本發(fa)明屬于生物，具體涉及一種基于多重(zhong)pcr技術聯合毛(mao)細管電泳(yong)鑒定病(bing)原微生物的(de)試劑盒。

背景技術：

1、呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)(respiratory?tract?infection，rti)是(shi)(shi)指病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)侵入(ru)人體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)鼻腔、咽喉、氣管(guan)(guan)(guan)和(he)支(zhi)氣管(guan)(guan)(guan)等部位并繁殖引起的(de)傳(chuan)(chuan)(chuan)染(ran)(ran)(ran)性(xing)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)，是(shi)(shi)人類最常見的(de)一(yi)類疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)，可(ke)發(fa)(fa)(fa)生在任何(he)性(xing)別、年(nian)齡和(he)地(di)域的(de)人群(qun)中，也是(shi)(shi)全球(qiu)范圍內(nei)導致發(fa)(fa)(fa)病(bing)(bing)(bing)(bing)和(he)死(si)亡(wang)的(de)主要原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)因之一(yi)。呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)的(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)種(zhong)(zhong)類繁多，包括細(xi)菌、病(bing)(bing)(bing)(bing)毒、真(zhen)菌、支(zhi)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)等，如流感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒、副流感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒、呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)合胞病(bing)(bing)(bing)(bing)毒、金黃色葡萄球(qiu)菌、肺(fei)炎(yan)(yan)(yan)鏈球(qiu)菌、鮑曼不(bu)動(dong)桿(gan)菌、肺(fei)炎(yan)(yan)(yan)伯克菌、白色念珠菌、煙曲霉菌、肺(fei)炎(yan)(yan)(yan)支(zhi)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)等。呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)的(de)臨床癥(zheng)狀和(he)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)征多為(wei)鼻炎(yan)(yan)(yan)、咽炎(yan)(yan)(yan)、喉炎(yan)(yan)(yan)、扁桃體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)炎(yan)(yan)(yan)等，嚴重者可(ke)發(fa)(fa)(fa)展為(wei)氣管(guan)(guan)(guan)炎(yan)(yan)(yan)、支(zhi)氣管(guan)(guan)(guan)炎(yan)(yan)(yan)或肺(fei)炎(yan)(yan)(yan)等，僅(jin)依靠(kao)臨床癥(zheng)狀難以鑒(jian)(jian)(jian)別不(bu)同(tong)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)引起的(de)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)，而(er)不(bu)同(tong)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)治療方法和(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)程也有(you)(you)所差異(yi)。因此，應用靈(ling)敏度和(he)特(te)異(yi)性(xing)高(gao)的(de)診(zhen)斷技(ji)術檢(jian)(jian)測(ce)(ce)呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)的(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，對(dui)于(yu)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)早期診(zhen)斷和(he)治療非常重要。然(ran)而(er)，傳(chuan)(chuan)(chuan)統的(de)分離培養和(he)血清學檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方法耗(hao)時(shi)復雜，檢(jian)(jian)測(ce)(ce)效率低，陽性(xing)率低。目前(qian)，qpcr技(ji)術在應對(dui)某(mou)種(zhong)(zhong)特(te)定(ding)傳(chuan)(chuan)(chuan)染(ran)(ran)(ran)性(xing)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)(如新冠病(bing)(bing)(bing)(bing)毒)的(de)核(he)酸(suan)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)中具有(you)(you)優(you)勢(shi)，但并不(bu)適合日常呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)的(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，因為(wei)多種(zhong)(zhong)未知(zhi)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)導致的(de)呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)，qpcr不(bu)僅(jin)費時(shi)費力，還容(rong)易漏(lou)診(zhen)。而(er)基于(yu)宏(hong)基因組(zu)二(er)代測(ce)(ce)序技(ji)術的(de)呼(hu)吸(xi)道(dao)(dao)感(gan)(gan)(gan)(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，雖然(ran)能(neng)檢(jian)(jian)出(chu)超過8000種(zhong)(zhong)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，包括未知(zhi)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)，但需要專業人員操(cao)作和(he)分析，成(cheng)本高(gao)，不(bu)利于(yu)普及。基于(yu)多重pcr技(ji)術的(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)核(he)酸(suan)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)是(shi)(shi)目前(qian)最具前(qian)景的(de)方法，它(ta)在同(tong)一(yi)管(guan)(guan)(guan)的(de)pcr反(fan)應體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)系中加入(ru)多對(dui)引物進行特(te)異(yi)擴增，通過擴增產(chan)物判別病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)核(he)酸(suan)的(de)存在與否，這種(zhong)(zhong)方法高(gao)效快(kuai)捷，能(neng)一(yi)次鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)多種(zhong)(zhong)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)體(ti)(ti)(ti)(ti)(ti)，如果利用某(mou)些方法對(dui)pcr產(chan)物進行自(zi)動(dong)化(hua)識別，那么檢(jian)(jian)測(ce)(ce)報告的(de)自(zi)動(dong)化(hua)流程也是(shi)(shi)可(ke)能(neng)的(de)，不(bu)僅(jin)提高(gao)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)效率，還大(da)大(da)節約(yue)成(cheng)本。因此，亟需開發(fa)(fa)(fa)一(yi)種(zhong)(zhong)新的(de)基于(yu)多重pcr技(ji)術聯合毛細(xi)管(guan)(guan)(guan)電(dian)泳(yong)鑒(jian)(jian)(jian)定(ding)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)微生物的(de)方法和(he)裝置。

技術實現思路

1、為(wei)了(le)克服現有技術(shu)(shu)(shu)中利用多重(zhong)pcr技術(shu)(shu)(shu)鑒(jian)定微生(sheng)物(wu)(wu)時(shi)，引物(wu)(wu)之(zhi)間(jian)容易形(xing)成引物(wu)(wu)二聚體、引物(wu)(wu)的(de)擴增效率(lv)低、容易擴增出非特(te)異產(chan)物(wu)(wu)以及產(chan)量(liang)不均一的(de)技術(shu)(shu)(shu)問(wen)題，本發明提(ti)供(gong)一種基于多重(zhong)pcr技術(shu)(shu)(shu)聯合毛(mao)細管電泳(yong)鑒(jian)定病原(yuan)微生(sheng)物(wu)(wu)的(de)試劑(ji)盒(he)，使用該試劑(ji)盒(he)進行多重(zhong)pcr技術(shu)(shu)(shu)聯合毛(mao)細管電泳(yong)鑒(jian)定病原(yuan)微生(sheng)物(wu)(wu)時(shi)，可(ke)在極低的(de)模板(ban)量(liang)下，提(ti)高多重(zhong)pcr的(de)效率(lv)，同時(shi)避免二聚體的(de)形(xing)成，并能提(ti)高檢測分辨率(lv)、準(zhun)確度和通量(liang)，實現檢測結果(guo)的(de)自(zi)動(dong)化識別和報(bao)告，簡(jian)化操(cao)作和節省時(shi)間(jian)。

2、本發明鑒定微(wei)生(sheng)物的步驟(zou)包(bao)含兩部分，整體實驗流程如圖1所示：

3、第(di)一部分(fen)為超多重(zhong)pcr擴增。該部分(fen)包括兩輪pcr，a輪pcr使(shi)用(yong)發(fa)(fa)夾(jia)引物(wu)和通(tong)用(yong)引物(wu)，發(fa)(fa)夾(jia)引物(wu)的(de)濃度低于通(tong)用(yong)引物(wu)，以(yi)富集目標(biao)序列。b輪pcr使(shi)用(yong)帶(dai)熒光標(biao)記的(de)特異(yi)引物(wu)，以(yi)擴增目標(biao)序列。

4、第二部分(fen)為(wei)毛細管電泳(yong)分(fen)析片段大小。使用abi?3500xl平(ping)臺(tai)對b輪pcr產物進(jin)行片段大小分(fen)析，以(yi)liz500作為(wei)內標，質(zhi)粒(li)片段作為(wei)陽(yang)性(xing)對照，通過自動化流程生(sheng)成檢測報告。

5、本(ben)發明通過以下技術(shu)方案解決上述技術(shu)問題。

6、本(ben)發明第一(yi)(yi)方面提供一(yi)(yi)種發夾(jia)引物(wu)對的組合，所述組合包含一(yi)(yi)種或多(duo)種發夾(jia)引物(wu)對，所述發夾(jia)引物(wu)對由一(yi)(yi)個正向發夾(jia)引物(wu)和一(yi)(yi)個反(fan)向發夾(jia)引物(wu)組成；

7、所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)發夾(jia)引物從5’到(dao)3’方向(xiang)包(bao)含正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)發夾(jia)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)和(he)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)特異(yi)性序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)；所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)發夾(jia)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)從5’到(dao)3’方向(xiang)依次包(bao)括正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)互補(bu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)、正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)連(lian)接序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)和(he)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)通(tong)用序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)；所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)通(tong)用序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)的(de)核苷酸(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)如seq?id?no:5所(suo)(suo)示(shi)；所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)互補(bu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)包(bao)含能夠(gou)與(yu)所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)(zheng)(zheng)向(xiang)通(tong)用序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)堿基互補(bu)配對的(de)核苷酸(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)；和(he)/或(huo)，

8、所(suo)述(shu)反向(xiang)(xiang)(xiang)發夾(jia)引物從(cong)5’到3’方向(xiang)(xiang)(xiang)包含反向(xiang)(xiang)(xiang)發夾(jia)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)和反向(xiang)(xiang)(xiang)特異性序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)；所(suo)述(shu)反向(xiang)(xiang)(xiang)發夾(jia)序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)從(cong)5’到3’方向(xiang)(xiang)(xiang)依次(ci)包括(kuo)反向(xiang)(xiang)(xiang)互補序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)、反向(xiang)(xiang)(xiang)連接序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)和反向(xiang)(xiang)(xiang)通用序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)；所(suo)述(shu)反向(xiang)(xiang)(xiang)通用序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)的核苷(gan)酸序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)如seq?id?no:7所(suo)示；所(suo)述(shu)反向(xiang)(xiang)(xiang)互補序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)包含能夠與所(suo)述(shu)反向(xiang)(xiang)(xiang)通用序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)堿基互補配對(dui)的核苷(gan)酸序(xu)(xu)(xu)(xu)列(lie)(lie)(lie)。

9、本發明一些實(shi)施(shi)方(fang)案中，所(suo)(suo)述正向(xiang)(xiang)發夾序(xu)(xu)(xu)列(lie)中，所(suo)(suo)述正向(xiang)(xiang)連接序(xu)(xu)(xu)列(lie)的核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)為：aggca；和(he)/或，所(suo)(suo)述正向(xiang)(xiang)互補(bu)序(xu)(xu)(xu)列(lie)包含如seq?id?no:6所(suo)(suo)示(shi)的核苷(gan)酸(suan)序(xu)(xu)(xu)列(lie)；和(he)/或，

10、所(suo)述(shu)反(fan)向發夾序列(lie)中(zhong)，所(suo)述(shu)反(fan)向連接序列(lie)的核苷酸(suan)序列(lie)為(wei)：caggc；和(he)/或，所(suo)述(shu)反(fan)向互補序列(lie)包含如(ru)seq?id?no:8所(suo)示的核苷酸(suan)序列(lie)。

11、本發(fa)明一些具體(ti)的實施(shi)方案中(zhong)，所述正(zheng)向發(fa)夾序列(lie)包含如(ru)seq?id?no:1所示(shi)的核(he)苷(gan)酸序列(lie)，和/或，所述反向發(fa)夾序列(lie)包含如(ru)seq?id?no:2所示(shi)的核(he)苷(gan)酸序列(lie)。

12、本發明一(yi)些(xie)實(shi)施方案(an)中，所述正向特異性序列(lie)包含以下任(ren)一(yi)核(he)苷酸(suan)序列(lie)：

13、

14、

15、；和/或，

16、所述反向(xiang)特(te)異性(xing)序列(lie)包含以下(xia)任(ren)一核苷酸序列(lie)：

17、

18、

19、本發明(ming)一些較(jiao)佳(jia)的實施方案中，所(suo)述組合(he)包含以下一種或多種發夾引物對：

20、

21、

22、本發明一些更佳的實施方案中，所(suo)述組合包含以下發夾引物對：

23、

24、本發明第二方面(mian)提供一(yi)種(zhong)引物(wu)(wu)(wu)對(dui)組(zu)合，所(suo)述引物(wu)(wu)(wu)對(dui)組(zu)合包括(kuo)一(yi)種(zhong)或多種(zhong)引物(wu)(wu)(wu)對(dui)，所(suo)述引物(wu)(wu)(wu)對(dui)包括(kuo)一(yi)條(tiao)正向引物(wu)(wu)(wu)和一(yi)條(tiao)反(fan)向引物(wu)(wu)(wu)，其中所(suo)述正向引物(wu)(wu)(wu)包含以下任一(yi)核苷酸(suan)序列：

25、 ncbi?gene?id 正向引物在ncbi?gene?id對應(ying)的(de)(de)序列的(de)(de)起始和終(zhong)止位點 nz_cp010546.1 nc_014147.1 nc_039199.1 7512-7533 nw_017264775.1 nc_054695.1 41672-41692 nc_007199.1 3 nw_003020038.1 11290-11309 nc_007605.1 78711-78730 nc_001617.1 308-327 nz_uyip01000001.1  nc_016845.1 nc_002516.2 1 nz_cp015121.1 1 nc_001803.1 3308-3327 nc_020207.1 1 nc_006273.2 70529-70548 nc_045512.2 19273-19291 nw_023503284.1 nc_032090.1 1 kp144330.1 12820-12839 nz_cp059690.1 21692-21711 nz_cp059690.1 2 ln867867.1 1905-1924 nc_002207.1 951-970 nz_cp035288.1 nz_ls483377.1  2 nc_007795.1 1 nz_cp009610.1 nc_001796.2 8166-8187 u77665.1:rnasep 28-49 nm_004048.4:b2m 413-432 / seq?id?no:9

26、；和/或，

27、所述反向引物包(bao)含以下任一核苷酸序列(lie)：

28、

29、

30、本發明一些實(shi)施方案(an)中，所述(shu)引物(wu)對(dui)組合包(bao)含(han)以下一種(zhong)或多(duo)種(zhong)引物(wu)對(dui)：

31、

32、

33、本(ben)發明一些(xie)較佳的實施方案(an)中，所述(shu)引(yin)物對組合包含以下引(yin)物對：

34、

35、本發(fa)明一些具體實(shi)施方案中，所(suo)述引物對(dui)組合(he)還(huan)包括以下一對(dui)或多對(dui)引物對(dui)：

36、

37、

38、本發(fa)明一些實施方案(an)中(zhong)，所(suo)述正向(xiang)引物和/或(huo)所(suo)述反向(xiang)引物還(huan)包含熒光(guang)標記。

39、本發明一些(xie)較佳的(de)實施方案中，所(suo)述(shu)熒光(guang)標記位于(yu)所(suo)述(shu)正向引物的(de)5’末端和/或所(suo)述(shu)熒光(guang)標記選自fam、hex和rox中的(de)一種(zhong)或多種(zhong)。

40、本發明(ming)一(yi)些(xie)較佳的實施方(fang)案中(zhong)，所述引物(wu)對組(zu)合(he)中(zhong)的正向引物(wu)選自(zi)以(yi)下任一(yi)條或(huo)多條核苷酸序(xu)列：

41、

42、本發明(ming)一些更佳的實施方案中，所述(shu)引(yin)物(wu)對組合包(bao)含以下正(zheng)向引(yin)物(wu)：

43、

44、本發(fa)明一些進一步更(geng)佳的實施方案中，所述引物(wu)(wu)對(dui)組(zu)合還包含以下一條(tiao)或多(duo)條(tiao)正向引物(wu)(wu)：

45、

46、本(ben)發明(ming)一些具體的(de)實施方(fang)案中，所述引(yin)物對(dui)組合(he)包(bao)含以(yi)下引(yin)物對(dui)：

47、

48、

49、本發明一些(xie)優選的實施方案中，所述引(yin)(yin)物對(dui)組合(he)還包含以下一種(zhong)(zhong)或多種(zhong)(zhong)引(yin)(yin)物對(dui)：

50、

51、在本發明(ming)中(zhong)(zhong)(zhong)，可通過美國國家生物(wu)技術信息(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)心ncbi(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索到本發明(ming)表格(ge)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)ncbi?gene?id所對應的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)組或基(ji)因(yin)序列，本領域技術人員知(zhi)曉如(ru)(ru)何根(gen)據(ju)特定的(de)(de)(de)ncbi?gene?id以及已知(zhi)的(de)(de)(de)“起始位(wei)(wei)點(dian)”到“終止位(wei)(wei)點(dian)”的(de)(de)(de)獲得一(yi)段具體的(de)(de)(de)核(he)苷酸(suan)序列。例如(ru)(ru)：根(gen)據(ju)ncbi?gene?id為nz_cp010546.1、“正向特異性序列在ncbi?gene?id對應的(de)(de)(de)序列的(de)(de)(de)起始和終止位(wei)(wei)點(dian)為”的(de)(de)(de)信息(xi)，本領域技術人員能夠在ncbi上檢索“nz_cp010546.1”，并獲得其全長序列中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)第位(wei)(wei)核(he)苷酸(suan)的(de)(de)(de)具體序列。

52、本發(fa)明第三方(fang)(fang)面提供一種試(shi)劑盒(he)，所(suo)述試(shi)劑盒(he)包含如(ru)第一方(fang)(fang)面所(suo)述的(de)組合(he)。

53、本發明一些(xie)實施方(fang)案中，所(suo)(suo)述(shu)試劑(ji)盒還(huan)包(bao)含(han)正(zheng)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)引物和/或反(fan)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)引物；所(suo)(suo)述(shu)正(zheng)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)引物包(bao)含(han)能(neng)夠與所(suo)(suo)述(shu)正(zheng)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)序(xu)列堿基互補配對(dui)的(de)序(xu)列；所(suo)(suo)述(shu)反(fan)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)引物包(bao)含(han)能(neng)夠與所(suo)(suo)述(shu)反(fan)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)序(xu)列堿基互補配對(dui)的(de)序(xu)列；所(suo)(suo)述(shu)正(zheng)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)引物的(de)核(he)苷酸序(xu)列優選如seq?id?no:3所(suo)(suo)示，所(suo)(suo)述(shu)反(fan)向通(tong)(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)(yong)引物的(de)核(he)苷酸序(xu)列優選如seq?id?no:4所(suo)(suo)示。

54、本發明一些較(jiao)佳(jia)的實施方案中，所(suo)述(shu)試劑盒還包括用于再(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)的引物(wu)組(zu)合(he)(he)，所(suo)述(shu)用于再(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)的引物(wu)組(zu)合(he)(he)能夠以如第一方面所(suo)述(shu)的組(zu)合(he)(he)擴(kuo)(kuo)增(zeng)獲(huo)得的產物(wu)為(wei)模板進行(xing)再(zai)擴(kuo)(kuo)增(zeng)；

55、本發明一些更佳的實施(shi)方案(an)中，所述用(yong)于再擴增的引物(wu)組(zu)合為如(ru)第二(er)方面所述的引物(wu)對(dui)組(zu)合。

56、本(ben)發明(ming)第(di)四方(fang)面提供一種鑒定微(wei)生物(wu)的(de)方(fang)法(fa)，所述(shu)方(fang)法(fa)包括：

57、(1)使用(yong)(yong)(yong)如(ru)第一方面(mian)(mian)所(suo)(suo)述(shu)(shu)的組合或(huo)如(ru)第三方面(mian)(mian)所(suo)(suo)述(shu)(shu)的試劑盒，并使用(yong)(yong)(yong)正(zheng)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)引(yin)物和/或(huo)反(fan)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)引(yin)物，擴(kuo)增(zeng)待測樣(yang)本中的核酸(suan)獲得擴(kuo)增(zeng)產物；所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)引(yin)物包含能(neng)夠與(yu)所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)序(xu)(xu)列(lie)堿基互補(bu)配對(dui)的序(xu)(xu)列(lie)；所(suo)(suo)述(shu)(shu)反(fan)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)引(yin)物包含能(neng)夠與(yu)所(suo)(suo)述(shu)(shu)反(fan)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)序(xu)(xu)列(lie)堿基互補(bu)配對(dui)的序(xu)(xu)列(lie)；所(suo)(suo)述(shu)(shu)正(zheng)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)引(yin)物的核苷酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)優選如(ru)seq?id?no:3所(suo)(suo)示，所(suo)(suo)述(shu)(shu)反(fan)向(xiang)通(tong)(tong)用(yong)(yong)(yong)引(yin)物的核苷酸(suan)序(xu)(xu)列(lie)優選如(ru)seq?id?no:4所(suo)(suo)示；

58、(2)對步驟(1)得(de)到的擴增產物進行鑒定，分析待測(ce)樣(yang)本中微生(sheng)物的種(zhong)類(lei)。

59、本發明一些實施方(fang)案(an)中(zhong)，所(suo)述方(fang)法為非診斷和/或治(zhi)療目的的；和/或，所(suo)述微(wei)(wei)生(sheng)物為病原微(wei)(wei)生(sheng)物。

60、本(ben)發(fa)明一些實施方案(an)中(zhong)，在步驟(1)所述(shu)擴增的(de)擴增體系中(zhong)，所述(shu)正向(xiang)發(fa)夾引(yin)物(wu)和/或反向(xiang)發(fa)夾引(yin)物(wu)與所述(shu)正向(xiang)通用引(yin)物(wu)和/或反向(xiang)通用引(yin)物(wu)的(de)濃度比為(wei)1:80-1:125，例如為(wei)1:80、1:82、1:85、1:90、1:100、1:110、1:120和1:125。

61、本發明一些較(jiao)佳的(de)實施方案中，所述正向發夾引物和(he)/或反向發夾引物的(de)濃度為(wei)0.05-0.11μm，例如為(wei)0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm和(he)0.11μm；

62、和(he)/或(huo)，所述(shu)正(zheng)向(xiang)通用引物(wu)和(he)/或(huo)反向(xiang)通用引物(wu)的濃(nong)度為(wei)5-20μm，例如為(wei)5、10、15和(he)20μm。

63、本發明(ming)一些實施方案中(zhong)，步驟(2)中(zhong)所述的(de)鑒定使(shi)用的(de)方法為毛細管電泳、高通量測序(xu)或納(na)米孔測序(xu)技術。

64、本發(fa)明一些較佳的實施方案中，所述(shu)步(bu)驟(2)包括將步(bu)驟(1)所獲得的擴增產物進(jin)(jin)一步(bu)擴增、并(bing)對進(jin)(jin)一步(bu)擴增的產物進(jin)(jin)行(xing)毛細管(guan)電泳分析(xi)；所述(shu)進(jin)(jin)一步(bu)擴增優選使用如第二方面所述(shu)的引物對組合。

65、本發明一些更佳的實(shi)施方(fang)案中，進一步擴增的反(fan)應體系中所(suo)述(shu)正向(xiang)引物的濃度為0.1～0.5μm；和(he)/或，所(suo)述(shu)反(fan)向(xiang)引物的濃度為0.1～0.5μm。

66、本發明第五(wu)方(fang)面提供一(yi)種(zhong)如第一(yi)方(fang)面所述的組合(he)、如第二方(fang)面所述的引物對組合(he)、和/或(huo)如第三(san)方(fang)面所述的試劑盒(he)在鑒定微生(sheng)物中的應用。

67、本發(fa)明一些實(shi)施(shi)方案(an)中(zhong)，所述應用為(wei)非診(zhen)斷和/或(huo)治(zhi)療目的(de)的(de)；和/或(huo)，所述微(wei)生(sheng)物為(wei)病(bing)原微(wei)生(sheng)物。

68、在(zai)本發明中(zhong)，所述“非診斷和/或(huo)(huo)治療(liao)目(mu)的(de)”的(de)應用場景包(bao)括(kuo)但不限于(yu)在(zai)實驗(yan)室中(zhong)出于(yu)科研目(mu)的(de)鑒定實驗(yan)待(dai)測樣本中(zhong)包(bao)含哪些(xie)微生物。所述“待(dai)測樣本”可以來自人(ren)體(ti)(ti)或(huo)(huo)其(qi)他動物體(ti)(ti)，也(ye)可以來自非生物體(ti)(ti)的(de)表面或(huo)(huo)內部(bu)，例如固(gu)體(ti)(ti)(如醫療(liao)器械)的(de)表面或(huo)(huo)內部(bu)，或(huo)(huo)液(ye)體(ti)(ti)(如待(dai)測水源)等。

69、在符合本(ben)領域常(chang)識的基礎上，上述各優選條件，可任意組(zu)合，即得本(ben)發明各較佳實例。

70、本發明所(suo)用試劑(ji)和原料均市售可得(de)。

71、本發明(ming)的積(ji)極進步效(xiao)果(guo)在于：

72、本發明通過設計具有(you)特殊結(jie)構的(de)(de)發夾引物和(he)優化(hua)的(de)(de)擴增體系，可在極低的(de)(de)模板量下，提高多(duo)重(zhong)(zhong)pcr的(de)(de)效率，同時(shi)避免二聚(ju)體的(de)(de)形(xing)成。本發明提供的(de)(de)試(shi)劑盒(he)用于基于多(duo)重(zhong)(zhong)pcr技術聯合毛細管電(dian)泳(yong)進(jin)行(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)微生物的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)時(shi)，包含了多(duo)重(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)范圍，可同時(shi)針對細菌、真菌和(he)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒共計28種呼吸道病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)微生物進(jin)行(xing)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)。基于多(duo)重(zhong)(zhong)pcr技術聯合毛細管電(dian)泳(yong)較病(bing)(bing)(bing)(bing)原(yuan)體多(duo)聯檢(jian)(jian)(jian)試(shi)劑盒(he)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)有(you)更好(hao)的(de)(de)分辨率、準確(que)度和(he)通量，并能(neng)實(shi)現檢(jian)(jian)(jian)測(ce)結(jie)果(guo)的(de)(de)自動化(hua)識別(bie)和(he)報(bao)告，簡化(hua)操作和(he)節省時(shi)間。