乳酸乳球菌（Lactococcus lactis） CAMT22361在降解T?2毒素中的應用
【專利摘要】本發明屬于毒素生物處理技術領域，具體公開了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）CAMT22361在降解T?2毒素中的應用，所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO.M2015295。所述乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361的發酵液與T?2毒素反應72小時后對T?2毒素降解率可以達到61％。將其應用在飼料中T?2毒素的去除，降解率達到50%以上。本發明的乳酸乳球菌Lactococcus lactis CAMT22361具有高效快速降解T?2毒素的能力，在生物降解飼料等中T?2毒素具有很好的應用前景。CCTCC No.M2013
【專利說明】
乳酸乳球菌(AaciOcocciys /aci7s ) GAMT22361 在降解T-2毒 素中的應用
技術領域
[0001] 本發明屬于毒素生物處理技術領域，更具體地，涉及乳酸乳球（Zaciococcus 2aciis )CAMT22361在降解T-2毒素中的應用。
[0002]
【背景技術】
[0003] T-2毒素即4,15-二乙酰氧基-8-(異戊酰氧基)-12,13-環氧單端孢霉-9-烯-3醇， 屬倍半萜烯類化合物，為單端孢霉族毒素中的典型代表。主要由擬枝孢鐮孢菌(FMari? Sj〇o_roiricoic/es)、木賊鏡抱菌（/7 t/sarit/? e<7t/iseii)、梨抱鏡抱菌（/7 t/sari? pose)、串 珠鐮孢菌(/7 usari? act/?i/3a 等真菌產生的毒性次級代謝產物。T-2毒素可以通過不 同途徑對人畜的各種組織和器官產生毒害作用，尤其對增殖活躍細胞如骨髓、肝臟、淋巴細 胞和粘膜上皮細胞等危害嚴重，最終可導致致畸，甚至致癌等。1973年，聯合國糧農組織 (FA0)和世界衛生組織(WHO)把T-2毒素劃為自然界存在的最危險的食品污染源。T-2毒素不 僅毒性強，而且污染率較高。隨著國際貿易的發展和國際糧食運輸日漸頻繁，加速了產毒真 菌在世界范圍內的傳播，導致人類食用糧與動物飼料被污染的機率加大。因此，預防產毒真 菌的污染、T-2毒素的檢測以及T-2毒素的有效降解等方面的研究引起廣泛的關注。目前用 于去除T-2毒素的物理法、化學法及生物法。
[0004] 用于去除T-2毒素的物理法，如利用蒙脫石、鋁硅酸鹽、硅藻土、環湖精和凹凸棒石 等，雖然對糧食或飼料中的T-2毒素有較高的脫除效率，但仍達不到完全清除的效果，甚至 有的吸附劑還能將一定量的營養物質吸附掉。加熱法利用熱降解機制破壞毒素，操作簡單， 但需要設備且需要消耗能源。紫外與γ射線光輻照照射破壞毒素的化學結構，使之降解，該 技術具備高效、快速和避免二次污染的優點，但需要投入輻照設備，且輻照對操作人員健康 有一定的影響。
[0005] 用于去除Τ-2毒素的化學法，如氫氧化鈉、氨、次氯酸鈉、臭氧、阿魏酸等，化學試劑 可與毒素發生一定的化學反應，起到轉化降解的作用，從而達到降低或去除的目的。總的來 說，這類方法較物理法效果好，但化學試劑可能會有一定的殘留，引起二次污染。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于根據現有技術中的不足，提供了乳酸乳球菌（ZaciococctAS 2aciis)CAMT22361在降解T-2毒素中的應用。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種降解T-2毒素的方法。
[0008] 本發明的再一個目的是提供一種降解飼料中T-2毒素的方法。
[0009] 本發明的目的通過以下技術方案實現： 本發明提供了乳酸乳球菌laciococcus CAMT22361在降解T-2毒素中的應用， 所述乳酸乳球菌laciococct/s _/aciis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中國典型培養物 保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC No. M2015295。
[0010] 所述乳酸乳球菌Zaciococcus Jaciis CAMT22361 的 16S rDNA 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 所述乳酸乳球菌Zaciococct/s CAMT 22361在MRS平板上菌落呈圓形、不透 明、菌落為白色突起、有光澤、邊緣整齊，菌株革蘭氏染色在顯微鏡下菌體形態為球形，革蘭 氏染色呈陽性。
[0012] 本發明同時提供一種降解T-2毒素的方法，包括如下步驟： 51. 將乳酸乳球菌Zaciococcus iaciis CAMT 22361接種于培養基中，發酵得到培養 液； 52. 將S1得到培養液加入到含T-2毒素的物質中，進行T-2毒素的降解； 所述乳酸乳球菌laciococct/s _/aciis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中國典型 培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015295。
[0013] 優選地，S1中所述培養液的菌體濃度為（1~9) X108 CFU/mL。
[0014] 優選地，S2中培養液按照6~8%的接種量加入到含T-2毒素的物質中。
[0015] 優選地，所述含T-2毒素的物質為含T-2毒素的飼料。
[0016] 本發明同時再提供一種降解飼料中T-2毒素的方法，包括如下步驟： 51. 將乳酸乳球菌Zaciococct/s CAMT 22361接種于培養基中，發酵得到菌體 濃度為(1~9) X 108 CFU/mL培養液； 52. 將S1得到培養液按照6~8%的接種量加到飼料中，同時添加水分使發酵混料終水分 含量達45~50%，35~38 °C發酵，進行T-2毒素的降解； 所述乳酸乳球菌laciococct/s _/aciis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中國典型 培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015295。
[0017] 將所述乳酸乳球菌hciis CAMT 22361的發酵液對T-2毒素進行降 解，在72小時后其降解率可達到61%，將其應用在飼料中T-2毒素的去除，降解率達到50%以 上。顯示了其較強的降解效果。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果： 本發明提供了一株具有降解T-2毒素的乳酸乳球菌CAMT22361，所述菌株能夠顯著降解 T-2毒素，其發酵液與T-2毒素反應72小時后對T-2毒素降解率可以達到61%。將其應用在飼 料中T-2毒素的去除，降解率達到50%以上。本發明的乳酸乳球菌CAMT22361具有高效快速降 解T-2毒素的能力，在生物降解飼料等中T-2毒素具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1為乳酸乳球菌CAMT22361形態特征圖，A為菌落圖，B為顯微圖。
[0020] 圖2為基于乳酸乳球菌CAMT22361的16S rRNA與相關菌種的系統發育樹。SHAPE \* MERGEF0RMAT 。
【具體實施方式】
[0021]以下結合具體實施例和附圖來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何 形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法 和設備。
[0022]除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。
[0023]實施例1 :菌株的分離與鑒定 乳酸菌分離：用滅菌海水沖洗沙蟲表面，晾干，稱取25 g腸道樣品并剪碎。采用10倍稀 釋法進行稀釋，并涂布于含有1.5%|丐的MRS固體培養基上，在25 °C下培養3~5 d后觀察， 挑取有溶鈣圈的菌落純化，然后進行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗。將革蘭氏染色陽性、過 氧化氫酶試驗陰性的菌株確認為乳酸菌，并進行斜面保存。
[0024]具有降解T-2毒素乳酸菌的篩選:將分離到的乳酸菌接種加到每毫升含有50 ng T-2毒素的改良的MRS液體培養基中，（改良的MRS培養基配方g/L:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g K2HP〇4 2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgS〇4.7H20 0.58 g， MnS〇4,4H20 0.25 g，蒸餾水 1000 mL，pH 6.2~6.4)，使菌的濃度達到1080?1]/11^，與不接 菌的做對照。將其放在37 °C下150 r/min搖床培養72 h。再吸取發酵液2 mL于一玻璃管 中，并加入2 mL乙酸乙酯，超聲萃取10 min，旋禍混合5 min，4000 r/min離心10 min，取上 層液于另一玻璃管中，反復提取3次，合并提取液。將提取液在60 °C氮吹儀下吹干。吸取2 mL 30%甲醇水溶解，旋渦5 min，用一次性無菌注射器吸取，并經過0.22 uL濾膜過濾于樣品 瓶中，通過L C - M S / M S檢測。結果發現，接種菌株C A Μ T 2 2 3 61的與對照的（即沒有接種 CAMT22361)相比，其Τ-2毒素的降解率為61%。由此篩選到降解Τ-2毒素能力較強的菌株 CAMT22361。
[0025] 乳酸乳球菌CAMT22361形態學和生化鑒定：在MRS平板上菌落凸起、圓形、邊緣整 齊、乳白色、不透明的光滑型菌落(見圖1，A);細胞為球形，革蘭氏染色呈陽性(見圖1，B);其 生長溫度范圍為10 °C~45 °C，最適生長溫度是30 °C;其生長pH范圍為3~10,最適pH為 6~7;不運動，能發酵麥芽糖、半乳糖、核糖、乳糖產酸，水解精氨酸，不發酵蜜二糖、棉籽糖 和松三糖，不產生硫化氫，還原0.1%的美蘭牛乳，可忍受4.5%的NaCl。
[0026] 乳酸乳球菌CAMT22361基因水平鑒定：通過16S rDNA特異性引物(27F與1492R)進 行PCR擴增，27F的序列見SEQIDN0:2所示，1492R的序列見SEQIDN0:3所示，并經生工生 物工程(上海)股份有限公司測序，并將所測基因序列與GenBank相關數據進行BLAST相 似性分析，下載相似性高的相關菌株的模式菌株序列，利用MEGA 5. 0軟件，采用鄰接法（ Neighbor-Joiningmethod)進行聚類分析和系統進化樹構建，乳酸乳球菌CAMT22361系統 發育樹見圖2。
[0027] 乳酸乳球菌Zaciococct/s _/aciis CAMT22361于2015年5月13日保藏于中國典型培 養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC No. M2015295。
[0028] 實施例2: 1、乳酸乳球菌CAMT22361活化 在超潔凈操作臺中，挑取上述乳酸乳球菌CAMT22361接種在實施例1中改良的MRS液體 培養基中（pH為6.2~6.4)，37 °C搖床培養24 h，得到活化菌液。
[0029] 2、接種發酵液 在超潔凈操作臺中，取一定量活化菌液，10000 r/min離心2 min，棄上清，用無菌生理 鹽水洗兩次沉淀后重懸到原來體積，以無菌水為空白對照，測〇D6QQ nm，并用無菌生理鹽水 稀釋至吸光值為0.3，制成菌懸液，并按1%的接種量將菌懸液接種在改良的MRS液體培養基 中上，使肉湯培養基的初始菌數大約為1 〇8 CFU/mL。
[0030] 3、T-2毒素的添加 添加 Τ-2毒素到初始菌數大約為108 CFU/mL的改良的MRS液體培養基中，Τ-2毒素初始 濃度為50.0 ng/mL。以含有50.0 ng/mL的T-2毒素的無菌PBS作為對照。懸浮液于37 °C搖床 培養72h(150 r/min)。
[0031] 4、Τ-2毒素提取與檢測 菌株的發酵液取三管，每管2 mL，加入2 mL乙酸乙酯，超聲萃取10 min，旋渦混合5 min，4000 r/min離心1 Omin，取上層液于另一試管中，反復提取3次，合并提取液。將提取液 在60 °C氮吹儀下吹干。吸取2 mL 30%甲醇水溶解，旋渦5 min，用一次性無菌注射器吸取， 并經過0.22 uL濾膜過濾于樣品瓶中，通過LC-MS/MS檢測，記錄實驗數據。
[0032] 其中，LC-MS/MS方法檢測條件如下： 液相色譜質譜聯用儀:TSQ Quantum Access，美國THERMO Fisher; 4.1色譜條件 色譜柱:Hypersil Gold (100mm X 2.1mm, 5yL);流動相：甲醇_5mmol/L乙酸銨溶液 (含0.1%甲酸）。進樣量：10yL;針頭到瓶底距離：1.0mm;進樣速度：10.0 yL/s;淋洗體積：1500 此;淋洗速度：100 · 00yL/s; 沖洗體積：1500yL;進樣速度：250.0 yL/min。梯度洗脫條件見表1。流動相:A:甲醇B: 5mmol/L乙酸銨溶液(含0· 1%甲酸） 表1
4. 2質譜條件 噴霧電壓：4500V;鞘氣壓力：35au;輔助氣壓：15au;毛細管溫度：270°C;碰撞壓： 1.5mT〇rr。離子化模式電噴霧電離正離子(ESI+)模式，選擇二級質譜中響應值較高的兩個 子離子作為定性離子，響應值最高的作為定量離子進行選擇離子掃描模式質譜條件優化， 結果如表2所示。
[0033]表 2
5、 數據處理 T-2毒素的去除率計算： T-2去除率/% =( 1-樣品中T-2含量/空白對照中T-2含量）X 100 計算得到本發明CAMT22361發酵72h后其發酵液T-2濃度(ng/mL)為1.663±0.064(ng/ mL)，降解率為61%。（樣品中添加毒素初始濃度為50 ng/mL)。
[0034] 實施例3:乳酸乳球菌CAMT22361對南美白對蝦飼料中T-2毒素的降解作用 1、乳酸乳球菌CAMT22361菌懸液制備 在超潔凈操作臺中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接種于MRS肉湯培養基中， 37 °C培養24~28 h，使菌懸液終濃度達到108 CFU/mL。
[0035] 2、Τ_2毒素毒液配制 精確稱取Τ-2毒素標準品(Enzo，USA，純度彡98%) 1 mg溶解在乙腈，定容至lmL，配制成 1 mg/mL T-2毒素毒液。
[0036] 3、南美白對蝦帶毒餌料的制備 將對蝦基礎飼料(進口魚粉33%，烏賊粉4%，豆柏18%，花生柏8%，蝦糠4%，礦物質預混料 1%，高筋面粉22%，魚油1%，大豆磷脂3%，預混料5.7 %，復合維生素0.3%，粉碎至全部飼料通 過40目篩。將2 mL T-2毒素毒液均勻噴灑在1 Kg粉碎后的對蝦基礎飼料中，即每Kg飼料中 含2 mg T-2毒素。
[0037] 4、接種發酵液降解T-2毒素 將濃度為1〇8 CFU/mL菌懸液按8%的接種量以噴灑的方式均勻接種到含T-2毒素的南美 白對蝦餌料中，同時仍以噴灑方式補加水份，使發酵混料的水分含量達45~50%，37 °C靜止 發酵4天，取出晾干。
[0038] 5、南美白對蝦中T-2毒素降解率檢測 稱取接種發酵后對奸帶毒t耳料2.0 g，加入15 mL乙酸乙酯，10，000 r/min均質均勾， 超聲并振蕩10 min，4 000 r/min，離心10 min，取上清，殘渣再加入15 mL乙酸乙酯，同樣操 作，重復2次，合并上清液。將上述上清提取液用氮吹儀濃縮吹干，用1 mL 30%甲醇復溶，采 用實施例2中LC-MS/MS方法檢測條件檢測T-2毒素含量。
[0039] 測定后，乳酸乳球菌CAMT22361發酵后的每Kg飼料含T-2毒素0.88 mg，按T-2去除 率/% =( 1-樣品中T-2含量/空白對照中T-2含量）X 100計算，T-2去除率為56%。
[0040] 實施例4:乳酸乳球菌CAMT22361對羅非魚飼料中T-2毒素的降解作用 1、乳酸乳球菌CAMT22361菌懸液制備 在超潔凈操作臺中，挑取斜面保存的乳酸乳球菌CAMT22361接種于MRS肉湯培養基中， 37 °C培養24-28 h，使菌懸液終濃度達到108 CFU/mL。
[0041 ] 2、T-2毒素毒液配制 精確稱取Τ-2毒素標準品(Enzo，USA，純度彡98%) 1 mg溶解在乙腈，定容至lmL，配制成 1 mg/mL T-2毒素毒液。
[0042] 3、羅非魚帶毒餌料的制備 將羅非魚基礎飼料(麥皮10%，次粉20%，進口魚粉12%，豆柏30%，米糠5%，Ca(H2P〇4) 2 1%，菜籽柏20%，預混料2%)混勻并粉碎，粉碎至全部飼料通過40目篩。將2 mL T-2毒素 毒液均勾噴灑在1 Kg粉碎后的對4下基礎飼料中，即每Kg飼料中含2 mg T-2毒素。
[0043] 4、接種發酵液降解T-2毒素 將濃度為1〇8 CFU/mL菌懸液按8%的接種量以噴灑的方式均勻接種到含T-2毒素的羅非 魚餌料中，仍以噴灑方式補加水份，使發酵混料終水分含量達45~50%，37 °C靜止發酵4天， 取出晾干。
[0044] 5、羅非魚飼料中T-2毒素降解率檢測 稱取接種發酵后羅非魚t耳料2.0 g，加入15 mL乙酸乙酯，10，000 r/min均質均勾，超 聲并振蕩10 min，4 000 r/min，離心10 min，取上清，殘渣再加入15 mL乙酸乙酯，同樣操 作，重復2次，合并上清液。將上述上清提取液用氮吹濃縮吹干，用1 mL 30%甲醇復溶，采用 實施例2中LC-MS/MS方法條件檢測T-2毒素含量。
[0045] 測定后，乳酸乳球菌CAMT22361發酵后的每Kg飼料含T-2毒素0.94 mg，按T-2去除 率/% =( 1-樣品中T-2含量/空白對照中T-2含量）X 100計算，T-2去除率為53%。
【主權項】
1. 乳酸乳球菌(Zac iocoecus 2aciis)CAMT22361在降解T-2毒素中的應用，其特征 在于，所述乳酸乳球菌Zaciococct/s _/aciis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中國典 型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:M 2015295。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述乳酸乳球菌Zaciococcus iaciis CAMT22361 的 16S rDNA 序列如SEQ ID N0:1 所示。3. -種降解T-2毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 將乳酸乳球菌Zaciococcus Jaciis CAMT 22361接種于培養基中，發酵得到培養 液；52. 將S1得到培養液加入到含T-2毒素的物質中，進行T-2毒素的降解； 所述乳酸乳球菌laciococct/s _/aciis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中國典型 培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:M 2015295。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，S1中所述培養液的菌體濃度為（1~9) X108 CFU/mL〇5. 根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，S2中培養液按照6~8%的接種量加入到 含T-2毒素的物質中。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述含T-2毒素的物質為含T-2毒素的飼 料。7. -種降解飼料中T-2毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 將乳酸乳球菌Zaciococct/s _/aciis CAMT 22361接種于培養基中，發酵得到菌體 濃度為(1~9) X 108 CFU/mL培養液；52. 將S1得到培養液按照6~8%的接種量加到飼料中，同時添加水分使發酵混料終水分 含量達45~50%，35~38 °C發酵，進行T-2毒素的降解； 所述乳酸乳球菌laciococct/s _/aciis CAMT 22361于2015年5月13日保藏于中國典型 培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:M 2015295。
【文檔編號】A23L5/20GK106036377SQ201610641630
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月8日 公開號201610641630.6, CN 106036377 A, CN 106036377A, CN 201610641630, CN-A-106036377, CN106036377 A, CN106036377A, CN201610641630, CN201610641630.6
【發明人】劉穎, 王雅玲, 徐春厚, 孫力軍
【申請人】廣東海洋大學