一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于抗蟲蛋白及生物安全技術領域，具體涉及一種人工合成的Bt抗蟲基 因FLIa及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布非常廣泛的 革蘭氏陽性菌，屬于原核生物（Procaryotic organism)細菌綱（Bacteria)芽胞桿菌科 (Bacillaceae)芽胞桿菌屬（Bacillus)。
[0003]Bt在芽孢形成過程中產生一種具有高度特異性殺蟲活性的伴胞結晶蛋白，稱為 δ-內毒素或殺蟲晶體蛋白（insecticidalcrystalprotein，ICP)。在昆蟲幼蟲的中腸道 內借助于蛋白酶的水解，原毒素轉型為多肽分子，活化了的毒素可以與敏感昆蟲腸上皮細 胞表面的特異性受體相互作用，誘導細胞產生一些孔道，擾亂細胞的滲透平衡，并引起細胞 腫脹甚至產生裂解，伴隨著上述過程幼蟲將停止進食就，最終導致死亡。Bt殺蟲蛋白對鱗翅 目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種昆蟲具有特異性的殺蟲活性。
[0004]Bt殺蟲晶體蛋白分為Cry類蛋白和Crt類蛋白2大類。將具有溶胞作用的Bt殺 蟲蛋白歸到Cyt類，其余歸為Cry類，相應的基因記為Cyt和Cry。彼此之間氨基酸同源性 不超過45%的Bt殺蟲蛋白命名為不同的第一分類等級，采用阿拉伯數字書寫，如Cryl和 Cry2 ;氨基酸同源性在45%~78%之間為第二分類等級，用大寫英文字母表示，如Cry1A和 Cry1B;氨基酸同源性在78%~95%之間為第三分類等級，用小寫英文字母表示，如CrylAa 和CrylAb;氨基酸同源性大于95%為第四分類等級，也是最終等級，用阿拉伯數字書寫，如 CrylAal和CrylAa2。目前，已經報道的Bt已增至476種，其中Cry分為58群、449種，Cyt 分為2群、27種。
[0005] 蟲害是造成作物減產、品質下降的重要因素之一，我國每年因蟲害造成水稻減產 10 %、小麥減產20 %、玉米減產10 %~50 %及甘蔗減產5 %~20 %，故減少蟲害造成的損失 是增加糧食作物及經濟作物產量及品質的重要途徑。但是，很多禾本科作物缺乏抗蟲種質 資源，因此，將外源抗蟲基因導入禾本科作物的研究具有更重大的生產意義。
[0006] 自從轉Bt殺蟲蛋白基因作物問世以來至上個世紀末，世界范圍內相繼有二十多 個國家和地區開始種植轉Bt基因的農作物。而近10年來隨著轉Bt殺蟲基因農作物的不 斷推出和種植面積的持續上升，除歐洲之外，幾乎全球所有的陸地都種植了轉Bt殺蟲基因 農作物。據統計2009年全球的轉Bt殺蟲基因農作物種植總面積超過了 5億公頃，占全部 轉基因農作物種植面積的36%。其中2. 17億公頃種植了只含有Bt殺蟲基因的轉基因農作 物，2. 87億公頃種植了轉抗除草劑基因和Bt殺蟲基因的農作物。美國是轉Bt殺蟲基因作 物種植面積最大的國家，其次是印度、阿根廷、巴西和中國。盡管轉BtCry殺蟲基因作物對 環境的影響在政府和公眾之間存在較大的爭議，但是Bt殺蟲基因農作物產生的巨大生態 效益卻得到了廣泛的認可。通過監測農藥環境影響指數發現，1996-2008年種植轉基因作物 共減少農藥使用量35. 5萬噸（占總農藥使用量的8. 4% )。僅2008年一年就減少農藥使 用量3. 46萬噸（占總農藥使用量的9. 6% )，在整個生態網絡中農藥環境影響指數降低了 18. 2%〇
[0007] 通過轉基因技術，可以將抗蟲基因導入玉米品種中，進而提高轉基因玉米的抗蟲 性，降低農藥的使用量，節省人力、物力及社會資源。因此，應用新的高抗昆蟲蛋白、提高殺 蟲蛋白的表達量以及培育新型轉基因抗蟲玉米是解決上述問題的最有效途徑之一。美國的 科學家把Cry基因轉入玉米和棉花中，轉基因玉米和棉花在美國成功地上市，至今未發現 它們對人類有任何負面影響，這種轉基因作物對于環境的貢獻是巨大的。在中國，也有許多 科學家在致力于轉Bt基因玉米的研究。中國農業大學的王國英教授研究的轉Bt基因玉米 已經在國內進行了環境釋放。轉Bt基因玉米在中國的商業推廣將給玉米生產和種植者帶 來極大的收益。中國自2008年國家啟動《轉基因生物新品種培育科技重大專項》后，在轉 基因抗蟲玉米品種培育方面雖有些報道，但卻沒有能夠最終商業化，這主要歸結于Bt基因 的抗蟲效果及轉化植株的穩定性。

【發明內容】

[0008] 為了解決現有技術存在的問題，本發明提供一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa及 其制備方法和應用。
[0009] 本發明為解決技術問題所采用的技術方案如下：
[0010] 本發明的一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa，該基因的核苷酸序列如序列表中的 SEQIDN0:1 所示。
[0011] 本發明還提供一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序 列如序列表中的SEQIDN0:2所示。
[0012] 本發明還提供一種植物表達載體pTFlOl. 1-ubi-FLIa，該載體含有人工合成的Bt 抗蟲基因FLIa，該載體的核苷酸序列如序列表中的SEQIDN0:3所示。
[0013] 進一步的，用EcoRI和HindIII酶切植物表達載體pCAMBIA3300,回收酶切位點 間的片段ubi-nos，連入植物表達載體pTFlOl. 1的EcoRI和HindIII位點間，構建植物 表達載體PTF101.Ι-ubi;將人工合成的兩端帶有SmaI和SacI酶切位點的Bt抗蟲基因 FLIa，連入植物表達載體pTFlOl.Ι-ubi的SmaI和SacI位點間，構建抗蟲基因FLIa的植 物表達載體PTF101.Ι-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
[0014] 進一步的，該植物表達載體pTFlOl.Ι-ubi-FLIa包括：P35S啟動子、TEV增強子、 bar基因、大豆貯藏蛋白基因vsp終止子、玉米ubi啟動子、FLIa基因和根癌農桿菌胭脂堿 合成酶基因nos終止子。
[0015] 本發明還提供了制備上述人工合成的Bt抗蟲基因FLIa的方法，包括以下步驟：
[0016] 步驟一、將抗蟲基因CrylAb的DomainI和DomainII與抗蟲基因Crylla的 DomainIII進行交換融合，獲得重組抗蟲基因MCryll;
[0017] 步驟二、在重組抗蟲基因MCryll的基礎上，在3'端連入抗蟲基因Cryljal的碳末 端，得到重組抗蟲基因FLMCrylla;
[0018] 步驟三、對重組抗蟲基因FLMCrylla進行密碼子改造，獲得Bt抗蟲基因FLIa，其核 苷酸序列如序列表中的SEQIDNO: 1所示。
[0019] 進一步的，步驟二中，所述重組抗蟲基因FLMCrylla與Cry基因氨基酸序列最大同 源性為88%。
[0020] 進一步的，步驟三中，對重組抗蟲基因FLMCrylla進行密碼子改造包括：基因編碼 框優化、消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子、二級結構最小化、調整GC含量。
[0021] 本發明提供一種提高轉基因植物抗蟲性的方法，將上述人工合成的Bt抗蟲基因 FLIa轉化植物中，提高轉化植物的抗蟲性。
[0022] 本發明提出一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa在提高轉基因植物抗蟲性中的應 用。
[0023] 本發明的有益效果是：
[0024] 本發明人工合成的Bt抗蟲基因FLIa可在轉化植物中穩定遺傳和表達，且表達量 高，所得轉基因植物抗蟲性好。
[0025] 本發明人工合成的Bt抗蟲基因FLIa為抗蟲性基因的推廣及商業化奠定基礎。此 外，該基因轉化玉米、棉花、水稻、蔬菜等農作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農藥 的使用量，以減少環境污染和生產成本。
[0026] 本發明培育出抗蟲植物的方法簡便而有效，為提高植物抗蟲提供了新的有效選 擇，具有重要的經濟價值和廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0027] 圖1為重組抗蟲基因FLMCrylla的獲得過程示意圖。
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