本發明涉及了同源伴侶元件(jian)相關(guan)序列及其在提高pet塑料(liao)降解酶可溶表(biao)達中(zhong)的應用，屬于生物。

背景技術：

1、近(jin)年來，隨著廢塑(su)(su)(su)料環(huan)境污染的(de)(de)越(yue)來越(yue)被關注，發展(zhan)廢塑(su)(su)(su)料生物(wu)降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)技術(shu)已成為(wei)國際學術(shu)的(de)(de)研(yan)究熱(re)點。其中聚對苯二甲酸乙二醇酯(polythylene?terephthalate，pet)塑(su)(su)(su)料的(de)(de)生物(wu)降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)已經(jing)取得重要(yao)進(jin)展(zhan)，為(wei)聚酯型塑(su)(su)(su)料的(de)(de)生物(wu)降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)與(yu)轉化提供了理論基礎與(yu)技術(shu)支(zhi)撐。2016年，日本yoshida等(deng)從pet瓶回收廠收集(ji)了包(bao)括沉(chen)淀(dian)物(wu)、土壤、廢水(shui)(shui)和(he)(he)(he)活性(xing)污泥(ni)等(deng)250個樣本，從中篩選(xuan)出一種(zhong)可(ke)利用低結晶(jing)度(du)(1.9％)pet膜作為(wei)主要(yao)碳源(yuan)的(de)(de)菌株(zhu)大(da)阪伊德氏桿(gan)菌ideonella?sakaiensis?201-f6。將該細菌產生的(de)(de)pet降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)酶ispetase在(zai)(zai)30℃下與(yu)pet薄膜(1.9％)孵育6周(zhou)(zhou)后，將pet薄膜降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)為(wei)低分子量的(de)(de)低聚物(wu)或(huo)單體，但petase的(de)(de)降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)能力和(he)(he)(he)穩定性(xing)較差。2022年hongyuan?lu等(deng)通過(guo)機器學習對ispetase進(jin)行計算輔(fu)助重設計，獲得高穩定性(xing)和(he)(he)(he)催化活性(xing)的(de)(de)突變體fastpetase，來自51種(zhong)不同熱(re)成型產品(pin)的(de)(de)未經(jing)處理的(de)(de)消費(fei)后pet都可(ke)以在(zai)(zai)1周(zhou)(zhou)內被fast-petase幾(ji)乎完全降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)。然(ran)而，塑(su)(su)(su)料降(jiang)(jiang)(jiang)解(jie)(jie)酶ispetase的(de)(de)蛋白質表(biao)(biao)面疏水(shui)(shui)性(xing)強(qiang)，在(zai)(zai)異源(yuan)重組表(biao)(biao)達(da)中表(biao)(biao)達(da)水(shui)(shui)平低且(qie)容(rong)易發生聚集(ji)沉(chen)淀(dian)形成包(bao)涵體，嚴重影響(xiang)可(ke)溶性(xing)表(biao)(biao)達(da)水(shui)(shui)平。

2、分子(zi)伴侶通常可(ke)以被(bei)定義(yi)為(wei)幫助(zhu)其他生物大分子(zi)(如蛋(dan)(dan)(dan)白質)折疊(die)或組(zu)裝(zhuang)成相(xiang)應功能活性構象，但不(bu)參與最(zui)終結構組(zu)成的任何蛋(dan)(dan)(dan)白質。分子(zi)伴侶能分別或通過(guo)協同作(zuo)用參與蛋(dan)(dan)(dan)白質的折疊(die)過(guo)程，有利于促進蛋(dan)(dan)(dan)白質正確折疊(die)和可(ke)溶性表(biao)達。

3、雖然，目前已經有商業化(hua)的(de)(de)共(gong)表(biao)達(da)分子(zi)伴(ban)(ban)侶(lv)的(de)(de)質粒(li)和菌(jun)(jun)株(zhu)，例如takara公司chaperone?competent?cell?bl21系列。但(dan)是前期工(gong)作表(biao)明(ming)，使用(yong)商業化(hua)的(de)(de)伴(ban)(ban)侶(lv)蛋白共(gong)表(biao)達(da)技術并(bing)沒解(jie)決(jue)fast-petase在(zai)大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)(jun)容易聚焦沉(chen)淀形(xing)成包涵體(ti)的(de)(de)問題(ti)。由于(yu)大(da)阪(ban)伊德氏(shi)桿(gan)菌(jun)(jun)201-f6是一個新(xin)種菌(jun)(jun)株(zhu)，因此我們推測將來(lai)源于(yu)大(da)阪(ban)伊德氏(shi)桿(gan)菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)株(zhu)自身的(de)(de)同(tong)源分子(zi)伴(ban)(ban)侶(lv)元件(jian)與ispetase進(jin)行共(gong)表(biao)達(da)，利(li)用(yong)其(qi)(qi)相同(tong)來(lai)源的(de)(de)特性，幫助petase在(zai)大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)(jun)異源表(biao)達(da)過程中正確折疊，促(cu)進(jin)其(qi)(qi)可溶(rong)性表(biao)達(da)，即(ji)利(li)用(yong)同(tong)源分子(zi)伴(ban)(ban)侶(lv)策略促(cu)進(jin)異源蛋白質的(de)(de)可溶(rong)性表(biao)達(da)。

技術實現思路

1、為解決上述問題，本發明提(ti)供(gong)了五個(ge)同(tong)源伴侶元(yuan)件(jian)(jian)，所述的同(tong)源伴侶元(yuan)件(jian)(jian)包含(han):來源于大阪伊德(de)氏桿菌菌株的以(yi)下五個(ge)中任意一(yi)種(zhong)或多(duo)種(zhong)：分子(zi)(zi)(zi)伴侶元(yuan)件(jian)(jian)secb、分子(zi)(zi)(zi)伴侶元(yuan)件(jian)(jian)loia、分子(zi)(zi)(zi)伴侶元(yuan)件(jian)(jian)groes/el、分子(zi)(zi)(zi)伴侶元(yuan)件(jian)(jian)danj、分子(zi)(zi)(zi)伴侶元(yuan)件(jian)(jian)dnak中任意一(yi)種(zhong)或多(duo)種(zhong)。

2、一種(zhong)分子(zi)伴侶元件secb，其來源于大阪伊德氏桿(gan)菌(jun)菌(jun)株，核苷酸序列(lie)如seq?idno.1所(suo)示(shi)；氨基酸序列(lie)如seq?id?no.6所(suo)示(shi)；

3、一種分子伴侶元件loia，其來(lai)源于(yu)大阪伊德氏桿(gan)菌菌株，核苷酸序列如seq?idno.2所示；氨基酸序列如seq?id?no.7所示；

4、一(yi)種分子伴侶元件groes/el，其來源于大阪伊德(de)氏桿菌(jun)菌(jun)株，核(he)苷酸(suan)序列(lie)(lie)如seqid?no.3所示；氨(an)基酸(suan)序列(lie)(lie)如seq?id?no.8所示。

5、一種分子伴(ban)侶元件danj，其來(lai)源(yuan)于大阪伊(yi)德氏(shi)桿菌菌株，核苷酸序列如seq?idno.4所(suo)示；氨基酸序列如seq?id?no.9所(suo)示。

6、一種(zhong)分子(zi)伴侶(lv)元件dnak，其來源于大(da)阪(ban)伊德(de)氏桿(gan)菌菌株，核(he)苷酸序列如seq?idno.5所示，氨基酸序列如seq?id?no.10所示。

7、含(han)有上述(shu)任(ren)意(yi)一項所述(shu)的分子伴侶元件的表達載體(ti)。

8、所述分子(zi)伴侶元件的上游為啟動子(zi)、下游為目的蛋白基(ji)因。

9、所述啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)為arab啟(qi)動(dong)(dong)子(zi)(arabinose?promoter)。

10、所(suo)述的目的蛋(dan)白為來源于大阪伊德氏桿菌ideonella?sakaiensis?201-f6塑料降解酶petase或者(zhe)其突變體fast-petase。

11、一種(zhong)同源伴(ban)侶(lv)元件(jian)的核酸序列，所述(shu)同源伴(ban)侶(lv)元件(jian)包含

12、(a)secb核(he)(he)苷酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)(lie)如(ru)seq?id?no.1所示(shi)的(de)(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)分子(zi)；(b)loia核(he)(he)苷酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)(lie)如(ru)seqid?no.2所示(shi)的(de)(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)分子(zi)；(c)groes/el核(he)(he)苷酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)(lie)如(ru)seq?id?no.3所示(shi)的(de)(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)分子(zi)；(d)danj核(he)(he)苷酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)(lie)如(ru)seq?id?no.4所示(shi)的(de)(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)分子(zi)；(e)dnak核(he)(he)苷酸(suan)(suan)序(xu)列(lie)(lie)(lie)如(ru)seq?id?no.5所示(shi)的(de)(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)分子(zi)；

13、所(suo)述的(de)同源伴侶元件的(de)氨基酸序列如下(xia):

14、(a)secb氨(an)基酸(suan)序(xu)列(lie)如seq?id?no.6所示(shi)；(b)loia氨(an)基酸(suan)序(xu)列(lie)如seq?id?no.7所示(shi)；(c)groes/el氨(an)基酸(suan)序(xu)列(lie)如seq?id?no.8所示(shi)；(d)danj氨(an)基酸(suan)序(xu)列(lie)如seq?id?no.9所示(shi)；(e)dnak氨(an)基酸(suan)序(xu)列(lie)如seq?id?no.10所示(shi)；

15、一種(zhong)編碼(ma)目的(de)蛋白(bai)的(de)核(he)酸(suan)分(fen)子，所(suo)述(shu)的(de)目的(de)蛋白(bai)是(shi)一種(zhong)塑料降解酶(mei)蛋白(bai)，其來源是(shi)由(you)大阪伊德(de)氏桿菌(jun)ideonella?sakaiensis?201-f6的(de)petase，和通過機器(qi)學習計(ji)算所(suo)獲得高穩定(ding)性和催化活性的(de)突變體fast-petase。

16、本發明(ming)還提供了一種(zhong)工程質粒(li)，所述工程質粒(li)攜帶上述五種(zhong)同源伴侶(lv)元件(jian)中的一種(zhong)或多種(zhong)。

17、所述工程質粒包含(han)：

18、所述工程質(zhi)(zhi)粒是以傳統(tong)的(de)商業化分(fen)子伴侶質(zhi)(zhi)粒pgro7作為骨架進一(yi)步改造所得；

19、所述(shu)的(de)(de)工程質粒攜帶所述(shu)的(de)(de)同源伴(ban)侶(lv)元(yuan)件的(de)(de)核酸序列，以本發明(ming)同源伴(ban)侶(lv)元(yuan)件替換商業(ye)質粒pgro7的(de)(de)分(fen)子伴(ban)侶(lv)元(yuan)件所得，分(fen)別為(wei)：pg-issb、pg-isla、pg-ises/el、pg-isdj、pg-isdk。

20、在本發明的一(yi)種實施(shi)方式中，所述啟動子(zi)為arab啟動子(zi)(arabinose

21、promoter)。在本發明的一(yi)種實施方式中(zhong)，所述工程質(zhi)粒是(shi)以商業伴(ban)侶質(zhi)粒pgro7作(zuo)為骨架進一(yi)步(bu)改造所得。

22、本發明還提(ti)供了一(yi)種(zhong)(zhong)重組質粒，所(suo)述重組質粒攜帶所(suo)編碼的(de)目(mu)的(de)蛋(dan)白；所(suo)述的(de)目(mu)的(de)蛋(dan)白是一(yi)種(zhong)(zhong)塑料降(jiang)解(jie)酶蛋(dan)白，優選為(wei)來(lai)源于(yu)大(da)阪伊德氏(shi)桿(gan)菌ideonella?sakaiensis201-f6的(de)petase，和其突變體(ti)fast-petase。

23、在本發明的一種實施方式中，所(suo)述(shu)啟動(dong)子(zi)為t7啟動(dong)子(zi)(t7?promoter)。

24、在本發明的一種(zhong)實施方(fang)式中，所述(shu)重組(zu)質(zhi)粒(li)載體為(wei)pet29a(+)。

25、本發明還提供(gong)了一種宿(su)主細胞，所(suo)述(shu)(shu)(shu)宿(su)主細胞包(bao)含(han)(han)上(shang)述(shu)(shu)(shu)的(de)同源(yuan)伴侶元件；或(huo)者(zhe)，所(suo)述(shu)(shu)(shu)宿(su)主細胞包(bao)含(han)(han)上(shang)述(shu)(shu)(shu)的(de)目的(de)蛋白；或(huo)者(zhe)，所(suo)述(shu)(shu)(shu)宿(su)主細胞包(bao)含(han)(han)上(shang)述(shu)(shu)(shu)的(de)工(gong)程質粒(li)和重組質粒(li)。

26、在(zai)本發明的一種實施方式中(zhong)，所述(shu)宿主細胞(bao)為大腸桿菌bl21(de3)。

27、本發(fa)明(ming)還提供了上(shang)(shang)述同(tong)源伴侶元件或上(shang)(shang)述目的(de)蛋白或上(shang)(shang)述的(de)工程(cheng)質粒和重組(zu)質粒或上(shang)(shang)述的(de)宿主細胞在(zai)生產重組(zu)蛋白及(ji)高(gao)效(xiao)重組(zu)表達或在(zai)塑料(liao)降解上(shang)(shang)的(de)應用。

28、本發(fa)明還提供了一種生產(chan)目的(de)蛋白(bai)的(de)方(fang)法，所述(shu)方(fang)法包括(kuo):將上述(shu)宿主細胞接種至液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)(yang)基中37℃過夜培(pei)養(yang)(yang)種子液(ye)體(ti)，種子液(ye)體(ti)再接種至搖瓶進行放大(da)培(pei)養(yang)(yang)，37℃培(pei)養(yang)(yang)3-4個(ge)小(xiao)時(shi)，然后(hou)(hou)在od＝0.6-0.8時(shi)加入合適濃度的(de)誘導劑，18度誘導產(chan)酶24小(xiao)時(shi)；培(pei)養(yang)(yang)結束后(hou)(hou)，從培(pei)養(yang)(yang)液(ye)中分離純化得到目的(de)蛋白(bai)。

29、一種采用同源伴侶元件提高(gao)塑料降解酶可溶性表達的方(fang)法，包(bao)括(kuo)如下(xia)步驟：

30、1)、構建(jian)工(gong)程(cheng)質粒：將(jiang)同源(yuan)伴侶元(yuan)件(jian)的(de)dna分子與(yu)arab啟動(dong)子的(de)dna分子連接后(hou)，將(jiang)連接序列(lie)arab啟動(dong)子-同源(yuan)伴侶元(yuan)件(jian)與(yu)線性化(hua)質粒進行(xing)(xing)gibson組裝，得到(dao)gibson組裝產(chan)物；然后(hou)加入(ru)大腸(chang)桿菌化(hua)學感受態細胞(bao)，得到(dao)轉化(hua)產(chan)物，經孵育、搖動(dong)培養后(hou)抽提(ti)細菌克隆中(zhong)的(de)產(chan)物進行(xing)(xing)測(ce)序，測(ce)序正確(que)即得工(gong)程(cheng)質粒；

31、2)、構(gou)建重組質粒：將(jiang)目的(de)(de)蛋白序(xu)列與t7啟動子的(de)(de)dna分(fen)子連接后，將(jiang)連接序(xu)列t7啟動子-目的(de)(de)蛋白序(xu)列與線性化質粒進(jin)行gibson組裝，得(de)(de)到gibson組裝產(chan)物；然后加(jia)入感受(shou)態(tai)大腸桿菌化學感受(shou)態(tai)細胞，得(de)(de)到轉化產(chan)物；

32、3)、共(gong)(gong)表(biao)達分子伴(ban)(ban)侶(lv)(lv)(lv)和目的(de)(de)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)工程(cheng)菌(jun)的(de)(de)構建：將步驟1)共(gong)(gong)表(biao)達同源分子伴(ban)(ban)侶(lv)(lv)(lv)元件工程(cheng)質(zhi)粒加入步驟2)目的(de)(de)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)重組質(zhi)粒大腸桿菌(jun)感受態細胞中，得到共(gong)(gong)表(biao)達分子伴(ban)(ban)侶(lv)(lv)(lv)和目的(de)(de)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)工程(cheng)菌(jun)；

33、4)、共表達(da)分(fen)(fen)子(zi)伴侶(lv)(lv)fast-petase體(ti)系的(de)(de)重(zhong)組表達(da)：挑取(qu)共表達(da)分(fen)(fen)子(zi)伴侶(lv)(lv)和目的(de)(de)蛋(dan)白的(de)(de)工程(cheng)菌(jun)單菌(jun)落(luo)到lb液體(ti)培養(yang)(yang)基中(zhong)，37℃過夜培養(yang)(yang)；再(zai)以1％接種量(liang)轉接100ml含(han)卡那霉(mei)素(su)(su)和氯(lv)霉(mei)素(su)(su)的(de)(de)lb搖瓶液體(ti)培養(yang)(yang)基(ph為7.2)中(zhong)，37℃發(fa)酵培養(yang)(yang)3-4小時至od為0.6～0.8左右，加(jia)入合適濃度(du)的(de)(de)誘導劑，誘導產酶，純化得目的(de)(de)蛋(dan)白。

34、步驟1)中所(suo)述同源伴(ban)(ban)侶元(yuan)(yuan)(yuan)件(jian)來源于大阪(ban)伊德(de)氏桿菌菌株，為以下(xia)五個中任意一(yi)種(zhong)(zhong)或多種(zhong)(zhong)：分子伴(ban)(ban)侶元(yuan)(yuan)(yuan)件(jian)secb、分子伴(ban)(ban)侶元(yuan)(yuan)(yuan)件(jian)loia、分子伴(ban)(ban)侶元(yuan)(yuan)(yuan)件(jian)groes/el、分子伴(ban)(ban)侶元(yuan)(yuan)(yuan)件(jian)danj、分子伴(ban)(ban)侶元(yuan)(yuan)(yuan)件(jian)dnak中任意一(yi)種(zhong)(zhong)或多種(zhong)(zhong)。

35、步驟2)中所述(shu)目(mu)的(de)蛋白(bai)為來(lai)源于大阪伊德氏桿(gan)菌ideonella?sakaiensis?201-f6塑

36、料降解酶petase或者其突變體(ti)fast-petase。

37、有益效果：

38、本發明(ming)提(ti)供了(le)一系列(lie)(lie)同(tong)源分(fen)子伴侶元(yuan)(yuan)件(jian)，此(ci)分(fen)子伴侶元(yuan)(yuan)件(jian)包含五類，其(qi)核苷酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)分(fen)別(bie)為seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5，其(qi)對應(ying)的(de)(de)氨基酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)分(fen)別(bie)如seq?id?no.6、seq?id?no.7、seq?id?no.8、seq?id?no.9、seq?id?no.10所示。此(ci)同(tong)源分(fen)子伴侶元(yuan)(yuan)件(jian)能夠(gou)有效(xiao)提(ti)高(gao)pet塑料(liao)降(jiang)解酶fast-petase在大腸(chang)桿菌細(xi)胞中的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)水平，有助于(yu)異源表(biao)(biao)達(da)(da)過程中強疏水性(xing)目的(de)(de)蛋白的(de)(de)正確折疊，促進其(qi)可(ke)溶(rong)性(xing)表(biao)(biao)達(da)(da)，為解決塑料(liao)降(jiang)解酶的(de)(de)高(gao)效(xiao)重組(zu)表(biao)(biao)達(da)(da)與制(zhi)備提(ti)供新(xin)的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)策略，在表(biao)(biao)達(da)(da)生產強疏水性(xing)目的(de)(de)蛋白以及構建高(gao)效(xiao)pet降(jiang)解菌株中均具有潛在的(de)(de)應(ying)用前(qian)景。