一種乳酸球菌菌株m23及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種乳酸球菌M23及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著抗生素在畜牧生產中大量使用所帶來的種種弊端的日益凸顯，如導致動物腸 道正常菌群失調，動物整體免疫低下，產生耐藥性細菌甚至發生抗生素在畜禽產品中的殘 留，開發替代抗生素的新型環保安全高效的綠色飼料添加劑已成為必然趨勢。
[0003] 近年來，益生菌替代抗生素來促生長、預防和治療炎癥性腸病成為研究的熱點，益 生菌在動物生產中已有廣泛的應用和研究。其中，肉雞飼喂乳酸桿菌的研究越來越多，尤其 乳酸菌制劑在肉雞生產中得到廣泛的應用，它作為一種活性制劑能夠提高肉雞生產性能和 改善腸道環境。目前，乳酸菌種類繁多，不同的益生菌菌種、益生菌的添加水平對促生長效 應也各不相同；而且肉雞日增重也不理想，例如現有羅伊氏乳桿菌單一菌劑、卷曲乳桿菌單 一菌劑及其它們的復合制劑，每克活菌含量僅為l〇7c化，肉雞日增重均在50~52g;北京中 農穎泰生物技術有限公司研制的高端乳酸菌微生態制劑，商品名康福特100,飼喂42天肉雞 日增重為51.97±4.75g;同時由于飼養環境的差異，益生菌結果不一致性變得越來越復雜 因此，尋找一種效果穩定、具有最佳肉雞日增重特點、可制備活性制劑的優良乳酸菌菌種成 為進一步研究的課題。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是，提供一種效果穩定、具有最佳肉雞日增重特點、可 制備活性制劑的優良乳酸球菌菌株M23及其應用。
[000引本發明解決其技術問題采用的技術方案是，
[0006] 本發明從陜西楊凌地區采樣，從散養肉雞腸道中分離篩選出一批乳酸菌，并從中 發現一株尿腸球菌，該菌命名為尿腸球菌，Enterococcus faecium JM23,該菌株JM23已保 藏于中國典型培養物保藏中屯、，其簡稱為JM23,保藏編號為CCTCC Μ 2015679,保藏日期為 2015年11月18日。保藏地址:湖北省武漢市武昌塔挪山，武漢大學保藏中屯、。郵編:430072
[0007] 本發明之一種乳酸球菌菌粉，包括乳酸球菌菌株Μ23。
[0008] 本發明之一種乳酸球菌菌粉的制備方法，包括W下步驟：
[0009] (1)制備乳酸球菌菌株Μ23的種子液；
[0010] (2)制備發酵液:將步驟（1)中制備的種子液轉接到液體培養基中，在36~38°C培 養12~24h，作為發酵用菌種；
[0011] (3)擴大培養:在發酵罐中加入液體培養基，119~125°C滅菌15~30min;滅菌完成 后降溫降至36~38°C;將步驟(2)中制備的發酵液W體積比為0.5~2%的比例接種到液體 培養基中；在溫度36~38°C，轉速100~30化pm，pH 6~7,連續發酵12~2地，即得發酵菌液；
[0012] (4)制備菌粉：將步驟（3)中所得的發酵菌液用超高速離屯、機W轉速6000~ 1000化pm/min離屯、15~25min;棄上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保護劑，加入量為菌泥重 的8~12%，然后攬拌均勻，冷凍干燥20~30h后研成粉末狀，即得乳酸球菌M23菌粉。
[0013] 進一步，包括W下步驟：
[0014] (1)制備種子液:從平板上挑乳酸球菌菌株M23的單菌落接種到MRS液體培養基，在 37°C培養箱培養16h;
[001引（2)制備發酵液:將步驟(2)中制備的種子液W體積比為1%的比例轉接到MRS液體 培養基中，37Γ培養16h，作為發酵用菌種；
[0016] (3)擴大培養:在發酵罐中加入MRS液體培養基，12rC滅菌20min;滅菌完成后，降 溫降至37°C;將步驟(2)中制備的發酵液W體積比為1%的比例接種到MRS液體培養基中；在 溫度37 °C，轉速20化pm，pH 6.5，連續發酵16h，即得發酵菌液。
[0017] (4)制備菌粉:將發酵菌液8000g用超高速離屯、機W轉速8000巧m/min離屯、20min; 棄上清液，收集菌泥，在菌泥中加入保護劑，加入量為菌泥重的10%，然后攬拌均勻，冷凍干 燥24h后研成粉末狀，，即得乳酸球菌M23菌粉。
[0018] 進一步，所述保護劑為脫脂奶粉和甘油按比例為5:1的混合物。
[0019] 本發明之乳酸球菌菌株M23在制備肉雞日糧中的應用。
[0020] 進一步，每千克日糧中含109c化所述乳酸球菌M23。
[0021] 本發明之乳酸球菌菌粉在制備肉雞日糧中的應用。
[0022] 進一步，每千克日糧中添加1克所述乳酸球菌菌粉。
[0023] 本發明之乳酸球菌菌株M23可W較好地耐受胃腸道中不利于細菌生長的因素如 酸、膽鹽并且對腸道致病菌有一定的抑制作用;本發明菌株M23具有較好的可發酵性，具有 大量生產的潛力。本發明由菌株M23制備成乳酸球菌菌粉添加到肉雞日糧中，可W顯著提高 肉雞的生產性能。
[0024] 實驗證明，本發明菌株M23在pH 2.5、膽鹽濃度為0.2%和0.3%的培養基中生長都 不受影響，在培養基pH為2.0時成活率依然高達72%。同時，本發明菌株M23對腸道致病菌鼠 傷寒沙口氏菌W及己氏桿菌都有一定的抑制作用。本發明菌株M23在PH 6.5、溫度37°C、轉 速20化pm/min的條件下，可大量生長，發酵菌液經過低溫高速離屯、得到菌體，經過24小時冷 凍干燥，研磨制成菌粉，每克菌粉的活菌數高達l〇i2cfu。肉雞日糧中添加本發明乳酸球菌菌 粉可使肉雞平均日增重可達59.6 ± 1.7g，飼料轉化率可達1.56 ± 0.12 %。
【附圖說明】
[0025] 圖1為乳酸球菌M23系統發育樹。
[0026] 圖2為尿腸球菌M23耐酸、耐膽鹽對照圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例對本發明進一步加 W說明。
[0028] 實施例1:乳酸菌的分離
[0029] 1、菌株樣品：樣品是從陜西楊凌地區散養肉雞腸道中采集的，取腸道內容物W及 粘膜于4°C保存。
[0030] 2、培養基:MRS培養基(Man Rogosa化arp，MRS)，乳酸菌選擇性培養基，組成如下： 膜蛋白lOg/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，S水合乙酸鋼5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫 801ml/L，憐酸氨二鐘2.0g/L，巧樣酸Ξ胺2.0g/L，屯水合硫酸儀0.58g/L，一水硫酸儘 0.25g/l，碳酸巧20g/L，瓊脂15g/L，蒸饋水1L。
[0031] 3、菌株的分離:采用倍比稀釋法涂布，37Γ培養2地，挑取平板上有明顯溶巧圈的 單菌落，在平板上劃線，多次純化直到菌落的顏色、大小、形態完全一致;將純化的菌落在平 板上于4°C保存，菌液與50%的甘油1:1混合80均勻后保存于-80°C冰箱。
[0032] 4、菌株形態特征及生理生化鑒定:將糞腸球菌在MRS固體培養基平板上37Γ培養 2地，形成乳白色的圓形菌落，邊緣整齊光滑。經經革蘭氏染色、過氧化氨、硝酸鹽、硫化氨等 試驗鑒定，糞腸球菌的生理生化特征為:革蘭氏染色陽性，球狀;出S反應、過氧化氨酶、硝酸 鹽還原均為陰性。
[0033] 5、活性菌株的分子鑒定:提取乳酸菌菌株的基因組，參照天根的DNA提取試劑盒提 取的，PCR引物為細菌16S rRNA序列通用引物：
[0034] 正向引物27尸(5'-46461'1764了〇：了66(：1^46-3')，如沈0 10^:1所示；
[003引反向引物14923(5'-667^0：1767^〔64(：1'1'-3')，如沈0 10備:2所示；
[0036] 擴增菌株leSrRNA基因，PCR反應體系：20微升體系，mix 10微升，上下游引物各1微 升，基因組1微升，滅菌水7微升;PCR反應條件為:95°C10min;95°C30s;55°C30s;72°C90s;30 個循環，72°C延伸lOminJCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用全式金的膠回收 試劑盒回收片段，回收樣品送送南京金絲瑞測序公司測序，將測序的結果輸入NCBI網站上 的BLAST程序進行比對，結果顯示菌株M23與GenBank基因庫中腸球菌屬中的linterococcus faeciumEnterococcus faecium的 16S rRNA序列同源度最高，同源率達98.98%。
[0037] 6、菌株系統發育分析:將菌株的16S rRNA序列與從GenBank數據庫中獲得的糞腸 球菌16S rRNA序列作比較，DNAStarlOO軟件包進行多序列匹配排列并進行系統進化樹構建 見圖1。從該菌16S rRNA構建的系統發育樹上看，菌株M23與糞腸球菌Enterococcus faecium發育關系最近，分在同一類群中，序列同源性為98.98%。根據生物學領域的通常認 知，16S rRNA基因序列同源性小于93%~95% ,可認為屬于不同屬，同源性低于98%，可W 認為屬于不同種。因此，基于系統發育樹和16S rRNA同源性角度，菌株M23是腸球菌屬中的 一個新成員，將其命名為linterococ州S faecium M23。
[0038] 綜上，根據形態學特性、生理生化特征、分子生物學鑒定，并結合文獻報道，確定菌 株M23為乳酸球菌M23。
[0039] 實施例2:乳酸球菌M23耐酸、耐膽鹽的研究
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