的所述個 體或患者施用或遞送可操作地連接到所述轉錄調控序列的所述編碼AC6mut的核酸或基因； 或所述遞送運載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物，
[0058] 其中任選地，通過靜脈內（IV)注射AAV載體或AAV-9載體來遞送所述編碼AC6mut的 核酸或基因；或
[0059] (b)通過引入到身體內鄰接血流或被血流排放的任何細胞、器官、組織或流體空間 中，向需要其的所述個體或患者施用或遞送可操作地連接到所述轉錄調控序列的所述編碼 AC6mut的核酸或基因；或所述表達運載體、載體、重組病毒或等同物，使得被編碼的AC6mut 蛋白質可以從所述組織中的細胞被分泌并釋放到所述血流中。
[0060] 在所述方法的替代性實施方案中：
[0061] (a)向所述個體、患者或受試者施用刺激或信號，所述刺激或信號誘導所述表達 AC6mut的核酸或基因的表達或誘導或激活(誘導或上調所述表達AC6mut的核酸或基因的表 達的）啟動子(例如，可操作地連接到所述表達AC6mut的核酸或基因的啟動子）；
[0062] (b)向所述個體、患者或受試者施用刺激或信號，所述刺激或信號誘導啟動子的激 活子的合成，其中任選地，所述啟動子是AC基因啟動子或肌細胞細胞特異性啟動子；
[0063] (c)向所述個體、患者或受試者施用刺激或信號，所述刺激或信號誘導所述表達 AC6mut的核酸或基因或所述表達AC6mut的核酸或基因特異性啟動子的天然激活子或合成 激活子的合成，
[0064] 其中任選地，所述天然激活子是內源性轉錄因子；
[0065] (d)(c)的方法，其中所述合成激活子是被設計成特異性地且選擇性地開啟內源性 或外源性靶基因的鋅指DNA結合蛋白質，其中任選地，所述內源性靶標是表達AC6mut的核酸 或基因、或AC6mut或表達AC6mut的核酸或基因的激活子、或可操作地連接到表達AC6mut的 核酸或基因的啟動子的激活子；
[0066] (e) (a)到(c)中任一個的方法，其中所述刺激或信號包括生物劑刺激或信號、光刺 激或信號、化學劑刺激或信號或藥物刺激或信號；
[0067] (f)向所述個體、患者或受試者施用刺激或信號，所述刺激或信號刺激或誘導 AC6mut或表達AC6mut的核酸或基因的轉錄后激活子的表達、或可操作地連接到表達AC6mut 的核酸或基因的啟動子的激活子的表達，或
[0068] (g)向所述個體、患者或受試者施用刺激或信號，所述刺激或信號抑制表達AC6的 核酸或基因的轉錄阻遏物或轉錄后阻遏物、或誘導對表達AC6的核酸或基因的轉錄阻遏物 或轉錄后阻遏物的抑制。
[0069]在替代性實施方案中：誘導所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因的表達、 或誘導可操作地連接到所述表達AC6mut的核酸或基因的所述受調控的或可誘導的啟動子 的表達的所述化學劑或藥物是或包括口服抗生素、強力霉素（doxycycline)或雷帕霉素 (rapamycin);或使用利用強力霉素的tet-調控系統來誘導所述AC6mut或所述表達AC6mut 的核酸或基因或其等同物的表達。
[0070] 在替代性實施方案中：所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因或所述遞送運 載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物被配制在凍干制劑（lyophi late )、液體、凝膠、水 凝膠、粉末、噴劑、軟膏、或水性或鹽水制劑中，或被配制為凍干制劑、液體、凝膠、水凝膠、粉 末、噴劑、軟膏、或水性或鹽水制劑。
[0071] 在替代性實施方案中：所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因或所述遞送運 載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物包括囊泡、水凝膠、凝膠、脂質體、納米脂質體、納 米粒子或納米脂質粒子(NLP)或被配制在囊泡、水凝膠、凝膠、脂質體、納米脂質體、納米粒 子或納米脂質粒子(NLP)中。
[0072] 在替代性實施方案中：所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因或所述遞送運 載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物被配制在分離的細胞或培養的細胞中，并且任選 地，所述細胞是哺乳動物細胞、心細胞、或人細胞、非人靈長類動物細胞、猴細胞、小鼠細胞、 大鼠細胞、豚鼠細胞、兔細胞、倉鼠細胞、山羊細胞、牛科動物細胞、馬科動物細胞、綿羊細 胞、犬科動物細胞或貓科動物細胞。
[0073] 在替代性實施方案中：所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因或所述遞送運 載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物被配制為藥物或無菌的。
[0074] 在替代性實施方案中：所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因或所述遞送運 載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物與制品、人工器官或植入物被配制或遞送，在制 品、人工器官或植入物上被配制或遞送，或結合制品、人工器官或植入物被配制或遞送。
[0075] 在替代性實施方案中：所述AC6mut或所述表達AC6mut的核酸或基因或所述遞送運 載體、載體、表達載體、重組病毒或等同物在體外或離體表達AC6mut多肽。
[0076]在替代性實施方案中，本發明提供用于針對AC6mut響應性病理、感染、疾病、病患 或病況治療、改善、逆轉、保護或預防個體或患者的方法，其包括實施本發明的方法。
[0077] 在替代性實施方案中，本發明提供用于在需要其的個體或患者中治療、改善、逆 轉、保護或預防心臟病變或心血管疾病的方法，其包括實施本發明的方法。在替代性實施方 案中，所述心臟病變或心血管疾病包括:冠狀動脈疾病(CAD);動脈粥樣硬化;血栓形成;再 狹窄;血管炎、自身免疫性血管炎或病毒性血管炎;結節性多動脈炎;變應性肉芽腫血管炎 (Churg-Strass syndrome);高安動脈炎（Takayasu ' s arteritis);川崎病（Kawasaki Disease);立克次體血管炎(Rickettsial vasculitis);動脈粥樣硬化性動脈瘤;心肌肥 大;先天性心臟疾病(CHD);缺血性心臟疾病;絞痛;獲得性瓣膜疾病或心內膜疾病;原發性 心肌病；心肌炎；心律不齊;移植排斥;代謝性心肌病；心肌病變(myocardiomyopathy);充血 性心肌病變、肥大性心肌病變或限制性心肌病變;和/或心臟移植。
[0078] 在替代性實施方案中，本發明提供包括以下：
[0079] 如權利要求1-16中任一項所述的AC6mut;表達AC6mut的核酸或基因；遞送運載體、 載體、表達載體、重組病毒或等同物;腺相關病毒(AAV);重組AAV病毒或載體;或腺病毒載體 或其任何假型、雜合體或衍生物，
[0080] 其中任選地，所述AAV或重組AAV病毒或載體包括AAV血清型AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 或AAV9;恒河猴AAV(AAVrh)或AAVrhlO;或其任何雜合體或衍生物、或表達AC6mut的細胞或 心肌細胞，
[0081] 在制備用于以下目的的藥物中的用途：
[0082] (1)治療患有心臟疾病或心力衰竭或具有患心臟疾病或心力衰竭的風險的受試 者；
[0083 ] (2)針對以下來治療、改善、逆轉其效應、保護或預防個體或患者：
[0084] 心臟疾病、
[0085] 心力衰竭、
[0086]心臟功能或心輸出量的降低、
[0087] 由于心臟感染或心臟病況所致的心臟功能或心輸出量的降低，
[0088] (3)通過增加完整心肌細胞中肌漿網（SR)Ca2+攝取和/或具有縮短的松馳時間的增 加的Ca 2+瞬變來增強完整心肌細胞中的鈣處置，
[0089] (4)抑制心肌細胞中細胞內cAMP水平的生成，
[0090] (5)保護心肌細胞免受程序化細胞死亡（凋亡）信號影響，或降低在凋亡信號之后 被信號傳導至程序化細胞死亡(凋亡）的心肌細胞數量，
[0091] (6)在心力衰竭患者中或在患有導致心臟功能或心輸出量降低的心臟感染或心臟 病況的個體中：增加心臟功能或心輸出量，降低癥狀和/或降低死亡率;或降低心力衰竭的 住院頻率；
[0092] (7)心臟病變或心血管疾病;或
[0093] (8)冠狀動脈疾病(CAD);動脈粥樣硬化;血栓形成;再狹窄;血管炎、自身免疫性血 管炎或病毒性血管炎;結節性多動脈炎;變應性肉芽腫血管炎;高安動脈炎;川崎病;立克次 體血管炎;動脈粥樣硬化性動脈瘤；心肌肥大;先天性心臟疾病(CHD);缺血性心臟疾病;絞 痛;獲得性瓣膜疾病或心內膜疾病;原發性心肌病；心肌炎；心律不齊;移植排斥;代謝性心 肌病;心肌病變;充血性心肌病變、肥大性心肌病變或限制性心肌病變;和/或心臟移植。
[0094] 在替代性實施方案中，如本文所用的或所述的或如本發明的任何方法中的治療制 劑，其用于治療以下疾病或用于以下目的：
[0095] (1)心臟疾病、心力衰竭、心臟功能或心輸出量的降低、由于心臟感染或心臟病況 所致的心臟功能或心輸出量的降低，
[0096] (2)通過增加完整心肌細胞中肌漿網（SR)Ca2+攝取和/或具有縮短的松馳時間的增 加的Ca 2+瞬變來增強完整心肌細胞中的鈣處置，
[0097] (3)抑制心肌細胞中細胞內cAMP水平的生成，
[0098] (4)保護心肌細胞免受程序化細胞死亡（凋亡）信號影響，或降低在凋亡信號之后 被信號傳導至程序化細胞死亡(凋亡）的心肌細胞數量，
[00"] (5)在心力衰竭患者中或在患有導致心臟功能或心輸出量降低的心臟感染或心臟 病況的個體中：增加心臟功能或心輸出量，降低癥狀和/或降低死亡率;或降低心力衰竭的 住院頻率；
[0100] (6)心臟病變或心血管疾病;或
[0101] (7)冠狀動脈疾病(CAD);動脈粥樣硬化;血栓形成;再狹窄;血管炎、自身免疫性血 管炎或病毒性血管炎;結節性多動脈炎;變應性肉芽腫血管炎;高安動脈炎;川崎病;立克次 體血管炎;動脈粥樣硬化性動脈瘤；心肌肥大;先天性心臟疾病(CHD);缺血性心臟疾病;絞 痛;獲得性瓣膜疾病或心內膜疾病;原發性心肌病；心肌炎；心律不齊;移植排斥;代謝性心 肌病;心肌病變;充血性心肌病變、肥大性心肌病變或限制性心肌病變;和/或心臟移植。
[0102] 附圖和下面的說明書中陳述了本發明的一個或多個實施方案的細節。根據說明書 和附圖并且根據權利要求書將顯而易見本發明的其它特征、目標和優點。
[0103] 本文所引用的所有出版物/公開、專利、專利申請在此出于所有目的均以引用方式 明確地并入。
【附圖說明】
[0104] 里1說明本發明的示例性AC6mut的設計、表達、活性和細胞分布：
[0105] 圖1A示意性地說明描繪在本發明的示例性鼠 AC6mut的構造中在C1結構域(細胞內 環）中在